Gateway技术-克隆、表达新方法.ppt
Gateway
LR反应
第二步：表达克隆载体的构建（LR反应）
• 混合包含目的基因的入门克隆和合适的目 的载体以及Gateway LR Clonase酶，构建表 达载体。目的载体必须含有attR同源序列， 可与含有attL的入门载体进行定点同源重组。
为什么要构建入门载体？
• Entry Clone是作为基因的一个来源克隆以便 较容易地亚克隆到任意目标载体。 • 同时，一旦Entry Clone是测序有效的，就 不需要对多个表达载体进行测序。 • 另外，attB序列相对较小（25bp），这使得 它们更适合加到PCR引物中去（需要在5'端 附加4个G以便进行有效重组）。
用pANIC 7A构建的表达载体，通过基因枪技术导入小麦和柳枝稷中， 观察pporRFP红色荧光蛋白基因的表达。红色荧光蛋白自发荧光率较低 而且红光穿透力更强，最高吸收峰为583nm。
实例二[1]
• 为方便基于植物瞬时表达技术的高通量功 能基因筛选，利用G技术入门载体pDONR222的经过酶 切后连接到植物表达载体pCAMBIA0380的 多克隆位点上，构建Gateway技术兼容的 p1104D植物表达载体。
谢谢听P—λ噬菌 体同源重组 位点 attB—E.coli 染色体上的 同源重组位 点
修饰后的位点信息
Gateway技术只需要两步反应就可完成表 达载体的构建。 反应 反应位点 反应产物 产物结构 BP反应 attB×attP 入门克隆载体 attL1-基因-attL2
LR反应 attL×attR 表达克隆载体 attB1-基因-attB2
第一步：入门载体的构建
有四种方法: A. 限制性内切酶消化目的基因后酶连进入 入门载体 B. PCR克隆，以含attB的特异引物合成目的 基因资源
Gateway 克隆技术背景原理及其应用
If the normal attB site is deleted from the chromosome, integrase can bind with lower affinity to secondary sites on thechromosome, resulting in integration of lambda at a different site. The frequency of integration into secondary sites is 100-1000 times rarer than integration into attB. The actual crossover occurs between homologous 15 bp core regions on the two sites, but surrounding sequences are required as they contain the binding sites for the recombination proteins (Landy, 1989).
Modifications to the att Sites
Mutations have been made to the core regions of the att sites to eliminate stop codons and to ensure specificity of the recombination reactions to maintain orientation and reading frame. Mutations have been introduced into the short (5 bp) regions flanking the 15-bp core regions of the attB sites to minimize secondary structure formation in single-stranded forms of attB plasmids (e.g. phagemid ssDNA or mRNA). A 43 bp portion of the attR site has been removed to make the in vitro attL x attR reaction irreversible and more efficient (Bushman et al., 1985).
网络克隆步骤(共10张PPT)
3、安装冰点种子
➢ 在服务器上安装冰点服务器版
➢ 生成冰点种子文件 ➢ 安装冰点种子
密码仅供一个用户使用 密码供多用户使用，建议选此项
4、安装自动更改IP工具
➢ 在克隆后，每台学生机的IP地址和计算机名 都一样这样会造成地址冲突，所以要安装 一个自动更改IP的工具。
网络克隆步骤
一、网络克隆的步骤
安装系统
安装常用软件
生成并安装冰点种子
建立网克服务器
分发Maxdos启动文件
系统打包上传 开始克隆
安装自动更改IP工具
安装冰点完成克隆
1、安装系统要注意的问题
可以改成➢0，安也可以装不管，完在bo成ot. 后看看设备管理器中有无有问题 的设备 完成系统的一些优化设置（如启动管理、不需要的软件的清理、分区格式转换）
➢ 重启后学生机这会个自就不动要连选了接，到我们网现克在只服是务要端它重，启等后自所动有进入客网户 端连接后，点击克发，如送果即真的可需。要，在安装系统时就下载安装吧。
取消boot.ini文件的只读属性，再修改它， 这是说明修不改管完它保，存点后下还一要步把属性改回来
8、安装冰点
➢ 克隆完成后，客户端会自动重新启动一次 ，这是自动修改IP工具完成的教室软件重新启动一 次。
在开始克隆前就要使用一些工具收集学生机上原有的计算机名，IP及网卡MAC地址，特别是网卡的MAC地址。 安装完自动更改IP的工具后，重新启动计算机，但是重启后不要进入WINDOWS，而是直接进入操作系统选单的第二项“MaxDos”中，这
➢ 更改收藏夹、我的文档的位置到其它盘（ 样就可以让我们打包后的系统克隆到其它计算机后自动更改IP了。
gateway技术
Gateway技术提供以下可能：通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间同时将您的基因转移到多个表达系统在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达一、一种更好的克隆方法Gateway技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。
这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95%或更高。
当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。
Gateway也有助于进行带不同数目纯化和检测标签蛋白的表达。
图1 Gateway技术的灵活性Gateway技术：克隆、表达新方法 - zhchyuan2008 - zhchyuan2008的博客目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。
Gateway利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。
一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您的目的基因到Gateway改造过的各种表达载体（目的载体）。
此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆测序担心。
在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。
二、一项强大而可靠的技术Gateway技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。
一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。
Gateway技术是基于已研究的非常清楚的λ噬菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。
BP和LR两个反应就构成了Gateway技术（表1和图2）。
BP反应是利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。
LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。
LR反应用来在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。
利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子的RNAi表达载体
利用Gateway克隆技术构建丹参SmNAC1转录因子的RNAi表达载体NAC转录因子参与植物生长发育和对生物和非生物胁迫的应答反应，利用Gateway克隆技术构建丹参NAC转录因子的RNAi植物表达载体，以便进一步研究丹参NAC转录因子的功能。
根据Gateway技术要求，设计含有attB接头的引物，使用NEB的Phusion超保真聚合酶，通过PCR方法，扩增SmNAC1基因的特异性片段。
通过BP重组反应，将带有attB接头的PCR产物克隆到入门载体pENTR/SD/D-TOPO上，再通过LR重组反应，利用入门载体上的SmNACi 特异性基因片断克隆到植物表达载体pK7GWIWG2D上。
实验结果表明Gateway 载体的构建方法能够高效、快速地将目的基因克隆到表达载体上，为植物基因转化提供基础。
标签：RNAi；Gateway载体；BP和LR反应Gateway克隆技术是由invitrogen公司开发，基于λ噬菌体的位点特异性重组原理[1-2]，可以使DNA片段在不同的克隆载体之间实现转移，并保持基因定位和阅读框架不发生改变。
λ噬菌体的位点特异性重组是在噬菌体和细菌的整合因子（INF，Int）的作用下，λ噬菌体的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，λ噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生2个新位点：attL，attR。
这是一个可逆的过程，在噬菌体编码蛋白Xis和细菌的整合因子IHF，Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB，attP位点。
这一过程受编码蛋白Xis和整合因子（IHF，Int）调控。
与经典基因克隆多个步骤相比，Gateway技术不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到表达载体（destination vector，目的载体）上，该方法只需一步生化反应便能达到目的，是高通量克隆基因的好方法。
[课件]实验室常用载体介绍(Gateway技术)PPT
![[课件]实验室常用载体介绍(Gateway技术)PPT](https://img.taocdn.com/s3/m/d137aec9e009581b6bd9eb91.png)
Байду номын сангаас
• 转化效率低？
• 切记抗生素
• 邓锋林负责载体的保管
• 谭家福负责相关酶的管理 • 每个人只给划平板
转基因过程中的注意事项
• • • • • • 大小皿及滤纸不能混用 转基因的共培皿及一些摇菌的三角瓶灭完菌再洗 转基因所挑的克隆块，每个克隆块分化苗的棵数 烟草转基因的假阳性问题（抗生素） 拟南芥的转化 公共卫生：到完皿之后， 继完代之后，配完培养 基之后 • 转基因苗移栽
TOPO异构酶
Gateway® 技术
• Gateway® 技术基于清楚了解的λ噬菌体位点特 异重组系统(attB+attP ；attL+attR)。BP反应是 DNA片段或者包含attB位点的表达克隆与包含 attP位点的供载体（donor vector）之间进行的 反应。BP反应产生入门克隆。 • LR反应是含attL位点的入门克隆和包含attR位点 的目的载体之间的重组反应。LR反应产生表达 克隆。表达克隆包含目的基因和目的载体特异 的启动子或者一些元件。
酶切连接载体
• 超表达
pCAMBIA2300S
• 启动子
pBIN m-gfp5-ER和pBI121
Gateway技术载体
• 超表达
pGWB401 pGWB501
pGWB402 pGWB502
pGWB402Ω pGWB502Ω
可能都要做融合蛋白了，与gfp或者his标签， 这样以后就可以做WESTERN了。这边他 们的超表达都是做的融合蛋白，不过要事 先确定融合基因放在５‘还是３’，免得 影响其功能。如果不确定就两种同时做。
attB2 5’ - GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTN - 3’
gateway重组技术
河南农业大学牧医工程学院Gateway 基因克隆Gateway 基因克隆是由Invitrogen公司在二十世纪九十年代末发明并应用于分子生物学基因克隆的一项专利技术。
该技术利用专有的重组序列使得DNA片段能够更有效地被转入质粒当中，可应用于大片段的基因克隆，并且在保持正确阅读框的前提下让不同表达载体间的DNA转移成为可能。
这一技术在插入的目的DNA片段两端整合att L1和att L2两个侧端重组序列，来构建一个类似通道的结构并称之为“入门克隆”（Gateway Entry Clone）。
据Invitrogen宣称Gateway技术使用99%有效且可逆的一小组重组反应，如此使得基因克隆不同于传统的限制性内切酶方法，避免了目的片段内存在切点的问题而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率，常应用于大规模的DNA片段整合进同一种表达载体，因此又称之为高通量基因克隆技术（Gateway Cloning Technology）。
一、Gateway 基因克隆的原理及机制Gateway被视为一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。
Gateway的原理是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿主基因组上。
在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。
这是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来（见图1）。
这一过程的方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
Gateway技术
Gateway™技术提供以下可能：•通过去除冗长的亚克隆步骤节省您的时间•将您的基因转入到多个表达系统•在任何您选择的系统――体外，细菌，酵母，昆虫，或哺乳动物――分析表达一种更好的克隆方法Gateway™技术能够克隆一个或多个基因进入到任何蛋白表达系统（图1）。
这项强大的体外技术大大地简化了基因克隆和亚克隆的步骤，而同时典型的克隆效率高达95％或更高。
当基因在目的表达载体之间快速简便的穿梭时，还可以保证正确的方向和阅读框。
Gateway™也有助于进行带不同数目纯化和检测标签的表达。
Gateway™利用了位点特异重组，所以在构建入门载体后，不再需要使用限制性内切酶和连接酶。
一旦您拥有了一个入门克隆，就可以多次使用它，转移您感兴趣的基因到Gateway™改造过的的各种表达载体（目的载体）。
此外，由于在重组时DNA片段的阅读框和方向保持不变，因而您不必再为新的表达克隆的测序担心。
在使用每一种新的表达系统时，将会节省您更多的时间。
图1-Gateway™技术的灵活性*目的基因克隆进入门载体后，可以同时转移目的基因到多个目的载体。
一种强大而可靠的技术Gateway™技术是克隆和亚克隆DNA序列的一项新颖的通用系统，便于功能基因的分析和蛋白质的表达。
一旦进入这个多功能的操作系统，DNA片段可以通过位点特异的重组在载体之间转移。
Gateway™技术是基于已研究的非常清楚的λ嗜菌体位点特异重组系统（attB x attP →attL x attR）。
BP和LR两个反应就构成了Gateway™技术（表1和图2）。
BP反应利用一个attB DNA片段或表达克隆和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。
LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。
LR反应用来在在平行的反应中转移目的序列到一个或更多个目的载体。
Gateway™技术也利用了ccdB选择方法，确保高效率的分离重组克隆。
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to 10ul
25℃温浴1-16h。随着时间的延长，可有效增加克隆，但时间不宜超
, 过18h 终止反应后，最后取1-5ul BP反应液转化大肠杆菌。挑取阳
性克隆，进行PCR或验证，然后抽提质粒 ，酶切验证。
LR重组装入表达载体
根据自己实验目的，了解自己将要装入的载体的结构，原核表达，超 表达，抑制表达、特异表达、GUS/GFP表达等载体，
引物设计：
1通用引物 ：
attB1 adapter: 5’-GGGGACA AGT TTGTACAAA AAAGCAGGCT -3’ attB2 adapter: 5’-GGGGAC CACTTTGTACAAGAA AGCTGGGT -3’
2含部分接头的基因特异性引物 ： attB1+gene forward: 5’-AA AAA GCA GGC TNN - template-specific
Gateway技术 克隆、表达新方法
Gateway技术
Gateway技术：
一种克隆操作平台：把目的基因克隆到入门载体（Entry Vector）后，就不用依赖限制性内切酶，而靠载体上存在 的特定重组位点和重组酶，高效、快速地将目的基因克隆 到其它的受体载体（Destination Vector，目的载体）上。
Gateway表达载体的转换
连接多个片段到表达载体
3：PCR产物的纯化
4：BP重组反应
BP重组反应
Components attB-PCR product （>10ng）
Sample 1-7ul
pENTR vector (150 ng/ul)
1ul
5X BP Clonase Clonase enzyme mix 2ul
TE Buffer, pH 8.0
Gateway技术特点：
通过去除冗长的亚克隆步骤节省操作时间，同时将目的 基因转移到多个表达系统，在任何选择的表达系统如细菌， 酵母，昆虫，或哺乳动物进行基因的分析表达。
Gateway技术的灵活性：
Gateway技术的原理
Gateway的原理也是建立在噬菌体DNA定点整合到细菌宿 主基因组上。在噬菌体和细菌的整合因子（INF、Int）的 作用下，lambda的attP位点和大肠杆菌基因组的attB位点 可以发生定点重组，lambda噬菌体DNA整合到大肠杆菌 的基因组DNA中，两侧产生两个新位点：attL和attR。这 是一个可逆的过程，如果在一个噬菌体编码蛋白Xis和IHF、 Int的共同介导下这两个新位点可以再次重组回复为attB和 attP位点，噬菌体从细菌基因组上裂解下来。这一过程的 方向是受控于两个重要因素：存在的介导蛋白和重组位点。
PCR定向TOPO克隆流程
一：实验前的准备
1：认真阅读INVITROGEN公司的GATEWAY-MANUAL
2;在实验操作前，先要确保你的基因使用高保真的Taq酶克隆经过验证， 装入T载体中
3:入门载体质粒和目标表达载体质粒的抽提。质粒的浓度要求比较高，
150ng/ul.
4:引物设计。根据入门载体序列的特点，设计通用引物 和含部分接头的 基因特异性引物
（2）混合包含目的基因的入门克隆和合适的目的载体以及 Gateway LR Clonase酶，构建表达克隆
BP和LR反应示意图
BP反应
LR反应
反应特点:
入门载体的构建
（1）限制性内切酶消化和连接进入入门载体
（2）PCR克隆（定向TOPO克隆至入门载体 或与供载体B×P重组）
PCR定向TOPO克隆
sequences-3’ attB2+gene reverse: 5’-A GAA AGC TGG GTN - template-specific
sequences-3’
BP重组装入入门载体
1:添加attB接头的PCR 以携带目的基因质粒为模板 ，加含部分接头的基
因特异性引物,进行第一轮PCR 2 :取第一轮的PCR产物做模板，加入通用引物，进行第二轮
LR重组反应
Components Entry clone （50-150ng）
Sample 1-7 ul
Destination vector (150 ng/ul) 1 ul
5X LR Clonase enzymr, pH 8.0
to 10 ul
25℃温浴1-16h。终止反应后，最后取1-5ul BP反应液转化大肠杆菌
整合后的附着位点为 attL（BOP’） attR（POB’） 整合位点---attB attP
切除位点---attL attR 整合过程需要Int和IHF
共同作用
attB x attP →attL x attR
完成构建Gateway表达克隆仅需两步
（1）创建入门克隆,通过PCR或传统的克隆方法将目的基因 克隆进入门载体。
挑取阳性克隆，进行PCR或验证，然后抽提质粒 ，酶切验证。
Gateway技术的评价
一旦构建好Gateway入门克隆，蛋白表达和分析的大门就 会向您敞开。使用Gateway技术，您可以进入到几乎是无 数种的表达系统。因为没有一个单一的表达系统适合于每 一种蛋白，优化基因表达的最好方法是在多个系统中分析 您的蛋白 Invitrogen 已将Gateway技术合并到部分最高级的表达系 统中。无论选择哪个系统――体外，细菌，酵母，昆虫， 或哺乳动物――都可以获得Gateway目的载体。此外，你 可以很容易地把最称手的表达载体转换成Gateway目的载 体