Gateway克隆技术,简单易操作
gateway重组技术
Gateway 基因克隆Gateway 基因克隆就是由Invitrogen公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。
该技术利用专有的重组序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中,可应用于大片段的基因克隆,并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。
这一技术在插入的目的DNA片段两端整合att L1与att L2两个侧端重组序列,来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”(Gateway Entry Clone)。
据Invitrogen宣称Gateway 技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应,如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法,避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性,大大提高了克隆效率,常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体,因此又称之为高通量基因克隆技术(Gateway Cloning Technology)。
一、Gateway 基因克隆的原理及机制Gateway被视为一种克隆操作平台:把目的基因克隆到入门载体(Entry Vector)后,就不用依赖限制性内切酶,而靠载体上存在的特定重组位点与重组酶,高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体(Destination Vector,目的载体)上。
Gateway的原理就是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。
在噬菌体与细菌的整合因子(INF、Int)的作用下,lambda的attP位点与大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组,lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中,两侧产生两个新位点:attL与attR。
这就是一个可逆的过程,如果在一个噬菌体编码蛋白Xis与IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB与attP位点,噬菌体从细菌基因组上裂解下来(见图1)。
这一过程的方向就是受控于两个重要因素:存在的介导蛋白与重组位点。
gateway技术
Gateway技术提供以下可能：通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间同时将您的基因转移到多个表达系统在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达一、一种更好的克隆方法Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。
这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。
当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。
Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。
图1 Gateway技术的灵活性Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。
Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。
一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。
此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆测序担心。
在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。
二、一项强大而可靠的技术Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。
一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。
Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。
BP和LR两个反应就构成了Gateway技术（表1和图2）。
BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。
LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。
LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。
Gateway
Gateway也可以被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。
Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。
在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。
这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。
这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
在Gateway系统中,入门载体包含两个重组位点序列attL1和attL2，大小均为100bp，中间夹着一个自杀基因——ccdB基因。
由于ccdB基因的表达产物能抑制普通的E.coli生长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化时不能生长。
在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因，接入目的基因。
ccdB基因两端可以选择的酶切位点有限（2个），同时还必须考虑读码框架、启动子、终止密码等问题，因此Gateway系统提供了5种不同的入门载体以供选择。
需要特别注意的是转化用的菌株必须是不含F附加体的，因为它表达的一种产物能阻断ccdB基因，影响筛选结果。
同样，目的载体（Destination Vector）也必须和Gateway系统配套，即目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点attR1和attR2，大小均为125bp，同样也夹着一个ccdB自杀基因。
当需要将目的基因从入门载体（Entry Vector）转移到目的载体（Destination Vector）时，只要将两种质粒混合（线性化能有效提高重组率），加入含有Int、IHF、Xis等重组因子的LR重组酶混合物，attR2序列和attL2序列发生重组，生成一个融合质粒。
gateway重组技术
河南农业大学牧医工程学院Gateway 基因克隆Gateway 基因克隆是由Invitrogen公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。
该技术利用专有的重组序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。
这一技术在插入的目的DNA片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（Gateway Entry Clone）。
据Invitrogen宣称Gateway技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高通量基因克隆技术（Gateway Cloning Technology）。
一、Gateway 基因克隆的原理及机制Gateway被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。
Gateway的原理是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。
在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。
这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来（见图1）。
这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统
Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统，大大简化基因克隆和亚克隆步骤，同时克隆效率高达95％,当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可保证正确的方向和阅读框。
Gateway技术基于λ噬菌体位点特异重组系统（attB ×attP →attL ×attR）。
BP和LR两个反应就构成Gateway技术，BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆；LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应，用于在平行的反应中把目的序列转移到一个或更多目的载体。
Gateway技术也利用了ccdB选择方法，确保高效率的分离重组克隆。
完成构建Gateway表达克隆仅需两步：⑴创建入门克隆，通过PCR将目的基因克隆进入门载体；⑵混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体及Gateway LR Clonase，产生表达克隆（用来在合适的宿主中进行蛋白的表达和分析）。
构建入门载体PCR重组克隆重组是从PCR产物创建Gateway入门克隆的一种方法。
通过合并attB位点到上游和下游引物上，然后共同孵育扩增PCR产物和pDONR载体(包含attP位点)及GatewayBP ClonaseTM酶混合物。
接着转化进大肠杆菌中，您将会获得包含目的基因的入门克隆，同时目的基因两侧具有attL重组位点。
这个入门克隆可以与任何Gateway目的载体进行重组。
表达系统一旦您构建好Gateway入门克隆，就可以使用Gateway技术进入到几乎是无数种的表达系统。
Gateway技术为进行基因功能分析和蛋白表达提供了广泛深入的方法，通过把目的基因转移到优化构建的体外表达载体，pEXP1-DEST 或pEXP2-DEST，然后开始体外蛋白合成。
目前有很多具有不同启动子的大肠杆菌目的载体，提供一系列表达选择，Gateway目的载体也提供N端或/和C端融合标签的选择，简化表达蛋白的纯化和检测。
实验方案gateway
实验方案Gateway® 反应的基本原理∙BP反应—构建Gatew ay® 入门克隆∙LR 反应—构建Gatew ay® 表达克隆∙一管模式—从PCR 产物构建Gatew ay® 表达克隆∙Gatew ay® 载体转化—将您喜爱的克隆载体转化成Gatew ay® 载体TOPO® TA 克隆- 创建Gateway® 入门克隆∙∙步骤一–制备PCR 产物使用Taq 聚合酶和自己的方案生成PCR 产物。
通过最后7 到30 分钟的延伸步骤，结束PCR 反应。
步骤二- 进行TOPO® 克隆反应1. 按所示顺序使用试剂，以建立以下一种TOPO® 克隆反应。
对于电穿孔，将盐溶液稀释 4 倍以制备稀释盐溶液。
试剂化学转染电穿孔法新鲜的PCR 产物0.5 至 4 µl 0.5 至 4 µl盐溶液 1 µl --稀释盐溶液-- 1 µl无菌水至终体积为 5 µl 至终体积为 5 µlTOPO® 载体 1 µl 1 µl总体积 6 µl 6 µl∙2. 轻轻混合并在室温下孵育 5 分钟。
3. 置于冰上，然后开始转化One Shot® 化学感受态 E. coli，步骤如下步骤三- 转化One Shot® 化学感受态E. coli1. 每次转化时，解冻置于冰上的一小瓶One Shot® E. coli 细胞。
2. 在一小瓶One Shot® 化学感受态E. coli 中加入 2 µl TOPO® 克隆反应液，轻轻混匀。
3. 在冰上孵育 5 至30 分钟。
4. 将细胞置于42°C 下热休克30 秒，不振荡。
立即将试管转移至冰上。
5. 加入250 µl 室温S.O.C. 培养基。
gateway重组技术
Gateway也可以被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。
Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。
在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。
这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。
这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
在Gateway系统中,入门载体包含两个重组位点序列attL1和attL2，大小均为100bp，中间夹着一个自杀基因——ccdB基因。
由于ccdB基因的表达产物能抑制普通的E.coli生长，在克隆时没有切开或者自身环化的载体在转化时不能生长。
在构建含目的基因的入门载体时必须切掉这个基因，接入目的基因。
ccdB基因两端可以选择的酶切位点有限（2个），同时还必须考虑读码框架、启动子、终止密码等问题，因此Gateway系统提供了5种不同的入门载体以供选择。
需要特别注意的是转化用的菌株必须是不含F附加体的，因为它表达的一种产物能阻断ccdB基因，影响筛选结果。
同样，目的载体（Destination Vector）也必须和Gateway系统配套，即目的载体的表达调控元件下游有两个重组位点attR1和attR2，大小均为125bp，同样也夹着一个ccdB自杀基因。
当需要将目的基因从入门载体（Entry Vector）转移到目的载体（Destination Vector）时，只要将两种质粒混合（线性化能有效提高重组率），加入含有Int、IHF、Xis等重组因子的LR重组酶混合物，attR2序列和attL2序列发生重组，生成一个融合质粒。
Gateway技术
Gateway™技术提供以下可能：•通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间•将您的基因转入到多个表达系统•在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达一种更好的克隆方法Gateway™技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。
这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95％或更高。
当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。
Gateway™也有助于进行带不同数目纯化和检测标签的表达。
Gateway™利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。
一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您感兴趣的基因到Gateway™改造过的的各种表达载体（目的载体）。
此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆的测序担心。
在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。
图1-Gateway™技术的灵活性*目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。
一种强大而可靠的技术Gateway™技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。
一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。
Gateway™技术是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。
BP和LR两个反应就构成了Gateway™技术（表1和图2）。
BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。
LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。
LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。
Gateway™技术也利用了ccdB选择方法，确保高效率的分离重组克隆。
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Gateway克隆技术，简单易操作
在过去数十年，用限制性内切酶产生黏性末端，在DNA连接酶的作用下，连接两个甚至更多片段的克隆方法，是载体构建的经典方案。
但是现如今我们再提到克隆的时候，远远不再只有传统的限制酶克隆一种选择。
其中Gateway克隆技术作为一种可以快速、高效将DNA 序列转移到载体上的克隆方法已经流行开来。
不要觉得Gateway克隆技术高深莫测，其实了解一下你就能懂。
Gateway克隆方法是λ噬菌体感染细菌时发生的整合和切割重组反应的体外形式。
在体内，噬菌体（attP）和细菌（attB）的附着位点发生重组反应，噬菌体整合到细菌基因组中，两侧为两个新的重组位点（attL-left-和attR-right-）。
在某些条件下，attL和attR位点可以重组，导致噬菌体从细菌染色体上切除并重新生成attP和attB位点。
即Gateway技术依赖于下面描述的两个反应：BP反应和LR反应，通过BP反应获得入门克隆(有时候我们也说中间克隆)，再通过LR反应将目的DNA以正确的方向连接到各种目的载体上，形成不同的表达载体。
GeneCopoeia的EZShuttle™重组克隆体系应用E.coli 和λ噬菌体特异位点的重组酶促体系使DNA片段在载体间相互转换，其原理与Gateway 克隆技术相同。
BP反应-构建入门载体：
通过PCR将attB位点添加到目的DAN序列两侧，形成attB-PCR产物。
用attB-PCR产物或者含attB位点的供体质粒和含attP位点的质粒发生重组生成入门克隆。
EZRecombinase BP混合物，货号：RCBM-1002-020
LR反应-构建表达载体：
制作表达载体时，选择适合的目标载体非常重要。
这种选择取决于许多因素，如宿主类型，所需的表达水平和实验目的。
选定的attR表达载体与attL-入门载体重组以产生表达载体。
EZRecombinase LR混合液，货号：RCBM-1001-020。