基于Gateway技术的表达载体构建
Gateway
LR反应
第二步：表达克隆载体的构建（LR反应）
• 混合包含目的基因的入门克隆和合适的目 的载体以及Gateway LR Clonase酶，构建表 达载体。目的载体必须含有attR同源序列， 可与含有attL的入门载体进行定点同源重组。
为什么要构建入门载体？
• Entry Clone是作为基因的一个来源克隆以便 较容易地亚克隆到任意目标载体。 • 同时，一旦Entry Clone是测序有效的，就 不需要对多个表达载体进行测序。 • 另外，attB序列相对较小（25bp），这使得 它们更适合加到PCR引物中去（需要在5'端 附加4个G以便进行有效重组）。
用pANIC 7A构建的表达载体，通过基因枪技术导入小麦和柳枝稷中， 观察pporRFP红色荧光蛋白基因的表达。红色荧光蛋白自发荧光率较低 而且红光穿透力更强，最高吸收峰为583nm。
实例二[1]
• 为方便基于植物瞬时表达技术的高通量功 能基因筛选，利用G技术入门载体pDONR222的经过酶 切后连接到植物表达载体pCAMBIA0380的 多克隆位点上，构建Gateway技术兼容的 p1104D植物表达载体。
谢谢听P—λ噬菌 体同源重组 位点 attB—E.coli 染色体上的 同源重组位 点
修饰后的位点信息
Gateway技术只需要两步反应就可完成表 达载体的构建。 反应 反应位点 反应产物 产物结构 BP反应 attB×attP 入门克隆载体 attL1-基因-attL2
LR反应 attL×attR 表达克隆载体 attB1-基因-attB2
第一步：入门载体的构建
有四种方法: A. 限制性内切酶消化目的基因后酶连进入 入门载体 B. PCR克隆，以含attB的特异引物合成目的 基因资源
同尾酶结合gateway克隆技术构建多基因表达载体的方法
同尾酶结合gateway克隆技术构建多基因表达载体的方法同尾酶结合gateway克隆技术是一种高效的基因克隆方法，已被广泛应用于多基因表达载体的构建。
本文介绍了采用同尾酶结合gateway克隆技术构建多基因表达载体的方法。
首先，设计含有多个目的基因的PCR引物，使其末端含有同一限制酶切位点。
使用这些引物分别扩增目的基因，并将其纯化后进行限制酶切。
接下来，将经过限制酶切的基因片段与同尾酶切割后的基因载体连接，构建同尾酶结合的基因载体。
然后，将所得的基因载体与gateway载体进行LR反应，得到多基因表达载体。
最后，将多基因表达载体转化到目标表达宿主中进行表达。
利用同尾酶结合gateway克隆技术，可以高效地构建含有多个目的基因的表达载体，为分子生物学研究提供了更为有效的工具。
- 1 -。
gateway构建载体原理
gateway构建载体原理Gateway（网关）是将多个网络连接在一起的设备，它可以在不同的网络之间传输数据。
在计算机网络中，网关是连接两个网络的节点。
它可以是硬件设备或软件服务，负责转发数据包，使得不同网络中的数据能够互相通信。
网关的构建载体原理是通过将多个网络接口连接在一起，实现不同网络之间的数据传输。
网关通常具备路由器的功能，可以根据目标网络的地址将数据包转发到相应的网络。
它还可以执行网络地址转换（NAT）的功能，将私有网络地址转换为公共网络地址，实现内部网络与外部网络的互联。
网关的构建可以基于不同的协议和技术，常见的有以下几种载体原理：1. 路由器：路由器是一种常见的网关设备，它可以连接不同的网络，并根据网络地址的转发表将数据包转发到目标网络。
路由器可以根据网络的拓扑结构和路由协议来选择最佳的路径，以实现数据的快速传输。
2. 防火墙：防火墙是一种网络安全设备，可以用作网关来保护内部网络免受外部网络的攻击。
防火墙可以检查和过滤进出网络的数据流量，阻止潜在的威胁和攻击。
同时，防火墙也可以实现网络地址转换，隐藏内部网络的真实地址，增加网络的安全性。
3. 代理服务器：代理服务器也可以作为网关设备使用，它可以拦截客户端和服务器之间的通信，并代表客户端发送请求。
代理服务器可以缓存常用的资源，减少网络流量和加快响应速度。
此外，代理服务器还可以过滤和控制进出网络的数据流量，提高网络的安全性。
4. VPN网关：VPN（虚拟私有网络）网关是一种将远程网络连接到私有网络的设备。
它可以通过加密和隧道技术，创建一个安全的连接，使远程用户能够访问私有网络中的资源。
VPN网关可以通过认证和加密来保护数据的安全性，实现远程访问和远程办公。
5. 负载均衡器：负载均衡器是一种用于分发网络流量的设备，可以将流量均匀分配给多个服务器，提高系统的性能和可靠性。
负载均衡器可以作为网关设备使用，将客户端的请求转发到最适合处理的服务器上，实现请求的快速响应和服务器资源的有效利用。
Gateway技术构建棉花GhSAMDC基因植物表达载体
石河子大学学报 （ 自然 科 学 版 ） Ｊ ｕ ｌ ｆ ｈｈｚ Ｕｎ ｅｓ ｙＮａ ｒｌ ｃ ｎｅ ｏ ｍａ ｏ ｉｅ ｉ ｒｉ ｛ ｔ ａ Ｓ ｉ ｃ） Ｓ ｉ ｖ ｔ ｕ ｅ
Ｖｏ ． Ｏ Ｎｏ ２ １３ ．
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文章 编 号 ： ０ ７７ ８ ｛ ０ ２ ０ — １ ８０ １０ —３ ３ ２ １ ）２０ ３—４
Ｇ ｔｗ ｙ技 术 构 建棉 花 Ｇ Ｓ ＭＤ 基 因植 物 表 达 载 体 ａｅ ａ ｈＡ Ｃ
Gateway技术构建小鼠血管生成素-1慢病毒表达载体及其病毒包装
定 病毒滴 度为 ５ × １ ０ Ｔ Ｕ ／ ｍｌ 。 结论
成功 构建 Ａ ｎ ｇ 一 １ 慢病 毒 表达 载体 ， 并 包装 出具高效 感染 力的慢病 毒颗 粒 ， 为进 一步 研究
， 腼 见群杂 杏 ， ２ ０ １ ３ ， ８ ６ ６ － ８ ７ ０ ］
Ａ ｎ ｇ － １ 基 因功能 及基 因治疗 提供 实验 基础 。 关键 词 ： 血管生成 素一 １ ； 慢病 毒 ； 载体 ； Ｇ ａ ｔ ｅ ｗ ａ ｙ 技 术
・
８ ６ ６・
临 床儿科 杂志 第 ３ １ 卷第 ９ 期 ２ ０ １ ３ 年 ９ 月 Ｊ Ｃ ｌ ｉ ｎ Ｐ ｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｒ Ｖ ｏ １ ． ３ １ Ｎ ｏ ． ９ Ｓ ｅ ｐ ． ２ ０ １ ３
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ０ — ３ ６ ０ ６ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ９ ． ０ １ ７
ｇ ｉ ｎ ｇ Ｌ １ Ｑ ｉ ｕ ｐ ｉ ｎ ｇ ， Ｍ Ａ Ｘ ｉ ｎ ｎ ａ ， Ｚ Ｈ Ａ Ｎ ＧＸ ｉ ａ ｏ ｙ ｉ ｎ ｇ ， ＸＵｄ ｉ ｎ ｇ ， Ｚ Ｈ Ａ ＮＧ Ｓ ｈ ｅ ｎ ， Ｗ Ｎ Ａ Ｇ Ｃ ｈ ｕ ｎ ｚ ｈ ｉ ， Ｆ Ｅ ＮＧ Ｚ ｈ ｉ ｅ ｈ ｕ ｎ（ Ｂ ａ ｙ ｉ Ｃ ｈ ｉ ｌ ｄ ｒ ｅ ｎ ＇ ｓ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ Ａ ｉｌ ｆ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ Ｂ ｅ ｉ ｊ ｉ ｎ ｇ Ｍｉ ｌ ｉ ｔ ａ ｒ ｙ Ｒ ｅ ｇ ｉ ｏ ｎ Ｇ ｅ ｎ ｅ ｒ ａ ｌ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ， Ｂ ｅ ｊ ｉ ｉ ｎ ｇ １ ０ ０ ７ ０ ０ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ）
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以木糖异构酶基因xylA为选择标记的Gateway系统植物表达载体的构建
ｎ ｎｅ ｎｏｔｅ ｅｐｅｓ ｎ ｖｃ ｒｐ Ａ Ｉ ３ １ ｘｌ ．Ｔ ｉ ，ｔｅ ｄ ｎｒｖｃ ｒｗｔ ＨＹ ｅ ｅ ｃ ｎｄ ｆ ｍ ‘ ｓ— ａｔ ｉ ｈ ｘｒｓｉ ｅｔ Ｃ ＭＢＡ１０ 一 ｙＡ ｈｒ ｈ ｏｏ ｅｔ ｉ ５ ｇｎ ［ｌ ｅ ｒ ｄ ｔ ｏ ｏ ｄ ｏ ｈ ｏ ｏ Ｔ ｕ ｄ ’Ｔ ｒｉ（ｒ ｓ ａｅｍ ｅｔｓ Ｌ ｓｐ ｒｐ）ａ ｅ Ｂ ｅｃ ｃ ］ｗ ｓｍｘｄ ｗｔ Ｃ Ｍ Ｉ １ ０ 一ｙＡ Ｇ ｖｃ ｒｂ ａ ｕｎｐＢ ａ ｉ ａ ｐ ｓｒ ． ｓ． ａ ａ ｆ ｒ Ｐ ｒａｔＩ ｓｃ ｉ ｔ ｉｎ ａ ｉ ｉ ｐ Ａ Ｂ Ａ ３ １ｘｌ — Ｗ ｅｔ ｙ ｅ ｈ ｏ
［ ｂｔａ ｔ Ｏｂｅｔ ｅ Ｔ ｏ ｓ ｕｔｐａｔｅｐｅｓ ｎ ｖ ｃ ｒｗｔ ｙｏｅ ｉ ｍ ｒｓ ｅｅ ｘｌ ａ ｈ ｓｌ ｔ ｎ Ａ ｓ ｃ】 ｒ ｊｃｉ ： ｏ ｃｎｔ ｃ ｌｎ ｘｒｓｉ ｅｔ ｉ ｘｌ ｓ ｅａｅ ｇｎ ｙ ｖ ｒ ｏ ｏ ｈ ｓ ｏ Ａ ｓ ｔｅ ｅ ｃｉ ｅ ｏ
Ｇ ｔ ａ ｉ ｒ ｅ ｔ （ Ｈ ＷＧ Ｄ） 酶 切 位 点 Ｘｂ ａ ｗ ｙ Ｂ ｎ ｙ Ｖ ｃ ｒｐ ７ ２ 中 ｅ ａ ｏ ａＩ和 Ｈｉ １ 之 间 包 括 Ｐ ５ 、 ３ Ｓ ａ Ｒ１ ａ Ｒ ｎ １ ｄＩ ３ Ｓ Ｔ ５ 、ｔ 、ｔ ２和 Ｃ Ｒ— ｃ Ｂ 的 ｔ ｔ ｍ ｃｄ
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达 载 体 ｐ Ａ Ｉ ３ １ ｘ ｌ — Ｙ 。结 论 ： 用 木 糖 异 构 酶 基 因 ｘ ｌ 结 合 Ｇ ｔ ａ Ｃ ＭＢ Ａ１ ０ 一 ｙ Ｈ ５ Ａ 利 ｙ Ａ ａｅ ｙ克 隆技 术 构 建 无 抗 生 素标 记 植 物 ｗ 表 达 载体 ， 简 化 、 可 方便 植 物 转基 因表 达 载体 构建 。 ［ 键 词 ］ Ｇ ｔｗ ｙ技 术 ； 糖 异 构 酶 基 因 ； Ｒ 反 应 ； 物 表 达 载体 关 ａｅ ａ 木 Ｌ 植
Gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用[发明专利]
![Gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/8388b740f342336c1eb91a37f111f18583d00c85.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911062021.5(22)申请日 2019.11.01(71)申请人 西北农林科技大学地址 712100 陕西省咸阳市杨凌示范区邰城路3号(72)发明人 管清美 牛春东 曹富国 施焕然 陈鹏翔 (74)专利代理机构 西安长和专利代理有限公司61227代理人 何畏(51)Int.Cl.C12N 15/66(2006.01)C12Q 1/6876(2018.01)C12N 15/11(2006.01)C12N 15/82(2006.01)A01H 5/12(2018.01)A01H 6/82(2018.01) (54)发明名称Gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用(57)摘要本发明属于生物技术和植物基因工程技术领域，公开了一种Gateway克隆系统的植物表达载体及构建方法和应用，所述Gateway克隆系统的植物表达载体分别为P K G M Y C ，P K N Y F P 和PKCYFP；PKGMYC的序列为SEQ ID NO：1；PKNYFP的序列为SEQ ID NO：2；PKCYFP的序列为SEQ IDNO：3。
本发明以pK7GWIWG2D(II),0或pK2GW7为骨架，这两个载体分别使用SacI/KpnI和SacI/PmeI核酸内切酶进行双酶切；通过同源重组技术将其他Gateway系列载体构建入这两个载体，形成以卡那霉素为筛选标记的植物表达载体；同时，pK7GWIWG2D(II),0为骨架的改造载体还具有非融合的GFP荧光蛋白筛选标记。
权利要求书2页 说明书7页序列表14页 附图10页CN 110904137 A 2020.03.24C N 110904137A1.一种Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法，其特征在于，所述Gateway克隆系统的植物表达载体的构建方法以pK7GWIWG2D(II)或pK2GW7为骨架，两个载体分别使用SacI/KpnI和SacI/PmeI核酸内切酶进行双酶切；通过同源重组技术将其他Gateway系列载体构建入两个载体。
同尾酶结合Gateway克隆技术构建多基因表达载体的方法[发明专利]
![同尾酶结合Gateway克隆技术构建多基因表达载体的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/733eb5985acfa1c7ab00cc5d.png)
专利名称：同尾酶结合Gateway克隆技术构建多基因表达载体的方法
专利类型：发明专利
发明人：任茂智,王凯,冯丽,董攀
申请号：CN201510980547.7
申请日：20151223
公开号：CN105505967A
公开日：
20160420
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种同尾酶结合Gateway克隆技术构建多基因表达载体的方法，包括以下步骤：(1)构建M35S-8GWN载体、MNOS-8GWN载体和MOCS-8GWN载体；(2)克隆各目的基因，通过Not？I和Sbf？I将各基因分别组装到M35S-8GWN载体、MNOS-8GWN载体和MOCS-8GWN载体中，形成多个基因的表达盒；(3)将多个基因的表达盒通过同尾酶AsiS？I和Pac？I串联在一起；(4)将多基因表达盒通过Gateway？LR反应连接到目标表达载体上。
还公开了三种用于构建多基因植物表达载体的入门载体M35S-8GWN、MNOS-8GWN、MOCS-8GWN。
申请人：重庆大学
地址：400045 重庆市沙坪坝区沙正街174号
国籍：CN
代理机构：重庆市前沿专利事务所(普通合伙)
代理人：郭云
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基于Gateway技术的表达载体构建
1. Gateway-T载体（pGWC）的酶切反应
pGWC除具有传统T载体的克隆功能外，还可以作为入门克隆（Entry Clone）与Gateway 重组克隆技术兼容。
该载体中的ccdB基因编码一个能够使大多数E. coli致死的毒蛋白，可作为重组子的负选标记取代了蓝白斑筛选。
该载体在使用前，需经过AhdI（实验中采用其同裂酶Eam1105 I）酶切，使载体两端产生5’T，用与PCR产物的两端的3’A互补。
PCR产物回收后与pGWC载体连接，挑取正向克隆送测序。
pGWC载体的酶切反应体系如下：
pGWC
10 μl（约2μg）
10×Eam1105 I Buffer
5 μl
Eam1105 I
2 μl
ddH2O
34 μl
共计
50 μl
将反应混和液于37℃温育6h。
取1μl酶切反应液走1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，估测载体片段的浓度，该酶切反应液可直接用作连接无需纯化。
2. PCR产物的回收与连接反应
PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒（北京天根生化科技有限公司）进行回收，与pGWC载体进行连接。
DNA片段与pGWC-T的连接：
pGWC-T
1μl（约50ng）
DNA回收片段
4μl（600bp片段约需40ng）
Solution I （TaKaRa）
5μl
共计
10μl
反应混合液于4℃下连接过夜（约12~16h）。
3. 连接产物的转化
取大肠杆菌DH5α感受态细胞（50μl/管）于冰上融化，加入5μl连接产物，用移液器轻轻吸打混匀，在冰上放置30min，42℃水浴热激90s，冰上放置5min，加入无抗生素的LB培养基300μl，37℃，160rpm振荡培养45min，将菌液铺在氯霉素抗性（25mg/L）LB平板上，在超净台吹干后37℃倒置培养过夜。
4. LR反应与表达载体构建
表达载体均采用Gateway重组克隆技术构建，目标基因连入pGWC后即为入门克隆（Entry
Clone），通过与表达载体做LR反应构建目标基因的表达载体。
LR反应体系如下：
入门克隆（pGWC+gene）
1.0 μl（30-50 ng）
表达载体（GW-based）
1.0 μl（30-50 ng）
LR clonase Enzyme Mix
1.0 μl
ddH2O
2.0 μl
共计
5.0 μl
反应液于25℃反应4-6h，转化大肠杆菌DH5α，挑选单菌落进行鉴定，由于ccdB基因编码的毒蛋白可作为重组子的负选标记，因此阳性率非常高（可达90～99%）。