热诱导的位点特异性重组植物表达载体构建及烟草转化

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安全型转基因植物培育技术研究进展

植物遗传资源学报２００９，１０（４）：６０７—６１２ＪｏｕｍａｌｏｆＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃＲｅｓｏｕｒｃｅｓ安全型转基因植物培育技术研究进展高翔，别晓敏，余茂云，叶兴国（中国农业科学院作物科学研究所／农作物基因资源与基因改良围家重大科学工程／农业都作物遗传育种鼋点开放实验室，北京１０００８１）摘要：由于关系到转基因植物的产业化前景，安全型转基因植物培育越来越受到公众的关注。

在植物遗传转化体系中，绝大多数选择标记基因来源于细菌，对人类健康和环境安全存在潜在风险，因此无选择标记转基因植物培育受到科研工作者的高度重视。

本文综述了安全型转基因植物的培育途径，包括共转化系统、位点特异性重组系统、转座子系统、同源重组系统、不依赖于组织培养的简易转化技术及再生相关基因利用等技术，探讨了各种途径的优缺点。

以期推动安全型转基因植物培育和转基因植物产业化进程。

关键词：转基因植物；产业化；生物安全；选择标记ＡｄｖａｎｃｅｓｏｆＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｎｔｈｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＢｉｏｓａｆｅｔｙＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｌａｎｔｓＧＡＯＸｉａｎｇ，ＢＩＥＸｉａｏ—ｒａｉｎ，ＳＨＥＭａｏ—ｙｕｎ，ＹＥＸｉｎｇ—ｇｕｏ（ＮａｔｉｏｎａｌＫｅｙＳｃｉｅｎｃｅＦａｃｉｌｉｔｙｏｆＣｒｏｐＧｅｎｅＲｅｓｏｕｒｃｅｓａｎｄＧｅｎｅＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ／ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ／ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｑｉｎｇ１０００８１）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｐｌａｎｔｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ，ｔｈｅｖａｓｔｍａｊｏｒｉｔｙｏｆｔｈｅｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｇｅｎｅｓａｒｅｆｒｏｍｂａｃ－ｔｅｒｉａ，ｂｒｉｎｇｉｎｇｇｒｅａｔｔｈｒｅａｔｔｏｈｕｍａｎｈｅａｌｔｈａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．Ｓｏｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓａｎｄｂｒｅｅｄｅｒｓｈａｖｅｍａｄｅｇｒｅａｔｅｆｆｏｒｔｓｔｏｐｒｏｄｕｃｅｂｉｏｓａｆｉｙｏｒｍａｒｋｅｒ—ｆｒｅｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｃｒｏｐｓ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｔｈｅｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｂｉｏｓａｆｉｙｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｒｅｖｉｅｗｅｄ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＣＯ—ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｓｉｔｅ・ｓｐｅｃｉｆｉｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅｓｙｓｔｅｍ，ｈｏ—ｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ｓｉｍｐｌｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｆｓｅｌｅｃｔｉｏｎｍａｒｋｅｒｓａｎｄｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ—ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓ．Ｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｓａｎｄｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｔｈｅｓｅａｐｐｒｏａｃｈｅｓｗｅｒｅａｌｓｏｅｖａｌｕａｔｅｄｗｉｔｈａｖｉｅｗｔｏｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｅｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｐｌａｎｔｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ；Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ；Ｂｉｏｓａｆｅｔｙ；Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｍａｒｋｅｒ建立高效遗传转化体系是转基因技术的核心环节之一，选择标记基因的广泛应用虽然提高了获得转基因植物的效率，但由于选择标记基因大多属于编码抗生素或除草剂的抗性基因，随着选择过程的结束，这些外源选择基因在植物基因组中的存在和表达变的多余，且会随着转基因植物的繁育而遗传给子代，从而引发有关转基因植物安全的许多问题。

植物无标记转化的诱导表达Cre_loxP重组系统的构建A

收稿日期:2007212207基金项目:国家自然科学基金项目(30460081);新疆维吾尔自治区高等学校科研计划资助项目(X J E DU2005S15)作者简介:段小瑜(19822),女,中山大学博士研究生,专业方向为植物基因工程;e 2mail :dxyu324@ 。

通讯作者:马兵钢(19722),男,副教授,博士,从事园艺生物技术的研究;e 2mail :mbg agr @ 。

第26卷　第1期2008年2月石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University (Natural Science )V ol.26　N o.1Feb.2008文章编号:100727383(2008)0120030205植物无标记转化的诱导表达Cre/loxP重组系统的构建段小瑜,张录霞,马　超,郝青楠,马兵钢(石河子大学农学院,新疆石河子832003)摘要:应用Cre/loxP 系统位点专一性重组的特点构建诱导表达的定位重组系统,用以特异性的敲除转基因植物的标记基因。

为了获得诱导表达启动子,从大豆基因组DNA 中用pfu 酶克隆热激蛋白启动子gmhsp 17.5c ,将其克隆到pUC1182Hinc Ⅱ载体并测序。

结果表明,508nt 的gmhsp 17.5c 与已报道序列(G enBank ,AF544399)比较,核苷酸的同源性为99.8%。

利用该诱导启动子分别构建了含gmhsp 17.5c 2cre 基因组件和gmhsp 17.5c 2gus 基因组的诱导型植物表达载体pC23HC 和pC23HG 。

此外1个含有loxP 2gus 2loxP 组件的组成型植物表达载体pC23LG 被构建。

通过对3个植物表达载体做多重酶切及亚克隆后测序分析表明载体pC23HC 全长10947bp ,载体pC23HG 全长11396bp ,载体pC23LG 全长11900bp ,符合预期设计。

重组载体构建的方法和步骤

重组载体构建的方法和步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：重组载体是基因工程领域中的一个非常重要的技术手段，通过对DNA序列的重组，可以构建出具有特定功能的载体，进而实现对目标基因的操控和表达。

在生物学研究、新药开发、农业生产等领域都有着广泛的应用。

下面将介绍一下重组载体构建的方法和步骤。

一、选择载体和目标基因在进行重组载体构建之前，首先要选择适合的载体和目标基因。

一般来说，选择的载体应该具有良好的表达性能和较高的复制稳定性，常用的载体有质粒、病毒等。

而目标基因则应该是我们需要研究或者操控的基因，例如编码重要酶类、蛋白质、抗性蛋白等。

二、获取目标基因目标基因的获取可以通过多种方式，包括PCR扩增、基因合成、基因克隆等。

其中PCR扩增是最为常用的方法，通过设计引物，可以在DNA模板上扩增出目标基因的片段，然后进行纯化和检测，确保其纯度和完整性。

三、线性化载体将选择的载体进行线性化处理，通常是通过限制性内切酶将载体切割成线性片段，以便于后续的连接和转化。

线性化后的载体需要经过纯化和鉴定，确保其完整性和纯度。

四、连接目标基因和载体将目标基因和线性化载体连接起来，一般通过DNA连接酶催化反应实现。

连接时需要考虑目标基因和载体的互补性，以确保连接的正确性和稳定性。

连接后的重组载体需要经过转化操作，将其导入到宿主细胞中。

五、转化宿主细胞将构建好的重组载体导入到宿主细胞中，通常通过化学法、电击法、病毒介导等方式实现。

转化后的宿主细胞需要进行筛选、鉴定和培养，确保其稳定表达目标基因，并能够满足后续实验和研究的需要。

六、鉴定和验证对构建好的重组载体进行鉴定和验证是非常重要的一步，可以通过PCR、限制性酶切割、测序等方法进行验证。

同时也需要进行功能性和表达性的分析，确保重组载体的构建是成功的，能够稳定地表达目标基因。

七、应用和拓展构建好的重组载体可以应用于多个领域，如基因治疗、转基因作物、蛋白质表达等。

同时也可以通过改进和拓展构建方法，提高载体的稳定性和表达效率，开拓更广阔的应用领域。

人教版高中生物选择性必修第3册精品讲义 3.2 基因工程的基本操作程序(教师版)

3.2 基因工程的基本操作程序教学目标教学重点1.基因工程基本操作程序的四个步骤。

2.DNA 片段的扩增及电泳鉴定。

教学难点1. 利用PCR 获取和扩增目的基因。

2. DNA 片段的扩增及电泳鉴定。

知识点01 第一步：目的基因的筛选与获取1.目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。

也指能够编码特定蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用课程标准目标解读基因工程是一种重组DNA 技术。

1. 阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤。

1. 阐明基因工程的原理和基本操作程序。

2. 针对人类生产或生活中的某一需求，选取适当的基因工程的技术和方法，尝试设计获得某一转基因产品的方案。

3. 尝试进行PCR 的基本操作并用电泳鉴定PCR 的产物。

知识精讲目标导航的因子。

2.筛选目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选，是较为有效的方法之一3.获取目的基因：（1）人工合成（2）基因文库中获取目的基因（3）利用PCR获取和扩增①PCR：PCR全称为聚合酶链式反应，又叫做体外DNA扩增技术。

根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。

通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因。

②PCR利用的原理：DNA半保留复制③DNA复制的基本条件：④PCR的前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。

⑤PCR的条件：DNA模板（需含有目的基因）。

分别与模板DNA相结合的2种引物。

四种脱氧核苷酸（或四种dNTP：dATP、dTTP、dGTP、dCTP）。

耐高温的DNA聚合酶(Taq酶）。

稳定的缓冲溶液（一般添加Mg2+）。

能严格控制温度的温控设备。

⑥PCR的过程：⑦PCR的结果：以指数方式扩增，即2n（n为扩增循环的次数）⑧鉴定PCR的产物：常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定产物知识点02 第二步：基因表达载体的构建基因表达载体的组成：目的基因、标记基因、启动子、终止子基因表达载体构建过程：一般用同一种限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再用DNA连接酶将两者连接。

某大学生物工程学院《生物化学》考试试卷(1174)

某大学生物工程学院《生物化学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、判断题（95分，每题5分）1. 与顺式作用元件和RNA聚合酶相互作用的蛋白质称为反式作用因子。

（）答案：正确解析：2. 蛋白质合成过程中，mRNA由3′端向5′端进行翻译。

（）答案：错误解析：3. 在丙酮酸经糖异生作用代谢中，不会产生NAD＋。

（）答案：错误解析：丙酮酸经糖异生作用代谢的总反应为：2丙酮酸＋4ATP＋2GTP ＋2NADPH＋6H2O→葡萄糖＋4ADP＋2GDP＋Pi＋2NAD＋＋2H＋，可产生NAD＋4. 5氟尿嘧啶核苷酸是尿嘧啶核苷酸的类似物，在体内作为胸腺嘧啶核苷酸合酶的竞争性抑制剂而抑制胸腺嘧啶核苷酸的合成。

（）答案：错误解析：5. ATP是果糖磷酸激酶（PFK）的别构抑制剂。

（）答案：正确解析：ATP是果糖磷酸激酶（PFK）的底物，也是别构抑制剂。

在PFK上有两个ATP结合位点：底物结合位点和调节位点。

在ATP浓度高时，ATP除了与位点1结合外，还可以与位点2结合，使酶构象发生改变，降低酶活力。

6. 己糖激酶的底物包括葡萄糖、甘露糖和半乳糖。

（）答案：错误解析：半乳糖不是己糖激酶的底物。

7. DNA连接酶可以连接单独存在的两条DNA单链。

（）[暨南大学2019研]答案：错误解析：DNA连接酶是催化双链DNA或RNA中并列的5′磷酸和3′羟基之间形成磷酸二酯键的酶。

单链合成双链需要形成氢键。

8. 尽管ATP在细胞内的含量很少，但周转率很高。

（）答案：正确解析：9. 沿糖酵解途径简单逆行，可从丙酮酸等小分子前体物质合成葡萄糖。

（）答案：错误解析：10. 蛋白质翻译一般以AUG作为起始密码子，有时也以GUG为起始密码子，但以GUG为起始密码子，则第一个被掺入的氨基酸为Val。

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ｉｎＡｒｉｄＡｒｅａｓ，ＳｈａａｎｘｉＹｎｇａｌｉｎｇ７１２１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｓｅｃｕｉｔｒｙｐｒｏｂｌｅｍｆｏｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｇｅｎｅｓｈｓａｂｅｃｏｍｅｏｎｅｏｆｔｈｅｉｍｐｏ￣ｎｔａｆａｃｔｏｒｓｌｉｍｉｔｉｎｇｔｈｅｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｐｌｎｔａａｔｉｏｎｆｏｔｒａｎｓ・
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热诱导的位点特异性重组植物表达载体构建及烟草转化
徐广博，李政，赵惠贤，刘香利，赵洁，刘丹，吴静
（１．西北农林科技大学生命科学学院，陕西杨陵７１２１００；２．旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨陵７１２１００）
中图分类号：Ｓ５７２文献标识码：Ａ
ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＰｌａｎｔＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒｗｉｔｈＨｅａｔＳｈｏｃｋＩｎｄｕｃｅｄＣｉｎＨ／ＲｓＳｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｉｃｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍａｎｄＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＮｉｃｏｔｉａｎａＴａｂａｃｕｍ
ｔｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｎｉｃｏｔｉａｎａａｂｔａｃｕｍｍｅｄｉａｔｄｅｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ．ｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌｎｔａｓｗｅｒｅ
摘
要：选择标记基因安全性问题是限制转基因植物商品化种植的重要因素。为了从转基因后代中诱导性剔除选择标记基因，本
研究克隆了拟南芥热激蛋白Ｈｓｐｌ８．２基因启动子，并构建了Ｈｓｐｌ８．２启动子诱导表达的ＣｉｎＨ／Ｒｓ位点特异性重组删除植物表达
ｇｅｎｉｅｐｌｎｔａｓ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｄｅｌｅｔｅｔｈｅｍａｒｋｅｒｇｅｎｅｓｆｒｏｍｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌｎｔａｓ，ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｆｏＨｓｐｌ８．２ｈｅａｔｓｈｏｃｋｅｄｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ａｎｄｈｅｔｐｌｎｔａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｏｆｈｅａｔｓｈｃｋｏｉｎｄｕｃｄｅＣｉｎＨ／Ｒｓｓｉｔｅ — ｓｐｃｉｅｉｆｃｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗ船ｃｏｎｓｔｒｕｃ —
２０１３年２６卷５期
Ｖ０Ｌ２６Ｎ５
西
南
农
业
学
报
１７９５
ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＣｈｉｎａＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
文章编号：１００１ ห้องสมุดไป่ตู้ ４８２９（２０１３）０５—１７９５— ０６
载体。结果表明，利用农杆菌介导法进行了烟草转化，转化后的烟草经过除草剂筛选和ＰＣＲ检测，得到转基因阳性植株。本研究
为利用位点特异性重组建立擅物无标记基因转化体系奠定了基础。关键词：位点特异性重组；热诱导；Ｈｓｐｌ８．２启动子；选择标记基因