位点特异性重组解析
第1节位点特异性重组
第六章位点特异性重 组和DNA转座
P319
Introduction
1.保守性位点特异性重组（conservative site-specific recombination, CSSR）
2.转座重组（transpositional recombination）
P320
P320
1.保守性位点特异性 重组（CSSR）
2.2.3 聚腺苷酸(poly-A)反转录转座子
P340
2.2转座因子的类型
2.2.1 DNA转座子 2.2.1.1自主转座子（autonomous transposon） 2.2.1.2非自主转座子（nonautonomous
transposon）
2.2转座因子的类型
2.2.1.1 DNA自主转座子 ① 反向重复序列（具有转座酶识别序列） ② 转座酶基因
1.保守性位点特异性重组（CSSR） P321
1.1重组位点
During λ intergration, recombination always occurs at exactly the same nucleotide sequences within the two recombination sites, one on the phage DNA and the other on the bacterial DNA.
P341
④DNA聚合酶和DNA连接酶修复缺口
2.3DNA转座的剪切-粘贴机制
①转座酶识别并聚集转座子两端的反向重复序列，形 成转座体
②将DNA转座子从原始位置切除
③DNA单链交换，即转座子的3′-OH与靶DNA的5′-P 相连
④DNA聚合酶和DNA连接酶修复缺口
《位点特异性重组》课件
位点特异性重组的
03
应用
基因打靶
基因打靶是一种利用位点特异性 重组技术将外源基因定点整合到 靶细胞基因组的特定位置的方法
。
通过基因打靶技术，可以实现对 特定基因的敲除、替换或修饰， 以达到对细胞或生物体的遗传改
良。
基因打靶技术广泛应用于基因功 能研究、疾病治疗和生物育种等
领域。
基因治疗
1
位点特异性重组技术可用于基因治疗，通过将正 常的基因导入病变细胞并替换或修复缺陷基因， 以达到治疗疾病的目的。
详细描述
在转导型重组中，病毒DNA插入到宿主细胞基因组中，导致 基因的插入突变或基因组的重排。这种重组方式在病毒的传 播和进化中发挥重要作用，也是导致人类疾病的重要原因之 一。
转座子型重组
总结词
转座子型重组是指转座子在基因组内 自主复制和移动引发的DNA序列重排 的重组方式。
详细描述
转座子型重组涉及转座子的复制和移 动，导致DNA序列的重排和基因组的 变异。这种重组方式在生物进化、基 因组多样性和疾病发生等方面具有重 要作用。
应用
在基因工程、基因治疗、 基因组编辑等领域有广泛 应用。
位点特异性重组的
02
种类
整合型重组
总结词
整合型重组是指DNA片段从一个位置移动到另一个位置，与目标DNA整合为 一体的重组方式。
详细描述
在整合型重组中，DNA片段的移动通常涉及重组酶的作用，将DNA片段从原位 置切割并整合到新位置。这种重组方式在基因治疗和基因组编辑等领域有广泛 应用。
2
基因治疗是一种革命性的治疗方法，对于一些遗 传性疾病和罕见病具有显著的治疗效果。
3
基因治疗领域正在不断发展和完善，未来有望为 更多疾病提供有效的治疗方案。
高中生物第十一节：基因重组与基因转位——基因重组概念
课次：22教学目的：使学生了解重组的四种类型，了解位点特异重组和异常重组的特点，掌握同源重组的机制。
重点：同源重组的机制难点：同源重组的机制复习旧课：提问1人，了解教学效果。
导入新课：第九章遗传重组第一节概述DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组(genetic recombination)。
重组产物为重组体DNA (recombinant DNA) 。
DNA重组对生物进化起着关键的作用。
基因重组是指由于不同DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换和重新组合，形成新的DNA 分子的过程。
重组的类型：（1）同源重组(homologous recombination )：反应涉及到大片段同源DNA序列之间的交换。
其主要特点是需要RecA蛋白的介入。
（2）位点特异性重组（site-specific recombination）：重组发生在特殊位点上，此位点含有短的同源序列，供重组蛋白识别。
（3）转座重组（transposition recombination）：由转座因子产生的特殊的行为。
转座的机制依赖DNA 的交错剪切和复制，但不依赖于同源序列。
（4）异常重组分为两类，末端连接和链滑动。
其特征时重组对中很少或没有序列同源性，所以也称为非同源性重组。
第二节同源重组1 同源重组1.1 同源重组（homologous recombination）:发生在同源DNA序列之间。
1.2 特征-进行同源重组的基本条件：1）在交换区具有相同或相似的序列：涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大；单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号2）双链DNA分子之间互补碱基进行配对3）重组酶4）异源双链区的形成:涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程；存在重组热点。
e.g.：Euk.减数分裂时的染色单体之间的交换；细菌的转化，转导，接合，噬菌体重组同源重组是同源依赖性的，而非序列依赖性。
重组和转座32ppt课件
转座酶：transposase 解离酶：Resolvase
2． 非复制型转座 (nonreplicative transposition)
Nonreplicative transposition allows a transposon to move as a physical entity from a donor to a recipient site. This leaves a break at the donor site, which is lethal unless it can be repaired.
“We are sadly ignorant of the organization of the chromosome and of the possible types of changes in this that may occur to the chromosome as a whole or at the locus level”.
四、模板选择（copy choice）性重组
适用于RNA病毒，在这种重组中，聚合酶 从一个模板转换到另一个模板来合成RNA， 结果新合成的分子将含有两个不同亲本的遗 传信息
第二节 同源重组
第三节 转座（transposition）
一、原核转座子的类型
1.插入序列（insertion sequences , IS）: IS家族的结构：
靶DNA，再将转座子连接到靶DNA的凸出单链上，最后填 补空缺完成转座。
The direct repeats of target DNA flanking a transposon are generated by the introduction of staggered cuts whose protruding ends are linked to the transposon.
第七章遗传重组
图 23－8 Holiday 重组模型。
b
12
B 3’ 5’ 5’ 3’
3’ 5’ 5’ 3’
3’ 5’ 5’ 3’ 移动联会 3’ 5’
5’ 3’ 交叉连接
3’ 5’ 5’ 3 链交叉
B 3’ 5’ 5 3’
点移动
(8)
A
B
两臂旋转
b a
(9)
A
B
b a
(10)
A
B
A B
b a
(11) A
B
a
b
24
4、RecA蛋白的作用方式
RecA蛋白首先与单链DNA结合（约每分子可结合５个核苷 酸），形成一条DNA－蛋白质细丝（需消耗ATP），RecA 蛋白即被活化； 活化的RecA将双螺旋解旋和分离，同时试图将其结合的单 链与被解旋区域退火，如此继续，直到找到互补顺序。 一旦有一小部份被真正“退火”，ATP供应的能量就会继 续驱使配对反应趋于完成，其方向是５’→３’（单链部 分）。 新的杂交双链形成时，RecA蛋白即从原来的单链掉下来。
A
B
a
b
b a
A
b
a
B
A
b
a
B
图 23－8 Holiday 重组模型。
7）Holliday中间体拆分 （二次切断），可以有 两种情况： Holliday中间体二次切 割发生在原断裂的两条 单链上，称为非交换型 重组，双链中存在异源 区域(图10, 11, 12)； Holliday中间体二次切 割发生在另外两条单链 上，称为交换型重组 (图10’, 11’, 12’)。
25
26
RecA蛋白促进的各类DNA分子间的联会
参与联会的DNA分子可以 是多种不同的形态分子 的组合； 但无论那种组合，其中 一个分子是单链分子， 或者有足够长度的单链 区。
分子生物学第7章 DNA的重组与转座
7.2.1 λ phage DNA的整合与切除 1、实现机制：
均是通过---细菌DNA和λDNA上特定位点之间的重组
2、特定位点-----附着位点（attachment site att）
◘ 整合过程需要λ整合酶 （integrase Int）（λ编码）
和寄主的整合宿主因子IHF （integration host factor） 共同作用
◘ 整合后的附着位点为 attL（BOP’） attR（POB’）
溶菌周期 （lysis）
溶源性细菌 原噬菌体 (lysogen)
4、整合分子机制
5’
5’
b
3’
酶切
(8)
A
B
两臂旋转
b a
(9)
A
B
(3) 5’ A 3’ 3’ 5’ a
(4) 5’ A 3’ 3’ 5’ a
(5) 5’ A 3’ 3’ 5’ a
(6) 5’ A 3’ 3’ 5’ a
(7)
A
B 3’
5’
b
5’
b
3’
游离端移动联会
B 3’
(10)
A
5’
B
5’
b 3’ 游离端交叉连接
一、位点特异性重组（ site-specific recombination） 1、概念：发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间 的重组
噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组
2、特征：
在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接---产生精确的DNA 重排 都具有整合作用的两个基本特征
位点专一性重组的名词解释
位点专一性重组的名词解释位点专一性重组是一种基因工程技术，用于改变DNA的序列，以实现特定基因的修饰和定向转移。
它在生物医学和农业领域中具有重要的应用价值，并展示了巨大的潜力。
位点专一性重组的基本原理是利用特定酶切酶的特异性，将目标DNA片段切割成两段，并在切口处插入外源DNA片段，从而改变目标基因的序列。
这种重组技术可以用于基因敲除、基因修饰和基因添加等多种目的。
位点专一性重组最早是通过轮状病毒发现的，该病毒能够在RNA和DNA之间进行转录。
研究人员发现，轮状病毒在基因转移过程中会发生位点特异性的重组反应，从而启发了位点专一性重组技术的发展。
位点专一性重组技术的一个重要应用是基因敲除。
通过选择性地切割和修改目标基因的序列，可以引发基因沉默和功能丧失。
这为研究人员提供了一种方法，以研究基因功能和相关生物学过程的作用。
此外，位点专一性重组还可用于基因修饰，包括点突变、插入序列和基因互换。
这种技术允许研究人员针对特定基因进行精确的改变，以改变目标基因的表达模式或产生特定的表型。
位点专一性重组技术在农业领域也具有重要的应用。
通过修改农作物的基因序列，可以改善农作物的抗病性、耐逆性和产量。
这为农业生产提供了新的策略，以提高农作物的品质和产量，并减少对化学农药的依赖。
尽管位点专一性重组技术具有巨大的潜力，但其应用仍面临一些挑战和争议。
其中一个主要问题是技术的准确性和效率。
由于位点专一性重组是基于特定酶切酶的活性进行的，所以技术在特定位点的修饰和转移效率可能会有所差异。
此外，位点专一性重组的可能影响和风险也需要密切关注。
例如，基因转移过程中的不确定性可能导致意外的副作用和不可预测的结果。
因此，在使用位点专一性重组技术时，需要对其潜在风险进行全面的评估和管理。
总体而言，位点专一性重组技术在生物医学和农业领域中具有广泛的应用前景。
通过精确修改基因序列，可以为人们提供更多的治疗选择和农业生产的创新解决方案。
然而，随着技术的进一步发展和应用的扩大，我们也需要认识到其潜在风险，并采取适当的预防措施。
8-第八章--位点特异性重组与DNA的转座
反转录病毒生活周期
（2）反转录病毒基因组结构与功能
◆ 含有3-4个基因，实为编码区，每各编码区通过加工产 生多种蛋白（多聚蛋白），经酶切成为单一的蛋白质形 式。
◆反转录病毒mRNA通常结构，5 ’端加帽，3’端与polyA 相连。
◆全长的mRNA被翻译时，产物为gag和pol 蛋白。翻译 从第一个起始密码子开始而终止于第一个终止密码子， 产物为gag蛋白。表达pol 蛋白必需越过终止密码子，效 率为5%，因此，gag蛋白是gag-pol蛋白的20倍。
◆ 控制因子家族是通过这两种因子相互作用来划定 的。一个家族由单个类型的自主因子组成，这些因子 由很多种非自主因子相伴随。
◆ 玉米Ac-Ds系统的结构
☉Ac序列由含5个内含子的单个基因编码，其产物为转座酶， 末端有11bp的IR和8bp的DR。
☉Ds是由Ac缺失产生的，Ds9缺失194bp；Ds6只保留2Kb。 转座酶失活但保留完整的转座酶作用位点（包括末端）。
玉米色斑的形成
（2）玉米的控制因子家族
McClintock还发现了Spm-Dspm系统。每个家 族都有自主性因子和非自主性因子。
◆ 自主性因子有切离和转座能力。可插入任何位点 产生不稳定的或可“突变”（mutable）等位基因。自 主性因子的丢失，可使可变的等位基因变成稳定的等 位基因。
◆ 非自主性因子是稳定的，自身不能转座，来源于 失去反式作用功能的自主因子，而这种功能是转座所 必须的。
（2）P 因子
◆研究发现，杂种不育是由于在W位点插入P因子（P element）所致，P品系有P因子，M品系无P因子。
◆P因子长2.9 Kb ，有4个开放阅读框(ORF)，末端有 31bp反向重复序列，靶DNA产生8bp的正向重复序列。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
位点特异性重组我们可以看到，同源重组一般都在染色体内仍按DNA序列的原来排列次序。
但是在所谓位点特异性重组（site-specific recombination）中，DNA节段的相对位置发生了移动，从而得到不同的结果─DNA序列发生重排。
位点特异性重组不依赖于DNA顺序的同源性（虽然亦可有很短的同源序列），而依赖于能与某些酶相结合的DNA序列的存在。
这些特异的酶能催化DNA链的断裂和重新连接，它们能发动位点特异性重组作用.而在同源重组中，DNA链的切断完全是随机的，结果暴露出一些能与RecA这样的蛋白质相结合的顺序，从而发动交叉重组。
λ噬菌体DNA能通过重组作用整合进 E.coli染色体的特异位点，成为前病毒（provirus，或称前噬菌体，prophage）。
λ的整合作用有两个特点：①这种交换是可逆的，原先存在的DNA顺序全部被保存下来，并无丢失；②噬菌体和细菌的DNA之间有一段很短的同源序列，重组交换必须通过其中的一个特定的核苷酸。
这两个特点也就是位点特异性重组的共同特点。
一、λ噬菌体的整合（integration）λ噬菌体编码λ整合酶（integrase）。
这个酶能指导噬菌体DNA插入E.coli染色体中。
这种插入作用是通过两个DNA分子的特异位点进行重组，将两个环状DNA分子变成一个大环。
在噬菌体感染的早期即有大量整合酶产生，故几乎所有被感染的细胞都发生整合作用。
这种作用可用体外模型来进行实验。
用四种成份混合起来组成反应系统：纯的整合酶；来自 E.coli的一种辅助蛋白，称为整合作用宿主因子（IHF，integration host factor）；镁离子；和含有噬菌体和细菌DNA发生重组交叉的特异位点（称为attP和attB，att源自attachment）的DNA片段。
对于这个DNA片段，一个简单的制备方法就是人工构建含attP和attB两者质粒。
当整合反应发生时，即在attP和attB处发生交叉重组，产生两个较小的环状DNA。
整合反应由整合酶催化，其步骤是彼此偶联的：四条链同时被切断、交叉和重新连接起来，其间没有发现任何稳定的中间产物。
这种前文提到的拓扑异构酶Ⅱ的反应很相似，即DNA双链同时被切断，然后磷酸二酯键又重新连接起来，并不需要ATP供应能量。
故整合酶实际上能起拓扑异构酶的作用，可使带有att位点（或类似序列）的超螺旋松弛。
并且和拓扑异构酶一样，整合酶也产生交错的断裂（staggeredcut）:有七个核苷酸的单键尾端，形成所谓粘性末端。
整合酶和IHF在att上都有特定的结合位点，体外实验也证明这两种蛋白质结合在attDNA的特定位点上。
每一次重组过程需要20－40个整合酶分子及约70个IHF分子。
故可能这两种蛋白质不仅是作为酶（发挥催化作用），而且在每次重组中都要形成某种复合物结构。
通过缺失实验，证明attP至少要约250bp长，太短将使其功能丧失，而attB则较短，包括核心（core）在内约23bp长即有功能。
长250bp的整个attP可绕在整合酶分子的周围，类似核小体的结构，其中含有约8个整合酶的单体，每个的分子量约为40000。
attB和attP 中有相同的15bp的核心序列。
整合酶与两个核心都相结合。
如果两个核心中有一个的顺序有所改变，则重组的效率将大为降低。
但是如果两个核心序列发生了相同的改变，则顺序交换仍能进行。
可见整合酶不但要求特异的序列，而且要求两个核心序列有同源性。
然而，如果λ前病毒受到诱导（induction），则整合作用将被逆转。
此过程称为切出（excision）。
切出后，细菌和噬菌体DNA恢复至原来完整状态。
前病毒受到诱导时即产生又一种蛋白质，称为切出酶（excisionase）。
切出酶和整合酶一起催化前病毒DNA两端的杂种att位点之间的重组。
这时，整合酶和切出酶一同紧密结合在细菌前病毒杂种att位点上，显然这样就能促使反应向反方向进行。
λ噬菌体的整合和切出过程。
attB由称为BOB’的序列组成，而attP由POP'组成。
O是核心序列，是attB和attP所共同的。
而其两侧的序列是B，B’和P，P’，被称为臂。
噬菌体DNA是环状的，重组时被整合入细菌染色体中，成为线性序列。
前病毒的两侧是两个新的杂种att位点，左侧称为attL，由BOP’组成，而右侧为attR，由POB’组成。
可见，整合和切出并不涉及相同的一对序列：整合需要识别attP和attB，而切出要求识别attL和attR。
因此，重组位点的识别就决定了位点专一性重组的方向──整合或切出。
虽然位点专一重组是可逆的，但反应的方向取决于不同环境条件，这对决定噬菌体的生命力周期是非常性重要的。
整合的。
整合酶和IHF对整合和切出都是是必需的，而切出酶在控制反应方向上起重要作用──它对切出是必须的，但能抑制整合。
在切除的环化过程中如果发生错误，前噬菌体可能失去某些基因而代之以其相邻的细菌基因。
因为整合位点处于细菌染色体的gal和bio基因之间，切除过程中噬菌体DNA偶而会带走gal基因，生成λgal（或称λdb）。
λgal或λbio转导（感染）新的宿主时常常把gal或bio基因带到新的宿主中去，所以把λgal或λbio这些带有某些宿主基因的噬菌体称为转导噬菌体（transducing phage）。
二、基因的表达的调控如果一个DNA分子上两个特异位点之间发生重组，其后果有两种可能性：两个位点之间的节段或被丢失，或被颠倒。
有些生物能够利用这种重组倒置来控制基因的表达。
因为DNA的一正一倒两种排列法可以相应地表达两种不同的蛋白质，细胞就可根据需要作出选择。
奇怪的是，利用这种机制所调节的蛋白质往往都位于生物的体表。
例如噬菌体Mu的尾蛋白即由其可倒置的DNA节段gin所控制。
最著名的例子是沙门氏菌（如鼠伤寒沙门氏菌，Salmonellatyphimurium）的鞭毛抗原。
而锥虫（trypanosomes）的表面抗原更是千变万化，用以逃脱宿主免疫系统的攻击，这也是通过一系列DNA重排达到的，其复杂程度有点类似于抗体基因的结构。
沙门氏菌的位相是由于它的两种鞭毛蛋白质H1和H2的交迭表达。
在某一时期，菌体表达其中的一种，但从不两种均表达。
H2基因的启动子位于此基因近旁的一个970bp长的DNA节段（称为hin基因）上，在启动子两端各有一个14bp的反向重复序列（IRL和IRR）。
当两个反向位点之间进行重组交叉时，位点之间的节段将被颠倒。
这两个14bp的反向重复即可用作为核心序列进行位点特异性重组。
当此970bp节段朝向某一方向时，启动子即在H2基因的旁边，故H2基因即被转录。
同时，邻近一编码阻抑蛋白的基因亦被转录，产生的阻抑蛋白可抑制远方H1基因的表达。
因而结果是H2表达而H1不表达。
相反，如此970bp节段朝向另一方向，H2基因即不被表达，因为没有了启动子。
但同时H1的阻抑蛋白也不再表达，故H1遂得以表达。
这个hin基因编码的蛋白质称为Hin酶，此酶就是用以催化倒置（位点特异性重组）的。
有人认为，当细胞的生长受到阻碍时，Hin酶的表达就会增高，以便更换一种新的表面抗原。
噬菌体Mu中的类似系统位于其基因组的右端。
这个可倒置的G节段长约3kb，在不同的MuDNA中有不同的方向。
当噬菌体生长在 E.coliK12中的，感染是溶菌体的。
此时G节段的方向称为G（+）。
在节段前方的gin基因对G 节段的反向反应是必须的。
在噬菌体P1中也有一个类似的cin基因，对其C节段的反向反应是必须的。
G节段中的基因编码噬菌体吸附在菌细胞表面上所必须的蛋白质。
而G节段的方面控制着这些基因的表达。
其结果是G（+）和G （-）噬菌体对不同株 E.coli有不同的特异性。
在G（+）方向，基因S和U表达，其产物使噬菌体可吸附在 E.coliK12上，但不能吸附在 E.coliC上，反之，在G（-）方向，基因S’和U’表达，噬菌体可吸附在 E.coliC上，而不能吸附在 E.coliK12上。
各蛋白质的分子量为：S56000，U21000，S’48000，和U’26000。
一个特殊的发现是它们的综合长度（S＋U或S’＋U’）所需的编码序列大约要4kb长，要比G节段长得多。
这两套基因编码在DNA的两条互补链上，而它们的共同启动子则位于则位于反向区的左侧。
后者长度过短的解释是S和S’蛋白有一个共同的N端序列（Sc），Sc序列不由反向区编码。
而两者不同的C端序列Sv和S'v的表达则决定于反向区的方向。
U和U’基因则是独立编码的。
Mu噬菌体的gin和沙门氏菌的hin的功能相似，它们在体外实验中甚至可互相替代。
在 E.coli中也有一类基因，称为pin。
它能促使其邻接的约7800bp 长的DNA节段倒置。
在这个可倒置节段的两端有29bp长的反向重复。
现在尚不了解这个反应有何功能。
在体外亦可进行Gin或Hin介导的倒置反应，但还额外需要：①一个宿主编码的末知蛋白质和②底物DNA必须具有超螺旋。
另外，底物DNA上除重组位点外还要一段约60bp的DNA序列，这个序列可位于底物分子上任何部位（除了十分靠近重组位点外）。
此序列位置的任意性似乎与转录作用中的增强子类似，故有人称之谓重组增强子。