放射配体受体结合试验方法与技术
受体配体结合研究
受体配体结合研究受体配体结合是生物学和药物学领域重要的研究方向之一、受体是细胞膜表面或细胞质内的蛋白质，具有识别和结合特定配体的能力。
配体通常是小分子化合物，如药物或激素，它们通过与受体结合，触发一系列信号传导途径，从而影响细胞的功能和生理过程。
最早的受体配体结合研究是通过体外实验，例如配体结合实验、放射性配体标记和配位化学等。
这些实验可以测量配体与受体之间的亲和力和结合常数，以及分析受体的配体结合位点和结构。
这些技术对于确定配体与受体之间的相互作用非常有帮助，但是它们无法提供有关具体的结合机制和动力学信息。
随着分子生物学和生物化学技术的迅速发展，如克隆、表达和纯化受体蛋白以及X射线晶体学等，科学家们能够研究配体与受体之间的分子相互作用。
例如，利用蛋白质晶体学技术，科学家们可以解析受体蛋白的三维结构，并确定配体结合位点和相互作用。
通过这些实验方法，研究人员可以深入了解配体与受体之间的分子结构和机制，为药物设计和发展提供重要的信息。
近年来，结构生物学、生物物理学和计算生物学等领域的快速发展，为受体配体结合研究提供了新的技术和方法。
例如，通过成像技术（如活体成像、原位荧光染色），科学家们可以观察受体与配体之间的动态相互作用过程。
同时，分子动力学模拟和计算机模拟等方法也被广泛应用于研究受体配体结合的动力学和热力学特性，以及预测和设计新的配体。
此外，近年来出现了一种新的研究方法，即细胞荧光成像。
这种技术可以通过荧光标记受体和配体，实时观察受体与配体在活细胞中的相互作用。
这种方法可以为单个分子级别的受体配体结合提供直观的图像信息，有助于我们更好地理解细胞中的信号传导过程。
总之，受体配体结合研究在生物学和药物学中具有重要意义。
通过对受体与配体之间相互作用的深入研究，我们可以揭示生物体内的信号传导机制，开发新的药物和治疗方法。
同时，随着新技术和方法的不断出现，我们相信受体配体结合研究将会进一步深入，为人类的健康做出更大贡献。
受体与配体结合试验的测定方法
受体与配体结合试验的测定方法直接测定法：1. 放射性同位素法（Radioligand Binding Assay）：这种方法通过使用放射性同位素标记的配体来测定受体与配体结合的情况。
标记的配体包含一种放射性同位素，如3H或125I。
实验中，将放射性标记的配体加入到含有受体的体外反应体系中，然后通过测定结合与非结合配体的量来计算受体与配体的结合亲和力。
这种方法常用于研究受体的亲和力、结合位点及受体的浓度。
2. 荧光共振能量转移法（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）：FRET基于两个荧光标记的分子之间的能量转移。
通过在受体和配体的分子中标记荧光染料，并在荧光染料的发射和捕获波长上进行测量，可以确定受体和配体之间的相互作用及结合状态。
这种方法的优势是能够在活细胞或组织中进行实时监测。
间接测定法：1. 生物活性测定法（Bioassay）：这种方法通过研究受体与配体结合后的生物学效应来间接测定受体与配体的结合情况。
例如，可以通过测定细胞增殖、酶活性、信号传导通路等生物学效应来评估受体与配体之间的结合情况。
这种方法的优势是可以直接测定受体配体的生物学活性，但缺点是无法精确测定结合亲和力。
2. 反应动力学分析法（Kinetic Analysis）：这种方法通过测定受体与配体结合过程中的动力学参数来间接测定结合情况。
例如，可以使用BIAcore系统等生物传感器技术来实时监测受体和配体之间的结合和解离过程，并从中得到结合速率常数、解离速率常数等动力学参数。
这种方法的优势是可以测定结合反应速率和平衡常数，但需要专门的仪器设备。
此外，还有一些衍生的测定方法，如表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）、放大荧光极化法（Amplified Fluorescent Polarization Assay, AFP）等，这些方法广泛应用于生物医学研究中。
配体与受体结合的原理方法
配体与受体结合的原理方法配体与受体结合是生物学、化学以及药学领域中的一个重要概念。
配体是指能与受体发生结合的分子或离子，受体则是能与配体相互作用的分子、蛋白质或其他生物大分子。
配体与受体之间的结合是通过一系列物理化学过程进行的，其原理和方法可以从多个角度来分析和理解。
下面将从结构、亲和力以及特异性等方面对此进行具体阐述。
首先，分子结构是影响配体与受体结合的关键因素之一。
配体与受体通常具有互补的空间构型，即彼此之间的结构要具有一定的相容性。
例如，酶和底物之间的结合需要底物与酶的活性中心相互匹配，而荷尔蒙与受体之间的结合则需要荷尔蒙与受体的结合位点具有相应的结合特异性。
因此，配体与受体结合需要分子的结构适配性。
其次，亲和力也是影响配体与受体结合的重要因素之一。
亲和力是指配体和受体之间相互作用的强弱程度。
需要注意的是，亲和力不是单一因素的结果，它受到多种相互作用力的综合影响。
例如，范德华力、氢键、离子键以及静电作用等都可以对配体与受体结合的亲和力产生影响。
相互作用力的强弱取决于配体和受体之间的距离、电荷分布、电子云的偏移以及溶剂的情况等。
通过调节这些因素，可以改变配体和受体的亲和力，从而影响它们的结合能力。
此外，配体与受体之间的结合也具有特异性。
特异性是指配体与受体之间的结合是高度选择性的。
不同的配体可以通过调节它们的结构和化学性质来与特定的受体相互作用。
例如，药物的研发常常依赖于找到与特定疾病相关的受体，并设计具有特定结构和功能的分子来与之结合。
通过特异性的配体与受体结合，可以实现精确的调控和干预，从而产生期望的生物效应。
为了研究和分析配体与受体的结合过程，科学家们通常利用一系列方法和技术。
其中，表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）是一种常用的实验技术。
利用SPR技术，可以实时监测并测量配体与受体之间的结合过程。
通过观察结合曲线的变化，可以了解到配体与受体之间的结合动力学参数，如亲和力常数、结合速率常数以及解离速率常数等。
受体占有率计算方法
受体占有率计算方法
实验测定方法：
1.放射性配体结合实验：使用具有放射性标记的配体，将其与受体结合，然后通过放射性技术测定结合配体的比例。
例如，可以使用放射性标
记的配体与脑组织中的特定受体结合，然后通过放射性液体闪烁计数仪测
定被结合的放射性配体的比例。
2.免疫组化实验：使用特异性抗体与受体结合，然后通过免疫组化技
术测定结合受体的比例。
例如，可以使用与受体特异性的抗体结合，然后
通过免疫染色技术测定结合抗体的比例。
计算模拟方法：
1.分子对接模拟：使用计算机软件模拟配体和受体分子之间的结合过程，从而得到配体在受体位点上的占有率。
这种方法基于物理化学的原理、配体和受体的结构以及它们之间的相互作用能。
通过计算模拟可以预测出
不同配体的占有率，并进行比较分析。
2.分子动力学模拟：使用计算机软件模拟配体和受体分子之间的运动
和相互作用过程，从而得到受体位点上受体分子的占有率。
这种方法基于
牛顿运动定律和分子间力学的相互作用原理。
通过模拟配体和受体分子的
运动轨迹，可以计算出受体占有率。
受体占有率的计算对于理解配体和受体相互作用的机理、评估药物的
活性以及设计新的药物具有重要意义。
因此，受体占有率的准确计算方法
对于药物研发和设计具有重要的指导意义。
不同的方法在不同的实验条件
下会有一定的误差，因此在实际应用中需要综合考虑多种方法的结果进行
分析和判断。
受体配体简
24
1. 单点法实验的数据处理
通常是计算饱和区的受体密度， 通常是计算饱和区的受体密度，即受体最大结合容量 （maximum binding capacity，Rmax）。 ， ）。 受体密度的表示方式有以下几种： 受体密度的表示方式有以下几种： 胞浆胞膜等的受体含量： 蛋白； ① 胞浆胞膜等的受体含量：fmol/mg蛋白； 蛋白 胞核的受体含量： ② 胞核的受体含量：fmol/mgDNA； ； 完整细胞受体的含量：结合位点/cell（site/cell）或 ③ 完整细胞受体的含量：结合位点 （ ） fmol/106细胞。 细胞。
由式（ ）整理可得： 由式（1.1）整理可得 KD ＝ [RT-RL][L] [RL] 将上式整理可得： 将上式整理可得 [RL] = [RT] － 1_ × [RL] [L] KD KD
16
以复合物浓度[RL]为横坐标，以复合物浓度和游 为横坐标， 以复合物浓度 为横坐标 离配体的浓度比值[RL]/[L]为纵坐标作图，即为 为纵坐标作图， 离配体的浓度比值 为纵坐标作图 Scatchard作图。 作图。 作图 简单单位点系统Scatchard作图为一条直线，斜 作图为一条直线， 简单单位点系统 作图为一条直线 ），横轴截距为 率为 -（1/KD），横轴截距为 （ ），横轴截距为[RT]，纵轴截距为 ，纵轴截距为[RT]/ KD（见图 ）。 （见图3）。
5
RBA的应用 的应用
神经递质 激素和药物等的作用机制 疾病的病因和发病机制 新药设计和药物筛选 受体显像与受体介导治疗
6
二、概 述
1. 受体的分类 类(class) 膜受体 核受体 亚类（subclass） 型 (type) 亚型 (subtype)
7
2. 受体与配体结合的基本特点
受体的放射配体结合分析法
受体的放射配体结合分析法第⼋章受体的放射配体结合分析与应⽤第⼀节概述受体（receptor）是细胞膜上或细胞内的⼀些能与⽣物活性物质相互作⽤并引起特异性⽣物效应的蛋⽩质。
受体与配体结合后，通过受体特定的信号传递系统，引起细胞的特定反应，是⾼等动物适应环境、协调机体各种细胞功能的关键性分⼦。
⽤放射性核素标记的配体（radioligand）与相应的受体进⾏特异结合反应，从⽽对受体进⾏定性和定量，此即为受体的放射配体结合分析法（radioligand binding assay of receptors, RBA）。
定量的RBA是在已知配体与受体反应的基础上，通过结合反应得知⼀定量的组织或细胞能与该放射性配体结合的受体数，称结合位点数（number of binding sites）。
亲和⼒则以平衡解离常数表⽰。
定性RBA 则通过反应量效关系、某些参数的变化等判断受体的类型、单位点或多位点系统、受体与配体相互作⽤的特点等。
RBA出现前，虽然提出了受体的⼀些基本概念，如配体占领学说、激动剂和拮抗剂、配体结合反应的质量作⽤定律等，但对受体的研究主要靠观察受体激动剂或拮抗剂的⽣理效应或药理效应。
20世纪60年代，由于放射性探测的灵敏度⾼、核素标记物不改变配体的构型，可⽤来直接观察配体在亚细胞组分中的分布，并进⾏精确定量。
RBA使受体的研究从间接观察进⼊了直接观察，从宏观进⼊微观，许多不易或⽆法⽤⽣理（或药理）效应进⾏观察的受体得以精确定量，并进⽽对受体分⼦进⾏纯化，分析结构。
受体的研究从20世纪70年代已经扩展到了神经递质、激素、细胞因⼦的作⽤机制、细胞⽔平的调控机制、疾病的发病机制及疾病的诊断等⽅⾯，渗透到了许多学科领域，受体的研究进⼊了分⼦⽣物学⽔平。
⾃20世纪80年代以来，随着新技术、新⽅法的应⽤，受体的研究取得了长⾜的进展。
例如，利⽤基因克隆技术测定受体分⼦的⼀级结构，上百种受体的氨基酸序列得以阐明，测出某种受体的不同亚型在氨基酸序列上的差别，为受体亚型的确定奠定了基础；⽤点突变技术确定受体结合位点在分⼦中的位置；利⽤单克隆抗体、荧光和酶等⾮放射性标记物来定位受体，丰富了受体的研究⽅法。
放射性配体与受体结合分析实验方法
放射性配体与受体结合分析实验方法放射性配体与受体结合分析方法（Radioligand Binding Assay，RBA）是一种常用的生物化学实验方法，用于研究受体与其配体之间的结合亲和性和数量。
该方法通过标记配体的放射性同位素来实现，可以精确测定受体与配体之间的亲和力。
RBA方法的原理是将受体样品与放射性标记的配体一起孵育，使二者发生结合。
非结合的配体随后通过洗涤的步骤去除，然后测定剩余的结合复合物中的放射性信号。
根据放射性信号的强度，可以计算出受体与配体结合的比例和结合亲和力。
RBA方法需要一些实验材料和设备，包括放射性标记的配体、受体样品、未标记的配体（用于测定非特异性结合）、放射性检测设备（例如放射计或闪烁计数器）以及用于孵育和洗涤的缓冲液。
实验步骤一般包括以下几个关键步骤：1.准备标记配体：将配体与放射性同位素结合，这通常涉及到将配体与放射性同位素联结的化学反应。
常用的放射性同位素包括^3H（氚）和^125I（碘）等。
此步骤需要进行放射性安全操作。
2.孵育样品：将受体样品与标记配体一起在适当的缓冲液中孵育。
孵育条件（温度、时间等）需根据具体受体和配体的特性进行优化。
3.洗涤步骤：通过洗涤去除未结合的配体。
洗涤步骤可以进行多次，以确保只保留结合复合物。
这一步骤是为了去除非特异性结合而采取的，可以使用高浓度的未标记配体等进行竞争性结合。
4.结合复合物的测定：将洗涤后的样品放入放射性检测设备中，测定放射性信号的强度。
放射性信号的强度与结合复合物的量成正比，可以通过标准曲线或计算公式来计算受体与配体的结合亲和力。
RBA方法具有一些优点和应用前景。
首先，该方法可以在体外定量测定受体与配体之间的结合亲和力。
这对于研究生物体内的受体配体相互作用具有重要意义。
其次，该方法具有高灵敏度，能够测定非常低浓度的受体或配体。
此外，RBA方法还可以用于筛选新药物的受体结合亲和性，以及衡量药物对受体的亲和力的影响。
受体和配体相互作用的研究进展
受体和配体相互作用的研究进展在生物医学领域的研究中，受体和配体相互作用的研究一直是一个热门的话题。
受体是一种蛋白质或其他分子，它们在细胞膜上或细胞内通过与分子配体结合发挥生物活性。
有很多不同类型的受体，例如G蛋白耦联受体、酪氨酸激酶受体和离子通道受体等。
而配体是受体结合的小分子，它们可以是内源性的（例如激素、神经递质或代谢产物等），也可以是外源性的（例如药物或毒素等）。
受体和配体之间的相互作用在生物学中扮演着至关重要的角色。
在药物研发中，通过针对受体的变异和调节配体活性，可以研制出新型的药物。
因此，对于受体和配体相互作用的研究具有重要的理论和应用价值。
本文将讨论受体和配体相互作用的研究进展。
一、受体和配体相互作用的研究方法受体和配体相互作用的研究早期主要依赖生物化学和药理学方法。
例如，利用受体溶液和放射性标记的配体，并在放射计数器中测量其结合，可以获得配体与受体的结合亲和力和结合容量等信息。
这种方法可以通过竞争性结合实验研究不同配体的选择性和特异性。
然而，这种方法需要大量的蛋白质样品，并且可能会出现非特异性结合和标记假阳性等缺点。
近年来，科学家们开发了许多新的研究方法，来研究受体和配体相互作用。
其中最重要的一种方法是晶体学。
晶体学是一种利用蛋白质晶体的X射线衍射模式来确定受体的结构的方法。
通过X射线衍射模式，科学家可以了解蛋白质的三维结构，以及其与配体结合的模式。
这种方法对于药物设计来说尤为重要，因为它可以帮助研究人员了解药物如何结合并激活或抑制受体，并为新药开发提供有力的支持。
另一种方法是计算机模拟。
计算机模拟可以在不需要大量蛋白质样品的情况下，对受体和配体相互作用进行研究。
通过计算机模拟，科学家可以预测配体和受体之间的相互作用方式，从而指导药物设计和开发。
该方法与实验相结合，可以有效地提高受体和配体相互作用的研究效率和准确性。
二、受体和配体相互作用在药物研发中的应用在药物研发中，受体和配体相互作用的研究是非常重要的。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第五节放射配体受体结合实验方法与技术
一、基本概念
1、受体（receptor）一类介导细胞信号转导的功能蛋白质，可与周围环境中微量化学物质发生特异性结合，通过信息放大系统，触发后续的生理或药理效应。
2、配体（ligand）能与受体特异结合的物质，如神经递质、药物或激素等。
3、判断受体的标准真正的受体必须具备：饱和性、特异性、可逆性、高亲和性、结构专一性、立体选择性、区域分布性、亚细胞或分子特征、有内源性配体等。
4、受体的基本分类化学门控离子通道受体；G蛋白耦联受体。
5、受体调节的方式
1）共价调节（covalent modification）尤其是蛋白磷酸化反应在受体的脱敏过程中起了非常重要的调节作用。
以乙酰胆碱受体为例，细胞内c AMP升高所引起的蛋白磷酸化可使乙酰胆碱受体对乙酰胆碱的脱敏速度增加8～10倍。
2）非共价调节（non-covalent modification）影响受体功能的非共价调节机制包括①膜电位的变化；②机械性改变受体的分布（斑片钳技术）；③受体和其他膜蛋白（如G蛋白）或某些小配体（阴离子，阳离子，核苷酸）之间的变构影响；④膜脂质环境的改变等。
3）协同性调节（coordinate regulation）已知不同受体可含有同源受体区如胰岛素受体和上皮生长因子-抗溃疡素受体中的酪氨酸激酶区。
由此可推测一种受体被激活后可能通过一共同密码（code）来调节同一细胞上的其他许多受体。
4）链锁反应（receptor cascades）另外一种可能的调控机制，即一个受体被激活之后，可能会释放一种细胞外信使，激活第二个细胞表面受体。
称之为放大性的链锁反应。
二、放射配体结合法的应用领域
1、阐明药物作用机制；
2、新药设计和药物筛选；
3、探讨疾病的病因、发病机理，提高临床合理用药和诊断水平；
4、测定组织或血液中药物浓度；
5、探寻新的受体、受体亚型和内源性配体。
三、放射受体结合实验技术简介
1、放射配体的选择需要非常高的选择性，并要求与靶受体有很高的亲和性，解离常数最好小于10nmol/L，还要考虑配体的生物学以及生物化学特征。
拮抗剂性配体必须能阻断激动剂与靶受体结合引起的生物学效应。
放射性受体结合试验中，最常用的放射性同位素是氚，[3H]配体的主要优点是氚化过程不影响配体的生物活性，使用较安全，其信号必须用闪烁技术加以放大。
放射配体的另一个重要特性是特异性结合与非特异性结合的比率，理想的配体应有不少于99%的特异性结合。
2、组织的选择和制备用于放射受体结合试验的理想的组织应含有高密度的靶受体和低密度的与配体非特异结合的受体。
用于放射受体结合试验的组织可取自脑、外周组织、天然表达或移植受体的细胞株等。
3、缓冲液最常用的缓冲液是50mmol/L，PH为7.4的Tris-Cl的缓冲液；重碳酸盐、磷酸盐和HEPES缓冲液亦可用于结合试验。
4、非特异性结合的测定非特异性结合的测定原理是加入大量的对靶受体具有药理活性的并可使受体饱和的非放射性配体。
特异性结合量是指配体与靶受体结合量，可由总结合量中减去非特异性结合量求出。
5、孵育条件结合实验应该用能产生最大特异结合和适宜的孵育条件。
需要经过大量的实验才可摸索出最佳的测定条件。
6、放射配体-受体复合体与游离放射配体的分离
最常用的最有效的分离方法是过滤，结合试验中最常用的滤纸是玻璃纤维滤纸。
通常用2～5ml冷缓冲液冲洗2～3次就足够了。
过滤完成后，滤纸置于盛有闪烁液的闪烁瓶中进行液闪测定。
当放射配体解离较快时，可用离心的方法将放射配体-受体复合物从游离配体中分离出来。
其它方法还有：凝胶过滤色谱法、凝胶过滤透析术、免疫沉淀法等。