gateway重组技术
Gateway
LR反应
第二步：表达克隆载体的构建（LR反应）
• 混合包含目的基因的入门克隆和合适的目 的载体以及Gateway LR Clonase酶，构建表 达载体。目的载体必须含有attR同源序列， 可与含有attL的入门载体进行定点同源重组。
为什么要构建入门载体？
• Entry Clone是作为基因的一个来源克隆以便 较容易地亚克隆到任意目标载体。 • 同时，一旦Entry Clone是测序有效的，就 不需要对多个表达载体进行测序。 • 另外，attB序列相对较小（25bp），这使得 它们更适合加到PCR引物中去（需要在5'端 附加4个G以便进行有效重组）。
用pANIC 7A构建的表达载体，通过基因枪技术导入小麦和柳枝稷中， 观察pporRFP红色荧光蛋白基因的表达。红色荧光蛋白自发荧光率较低 而且红光穿透力更强，最高吸收峰为583nm。
实例二[1]
• 为方便基于植物瞬时表达技术的高通量功 能基因筛选，利用G技术入门载体pDONR222的经过酶 切后连接到植物表达载体pCAMBIA0380的 多克隆位点上，构建Gateway技术兼容的 p1104D植物表达载体。
谢谢听P—λ噬菌 体同源重组 位点 attB—E.coli 染色体上的 同源重组位 点
修饰后的位点信息
Gateway技术只需要两步反应就可完成表 达载体的构建。 反应 反应位点 反应产物 产物结构 BP反应 attB×attP 入门克隆载体 attL1-基因-attL2
LR反应 attL×attR 表达克隆载体 attB1-基因-attB2
第一步：入门载体的构建
有四种方法: A. 限制性内切酶消化目的基因后酶连进入 入门载体 B. PCR克隆，以含attB的特异引物合成目的 基因资源
Gateway克隆技术,简单易操作
Gateway克隆技术，简单易操作在过去数十年，用限制性内切酶产生黏性末端，在DNA连接酶的作用下，连接两个甚至更多片段的克隆方法，是载体构建的经典方案。
但是现如今我们再提到克隆的时候，远远不再只有传统的限制酶克隆一种选择。
其中Gateway克隆技术作为一种可以快速、高效将DNA 序列转移到载体上的克隆方法已经流行开来。
不要觉得Gateway克隆技术高深莫测，其实了解一下你就能懂。
Gateway克隆方法是λ噬菌体感染细菌时发生的整合和切割重组反应的体外形式。
在体内，噬菌体（attP）和细菌（attB）的附着位点发生重组反应，噬菌体整合到细菌基因组中，两侧为两个新的重组位点（attL-left-和attR-right-）。
在某些条件下，attL和attR位点可以重组，导致噬菌体从细菌染色体上切除并重新生成attP和attB位点。
即Gateway技术依赖于下面描述的两个反应：BP反应和LR反应，通过BP反应获得入门克隆(有时候我们也说中间克隆)，再通过LR反应将目的DNA以正确的方向连接到各种目的载体上，形成不同的表达载体。
GeneCopoeia的EZShuttle™重组克隆体系应用E.coli 和λ噬菌体特异位点的重组酶促体系使DNA片段在载体间相互转换，其原理与Gateway 克隆技术相同。
BP反应-构建入门载体：通过PCR将attB位点添加到目的DAN序列两侧，形成attB-PCR产物。
用attB-PCR产物或者含attB位点的供体质粒和含attP位点的质粒发生重组生成入门克隆。
EZRecombinase BP混合物，货号：RCBM-1002-020LR反应-构建表达载体：制作表达载体时，选择适合的目标载体非常重要。
这种选择取决于许多因素，如宿主类型，所需的表达水平和实验目的。
选定的attR表达载体与attL-入门载体重组以产生表达载体。
EZRecombinase LR混合液，货号：RCBM-1001-020。
gateway重组技术
Gateway 基因克隆Gateway 基因克隆就是由Invitrogen公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。
该技术利用专有的重组序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中,可应用于大片段的基因克隆,并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。
这一技术在插入的目的DNA片段两端整合att L1与att L2两个侧端重组序列,来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”(Gateway Entry Clone)。
据Invitrogen宣称Gateway 技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应,如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法,避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性,大大提高了克隆效率,常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体,因此又称之为高通量基因克隆技术(Gateway Cloning Technology)。
一、Gateway 基因克隆的原理及机制Gateway被视为一种克隆操作平台:把目的基因克隆到入门载体(Entry Vector)后,就不用依赖限制性内切酶,而靠载体上存在的特定重组位点与重组酶,高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体(Destination Vector,目的载体)上。
Gateway的原理就是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。
在噬菌体与细菌的整合因子(INF、Int)的作用下,lambda的attP位点与大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组,lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中,两侧产生两个新位点:attL与attR。
这就是一个可逆的过程,如果在一个噬菌体编码蛋白Xis与IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB与attP位点,噬菌体从细菌基因组上裂解下来(见图1)。
这一过程的方向就是受控于两个重要因素:存在的介导蛋白与重组位点。
Gateway 克隆技术背景原理及其应用
If the normal attB site is deleted from the chromosome, integrase can bind with lower affinity to secondary sites on thechromosome, resulting in integration of lambda at a different site. The frequency of integration into secondary sites is 100-1000 times rarer than integration into attB. The actual crossover occurs between homologous 15 bp core regions on the two sites, but surrounding sequences are required as they contain the binding sites for the recombination proteins (Landy, 1989).
Modifications to the att Sites
Mutations have been made to the core regions of the att sites to eliminate stop codons and to ensure specificity of the recombination reactions to maintain orientation and reading frame. Mutations have been introduced into the short (5 bp) regions flanking the 15-bp core regions of the attB sites to minimize secondary structure formation in single-stranded forms of attB plasmids (e.g. phagemid ssDNA or mRNA). A 43 bp portion of the attR site has been removed to make the in vitro attL x attR reaction irreversible and more efficient (Bushman et al., 1985).
gateway技术
Gateway技术提供以下可能：通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间同时将您的基因转移到多个表达系统在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达一、一种更好的克隆方法Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。
这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。
当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。
Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。
图1 Gateway技术的灵活性Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。
Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。
一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。
此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆测序担心。
在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。
二、一项强大而可靠的技术Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。
一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。
Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。
BP和LR两个反应就构成了Gateway技术（表1和图2）。
BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。
LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。
LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。
关于TOPO和GATEWAY
Gateway®克隆的强大性和灵活性
在目的基因（go或者开放阅读框(ORF)克隆进Gateway®入门载体后，可以很容易将它转移到任何目的载体，创建各种各种各样的表达克隆。当每一个基因具有进行Gateway®重组的att序列时它们就可能在载体间穿梭。
Gateway技术原理
Gateway克隆技术是利用λ噬菌体与大肠杆菌的染色体之间发生的λ嗜菌体位点特异重组系统的重组整合与切出反应（attB x attP →attL x attR）BP和LR两个反应构成的（表2和图4）。BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。
6）用10-50μl，涂于平板上，正放5min后，37摄氏度倒置培养过夜
7）直接进行PCR检测，或挑取菌落在50μl含有50μg/ml氨苄或25μg/ml Zeocin™的LB培养基（置于200μl微量离心管中）培养4h
或者：
Fresh PCR product1.33 µl(from Step 1)
Salt Solution0.33µl(in kit（试剂盒）in-20°Cfreezer)
TOPO Vector（载体）0.33 µl(in kit（试剂盒）in-20°Cfreezer)
FINAL VOLUME2.00µl
1)连接：按上表进行配制溶液后，轻轻混匀，室温静置5min
2）转化：将试管置于冰盒中进行冰浴5-30min
（图2）
TOPO克隆高效性原理
Topo连接反应有两个分子参与，而传统的连接反应有三个分子参与，其热力学上的优势导致5分钟的快速连接。
Gateway
Gateway也可以被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。
Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。
在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。
这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。
这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
在Gateway系统中,入门载体包含两个重组位点序列attL1和attL2，大小均为100bp，中间夹着一个自杀基因——ccdB基因。
由于ccdB基因的表达产物能抑制普通的E.coli生长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化时不能生长。
在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因，接入目的基因。
ccdB基因两端可以选择的酶切位点有限（2个），同时还必须考虑读码框架、启动子、终止密码等问题，因此Gateway系统提供了5种不同的入门载体以供选择。
需要特别注意的是转化用的菌株必须是不含F附加体的，因为它表达的一种产物能阻断ccdB基因，影响筛选结果。
同样，目的载体（Destination Vector）也必须和Gateway系统配套，即目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点attR1和attR2，大小均为125bp，同样也夹着一个ccdB自杀基因。
当需要将目的基因从入门载体（Entry Vector）转移到目的载体（Destination Vector）时，只要将两种质粒混合（线性化能有效提高重组率），加入含有Int、IHF、Xis等重组因子的LR重组酶混合物，attR2序列和attL2序列发生重组，生成一个融合质粒。
gateway lr反应序列转化
gateway lr反应序列转化
首先，LR反应是一种用于将RNA转录本转化为DNA的反应。
在这个过程中，首先利用逆转录酶将RNA转录本转化为cDNA，然后使用DNA聚合酶进行扩增，得到相应的DNA序列。
这个步骤是将RNA 序列转化为DNA序列的关键步骤。
其次，Gateway技术是一种用于DNA片段克隆和重组的技术。
在这个过程中，首先需要将目标DNA序列插入到Gateway载体中的Entry vector，然后利用LR反应将其转化为Destination vector 中的目的DNA序列。
这个过程涉及到LR Clonase酶的使用，它能够催化DNA片段的重组，实现目的DNA序列的转化。
从实验操作的角度来看，进行“gateway lr反应序列转化”通常需要进行一系列的实验操作，包括RNA提取、逆转录、LR反应、Gateway克隆等步骤。
在每个步骤中都需要严格控制实验条件和操作技巧，以确保实验的成功进行。
从应用角度来看，利用“gateway lr反应序列转化”可以实现对RNA序列的快速、高效转化，为后续的功能研究和基因工程应用提供了重要的技术支持。
这个技术在基因表达分析、功能基因组学
研究等领域具有广泛的应用前景。
综上所述，“gateway lr反应序列转化”涉及到LR反应和Gateway技术的结合应用，是一种将RNA序列转化为DNA序列的重要实验技术。
通过严谨的实验操作和技术应用，可以实现对RNA序列的高效转化和后续的功能研究。
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河南农业大学牧医工程学院
Gateway 基因克隆
Gateway 基因克隆是由Invitrogen公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。
该技术利用专有的重组序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。
这一技术在插入的目的DNA片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（Gateway Entry Clone）。
据Invitrogen宣称Gateway技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高通量基因克隆技术（Gateway Cloning Technology）。
一、Gateway 基因克隆的原理及机制
Gateway被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。
Gateway的原理是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。
在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。
这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来（见图1）。
这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
1
图1、噬菌体位点专一性重组的机制
在Gateway系统中,入门载体包含两个重组位点序列attL1和attL2，大小均为100bp，中间夹着一个自杀基因——ccdB基因。
由于ccdB基因的表达产物能抑制普通的E.coli生长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化时不能生长。
在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因，接入目的基因。
ccdB基因两端可以选择的酶切位点有限（2个），同时还必须考虑读码框架、启动子、终止密码等问题，因此Gateway系统提供了5种不同的入门载体以供选择。
需要特别注意的是转化用的菌株必须是不含F附加体的，因为它表达的一种产物能阻断ccdB基因，影响筛选结果。
同样，目的载体（Destination Vector）也必须和Gateway系统配套，即目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点attR1和attR2，大小均为125bp，同样也夹着一个ccdB 自杀基因。
当需要将目的基因从入门载体（Entry Vector）转移到目的载体（Destination Vector）时，只要将两种质粒混合（线性化能有效提高重组率），加入含有Int、IHF、Xis等重组因子的LR重组酶混合物，attR2序列和attL2序列发生重组，生成一个融合质粒。
attL1序列再和attR1序列重组，融合质粒分解为两个新的质粒，目的基因与原来位于目的载体上的自杀基因发生重组置换，得到一个带目的基因的目的载体（生成新的重组位点attB1、B2）和带自杀基因的入门载体（生成新的重组位点attP1、P2，见图2）。
由于带自杀基因的载体不能生长，加上抗生素筛选，转化产物重组率高达90%以上。
图2、gateway机制
由于在这个反应中attL1序列只和attR1序列重组，attL2序列只能与attR2序列重组，这个方向的反应称为LR反应。
LR反应生成新的位点称为attP1/2（200bp）和attB1/2（25bp）序列。
在一定的条件下，attP和attB序列也能发生重组，生成attL和attR序列，这个反向反应称为BP反应（见图3）[1]。
图3、BP反应及LR反应
当用户得到一个含目的基因的Gateway表达载体，希望将目的基因转移到另外几个Gateway表达载体中时，只要先将目的基因从Gateway表达载体中转移到入门载体上，在由入门载体转移到其它的表达载体就行。
将含目的基因的Gateway表达载体（attB1—目的基因—attB2序列）与带有attP1-ccdB(自杀基因)-attP2序列的供体载体（pDONR，注意这个载体不同于入门载体Entry Vector）混合，加入含有Int、IHF的BP重组酶混合物，attP 和attB序列也能发生重组，生成带有目的基因的入门载体（Entry Vector）和带自杀基因的表达载体。
同样，由于抗性不同以及自杀基因的作用，只有含目的基因的入门载体能被筛选出来。
这即是BP反应。
需要特别注意的是表达载体如果也是卡那霉素抗性，就必须选择另外一个供体质粒以便筛选。
二、Gateway 基因克隆优点
Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图4）。
这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。
当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。
Gateway 也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。
图4 Gateway技术的灵活性
Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。
一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移的目的基因到Gateway 改造过的各种表达载体（目的载体）。
此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而，不必再为新的表达克隆测序担心。
在使用每一种新的表达系统时，将会节省更多的时间。
三、Gateway在构建cDNA入门文库和表达文库方面的应用
2006年，中国科学院张宁，以激活蛋白产生菌一交链孢菌为材料，用基于入噬菌体特异位点重组反应构建定向cDNA文库的Gateway技术，首次成功构建了交链孢菌cDNA入门文库和表达文库。
构建的cDNA入门文库经检测，入门文库的滴度达到6X108 文库总容量为5.6X107，其阳性克性率为100%,平均插入片段大小大约为1.53Kb。
通过LR重组把入门文库转换为表达文库。
表达文库的滴度为1.53X 106，文库总容量为6.2 X 106，其阳性克性率为100%，平均插入片段大小大约为1.62Kb。
快速、高效的构建了高质量的cDNA 入门文库和表达文库，为从分子水平进一步研究蛋白激发子提供了基础。
通过大规模的免疫筛选文库获得激活蛋白全长编码基因，并进行表达与纯化，为进一步研究激活蛋白与植物受体的相互作用机理及信号途径奠定了基础[2]。
四、Gateway在植物双分子荧光互补（BiFc）系统上的应用
2013年，周洁等充分利用Gateway技术高效快捷的优势，构建了一套基于Gateway 的BiFC分析载体系统。
该系统和常规的系统一致，采用融合黄色荧光蛋白(yellow fluorecent protein , YFP)片段的方法进行互作分析。
其中的YFP片段被分为N端YFP ( N-terminal YFP nYFP)片段和C端YFP ( C-terminal YFP, cYFP)片段。
该系统包括用于目的基因N端融合的nYFP载体和cYFP载体，及目的基因C端融合的nYFP和cYFP共4个载体。
同时，还构建了带氨节青霉素(Ampicillin , Amp)抗性的入门载体，用于入门克隆。
该入门载体可由实验室自行酶切制备，并且采用TA克隆的方法进行入门载体的构建，从而大大降低了创制入门克隆的成本。
此外，该入门载体带有ccdB自杀基因，常规分子生物学实验室的制备手段就能保证非常低的背景克隆。
总体而言，其构建的BiFC载体系统，操作简单且成本低，能够快速构建互作分析用的BiFC载体，高效的进行基因互作研究[3]。
参考文献：
[1] 李明，丁博，牛有雄，等. 小麦TaWRKY46-1基因克隆及建立在Gateway技术上的可诱导表达载体的构建[J]，华北农学报, 2011,26(2)
[2] 张宁. 交链孢菌cDNA文库构建及激活蛋白基因克隆与融合表达[D].中国农业科学院. 2006
[3] 周洁，王栩鸣，陈斌，等. 基于Gateway技术的低成本植物双分子荧光互补分析系统[J].浙江农业学报，2013,25(5); 1024-1030.。