位点专一性重组的核苷酸序列共54页文档
第1节位点特异性重组
第六章位点特异性重 组和DNA转座
P319
Introduction
1.保守性位点特异性重组（conservative site-specific recombination, CSSR）
2.转座重组（transpositional recombination）
P320
P320
1.保守性位点特异性 重组（CSSR）
2.2.3 聚腺苷酸(poly-A)反转录转座子
P340
2.2转座因子的类型
2.2.1 DNA转座子 2.2.1.1自主转座子（autonomous transposon） 2.2.1.2非自主转座子（nonautonomous
transposon）
2.2转座因子的类型
2.2.1.1 DNA自主转座子 ① 反向重复序列（具有转座酶识别序列） ② 转座酶基因
1.保守性位点特异性重组（CSSR） P321
1.1重组位点
During λ intergration, recombination always occurs at exactly the same nucleotide sequences within the two recombination sites, one on the phage DNA and the other on the bacterial DNA.
P341
④DNA聚合酶和DNA连接酶修复缺口
2.3DNA转座的剪切-粘贴机制
①转座酶识别并聚集转座子两端的反向重复序列，形 成转座体
②将DNA转座子从原始位置切除
③DNA单链交换，即转座子的3′-OH与靶DNA的5′-P 相连
④DNA聚合酶和DNA连接酶修复缺口
《位点特异性重组》课件
位点特异性重组的
03
应用
基因打靶
基因打靶是一种利用位点特异性 重组技术将外源基因定点整合到 靶细胞基因组的特定位置的方法
。
通过基因打靶技术，可以实现对 特定基因的敲除、替换或修饰， 以达到对细胞或生物体的遗传改
良。
基因打靶技术广泛应用于基因功 能研究、疾病治疗和生物育种等
领域。
基因治疗
1
位点特异性重组技术可用于基因治疗，通过将正 常的基因导入病变细胞并替换或修复缺陷基因， 以达到治疗疾病的目的。
详细描述
在转导型重组中，病毒DNA插入到宿主细胞基因组中，导致 基因的插入突变或基因组的重排。这种重组方式在病毒的传 播和进化中发挥重要作用，也是导致人类疾病的重要原因之 一。
转座子型重组
总结词
转座子型重组是指转座子在基因组内 自主复制和移动引发的DNA序列重排 的重组方式。
详细描述
转座子型重组涉及转座子的复制和移 动，导致DNA序列的重排和基因组的 变异。这种重组方式在生物进化、基 因组多样性和疾病发生等方面具有重 要作用。
应用
在基因工程、基因治疗、 基因组编辑等领域有广泛 应用。
位点特异性重组的
02
种类
整合型重组
总结词
整合型重组是指DNA片段从一个位置移动到另一个位置，与目标DNA整合为 一体的重组方式。
详细描述
在整合型重组中，DNA片段的移动通常涉及重组酶的作用，将DNA片段从原位 置切割并整合到新位置。这种重组方式在基因治疗和基因组编辑等领域有广泛 应用。
2
基因治疗是一种革命性的治疗方法，对于一些遗 传性疾病和罕见病具有显著的治疗效果。
3
基因治疗领域正在不断发展和完善，未来有望为 更多疾病提供有效的治疗方案。
位点专一性重组的名词解释
位点专一性重组的名词解释位点专一性重组是一种基因工程技术，用于改变DNA的序列，以实现特定基因的修饰和定向转移。
它在生物医学和农业领域中具有重要的应用价值，并展示了巨大的潜力。
位点专一性重组的基本原理是利用特定酶切酶的特异性，将目标DNA片段切割成两段，并在切口处插入外源DNA片段，从而改变目标基因的序列。
这种重组技术可以用于基因敲除、基因修饰和基因添加等多种目的。
位点专一性重组最早是通过轮状病毒发现的，该病毒能够在RNA和DNA之间进行转录。
研究人员发现，轮状病毒在基因转移过程中会发生位点特异性的重组反应，从而启发了位点专一性重组技术的发展。
位点专一性重组技术的一个重要应用是基因敲除。
通过选择性地切割和修改目标基因的序列，可以引发基因沉默和功能丧失。
这为研究人员提供了一种方法，以研究基因功能和相关生物学过程的作用。
此外，位点专一性重组还可用于基因修饰，包括点突变、插入序列和基因互换。
这种技术允许研究人员针对特定基因进行精确的改变，以改变目标基因的表达模式或产生特定的表型。
位点专一性重组技术在农业领域也具有重要的应用。
通过修改农作物的基因序列，可以改善农作物的抗病性、耐逆性和产量。
这为农业生产提供了新的策略，以提高农作物的品质和产量，并减少对化学农药的依赖。
尽管位点专一性重组技术具有巨大的潜力，但其应用仍面临一些挑战和争议。
其中一个主要问题是技术的准确性和效率。
由于位点专一性重组是基于特定酶切酶的活性进行的，所以技术在特定位点的修饰和转移效率可能会有所差异。
此外，位点专一性重组的可能影响和风险也需要密切关注。
例如，基因转移过程中的不确定性可能导致意外的副作用和不可预测的结果。
因此，在使用位点专一性重组技术时，需要对其潜在风险进行全面的评估和管理。
总体而言，位点专一性重组技术在生物医学和农业领域中具有广泛的应用前景。
通过精确修改基因序列，可以为人们提供更多的治疗选择和农业生产的创新解决方案。
然而，随着技术的进一步发展和应用的扩大，我们也需要认识到其潜在风险，并采取适当的预防措施。
8-第八章--位点特异性重组与DNA的转座
反转录病毒生活周期
（2）反转录病毒基因组结构与功能
◆ 含有3-4个基因，实为编码区，每各编码区通过加工产 生多种蛋白（多聚蛋白），经酶切成为单一的蛋白质形 式。
◆反转录病毒mRNA通常结构，5 ’端加帽，3’端与polyA 相连。
◆全长的mRNA被翻译时，产物为gag和pol 蛋白。翻译 从第一个起始密码子开始而终止于第一个终止密码子， 产物为gag蛋白。表达pol 蛋白必需越过终止密码子，效 率为5%，因此，gag蛋白是gag-pol蛋白的20倍。
◆ 控制因子家族是通过这两种因子相互作用来划定 的。一个家族由单个类型的自主因子组成，这些因子 由很多种非自主因子相伴随。
◆ 玉米Ac-Ds系统的结构
☉Ac序列由含5个内含子的单个基因编码，其产物为转座酶， 末端有11bp的IR和8bp的DR。
☉Ds是由Ac缺失产生的，Ds9缺失194bp；Ds6只保留2Kb。 转座酶失活但保留完整的转座酶作用位点（包括末端）。
玉米色斑的形成
（2）玉米的控制因子家族
McClintock还发现了Spm-Dspm系统。每个家 族都有自主性因子和非自主性因子。
◆ 自主性因子有切离和转座能力。可插入任何位点 产生不稳定的或可“突变”（mutable）等位基因。自 主性因子的丢失，可使可变的等位基因变成稳定的等 位基因。
◆ 非自主性因子是稳定的，自身不能转座，来源于 失去反式作用功能的自主因子，而这种功能是转座所 必须的。
（2）P 因子
◆研究发现，杂种不育是由于在W位点插入P因子（P element）所致，P品系有P因子，M品系无P因子。
◆P因子长2.9 Kb ，有4个开放阅读框(ORF)，末端有 31bp反向重复序列，靶DNA产生8bp的正向重复序列。
基因工程的主要技术与原理-核苷酸序列分析53页PPT
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
ห้องสมุดไป่ตู้
位点特异性重组解析
位点特异性重组我们可以看到，同源重组一般都在染色体内仍按DNA序列的原来排列次序。
但是在所谓位点特异性重组（site-specific recombination）中，DNA节段的相对位置发生了移动，从而得到不同的结果─DNA序列发生重排。
位点特异性重组不依赖于DNA顺序的同源性（虽然亦可有很短的同源序列），而依赖于能与某些酶相结合的DNA序列的存在。
这些特异的酶能催化DNA链的断裂和重新连接，它们能发动位点特异性重组作用.而在同源重组中，DNA链的切断完全是随机的，结果暴露出一些能与RecA这样的蛋白质相结合的顺序，从而发动交叉重组。
λ噬菌体DNA能通过重组作用整合进E.coli染色体的特异位点，成为前病毒（provirus，或称前噬菌体，prophage）。
λ的整合作用有两个特点：①这种交换是可逆的，原先存在的DNA顺序全部被保存下来，并无丢失；②噬菌体和细菌的DNA之间有一段很短的同源序列，重组交换必须通过其中的一个特定的核苷酸。
这两个特点也就是位点特异性重组的共同特点。
一、λ噬菌体的整合（integration）λ噬菌体编码λ整合酶（integrase）。
这个酶能指导噬菌体DNA插入E.coli染色体中。
这种插入作用是通过两个DNA分子的特异位点进行重组，将两个环状DNA分子变成一个大环。
在噬菌体感染的早期即有大量整合酶产生，故几乎所有被感染的细胞都发生整合作用。
这种作用可用体外模型来进行实验。
用四种成份混合起来组成反应系统：纯的整合酶；来自 E.coli的一种辅助蛋白，称为整合作用宿主因子（IHF，integration host factor）；镁离子；和含有噬菌体和细菌DNA发生重组交叉的特异位点（称为attP和attB，att源自attachment）的DNA片段。
对于这个DNA片段，一个简单的制备方法就是人工构建含attP和attB两者质粒。
当整合反应发生时，即在attP和attB处发生交叉重组，产生两个较小的环状DNA。
分子生物学—同源重组、位点专一性重组、转座
同源重组遗传交换、染色体上基因重排、断裂DNA的修复（1）同源重组的形式⏹常发生在同源染色体之间（分子间重组）⏹也可发生在同一DNA分子内（分子内重组）（2）Holliday 模型解释同源重组的一个经典模型基于重组过程中有十字形的中间产物（3）RecBCD重组途径存于E. coli中，需要RecBCD蛋白（RecBCD protein，recB、recC、recD基因的产物）参与DNA损伤造成的双链断裂以及外源DNA线性分子的DNA断端。
RecBCD是一种具多功能的酶，依赖于DNA的ATPase(水解ATP, 为DNA的解螺旋提供能量)；DNA helicase; DNA nuclease,可作用于单链或双链DNA, 切割χ位点（GCTGGTGG）χ(chi): crossover hotspot instigator RecBCD的切点与底物的序列有关，可在χ位点3’端4 ~ 6 ntRecA ：38 kD 的蛋白质，具多种功能，在重组中促进同源DNA单链的交换（主要是一单链与一双链中的同源单链交换）；交换过程需ATP。
RuvA和RuvB ：RuvA和RuvB均具DNA helicase活性，RuvB还有ATPase活性；RuvA特异性识别并结合到Holliday junction，并促使RuvB蛋白结合到这一位点；RuvB水解ATP，提供能量，促使分支迁移RuvC ：解开Holliday junction的核酸内切酶，特异地与Holliday junction结合，在特异位点切开Holliday junction。
RuvC是二聚体，有2个活性位点，能切开Holliday junction的两条链，切割位点有特异的序列，必须等branch migration 到达特异序列后，RuvC才能起作用，以何种方式解开Holliday junction取决于RuvC切割位点在两对同源单链上的频率。
（4）减数分裂重组（meiotic recombination）真核生物中常见的重组，与细菌中的重组有不少相似之处，但在起始的步骤有较大的差异，涉及DNA双链断裂（double-stranded DNA break，DSB）Spo11：核酸內切酶，能在染色体DNA上产生双链断裂而启动减数分裂重组；DNA切割必须发生在已复制的同源染色体开始配对的时候；DNA切割位点没有序列特异性，但是多分布在核小体包装疏松的染色体区域（如启动子区）（5）基因转换（gene conversion）多见于真核生物，当两相似的序列（等位基因、非等位基因均可）靠在一起时，就有可能发生基因转换，即一DNA序列转换成另一相似的序列，基因转换的机制是基于重组，即先交换一段DNA序列，再进行修复，就会使某一序列的比例增加。
核苷酸序列
核苷酸序列分析
ORF 应用ORF Finder 预测水稻瘤矮病毒（ RGDV ）S8片断的ORF
? ORF Finder:
? 水稻瘤矮病毒(rice gall dwarf virus, RGDV)引起的水稻瘤矮 病是中国及东南亚国家水稻上的一种重要病毒病害.
? 为构建融合蛋白的表达载体，需要对RGDV S8片断的基因 序列（GenBank登陆号：AY216767）进行ORF分析并确定 其位置，为设计表达引物提供信息.
点击
GetOrf
ggccagatgg aacatattgc tttcgggagc acaaggatcg ggtctactac gtctcggagc ggattttgaa gctgagcgag tgcttcggct acaagcagct ggtgtgcgtg ggcacctgct tcggcaagtt ctccaagacc aacaaactga agttccatat cacggcgctc tactacttgg cgccctacgc ccagtacaag gtgtgggtga agccctcctt cgagcagcag tttctctacg
核苷酸序列分析
重复序列分析 开放读码框 （open reading frame, ORF) 的识别 基因结构分析
内含子/外显子剪切位点识别 选择性剪切分析 CpG 岛的识别 核心启动子/转录因子结合位点 /转录启始位 点的识别 转录终止信号的预测 GC含量/密码子偏好性分析
核苷酸序列分析
ORF
重复序列分析
核苷酸序列分析
ORF
重复序列分析
2. 中度重复序列。长 10~300bp ，重复10~105次， 占基因组 10~40% 。哺乳类中含量最多的一种 称为Alu的序列，长约 300bp，重复3×105次， 在人类基因组中约占 7%，功能不是很清楚。