放射配体受体结合方法与技术
受体配体结合研究
Lineweaver-Burk图
3.1 单位点受体与配基结合反 应的数学表达
设：[LT]是总配基浓度, [L] = [LT] – [RL], 将 [L] = [LT] – [RL] 和 [R] = [RT] – [RL]代入(2)式， 经整理得： 2 [ RL] [ RL]{[ RT ] [ LT ] K } [ RT ][ LT ] 0 （6） d
k1 k2
[RL]
根据质量作用定律，结合反应速率为 v1= k1[R][L], 解离反应速率为 v2= k2[RL] 当反应达到平衡时, v1= v2，所以
k 2 [ R][ L] Kd k1 [ RL]
（1）
[R]、[L]、[RL]分别为游离受体、游离配基、受体-配基复 合物的摩尔浓度 k1、k2分别是结合速率常数、解离速率常数 Kd 是解离平衡常数，单位为mol/L; Kd 值的大小作为衡量 配基与受体相互结合能力的一个重要物理量: Kd值愈小结 合能力愈大; Kd又称为亲和常数
3.1 单位点受体与配基结合反 应的数学表达
设：[RT]为受体的初始浓度
[ R] [ RT ] [ RL]
Kd
[ R][ L] {[ RT ] [ RL]}[ L] [ RL] [ RL]
（2）
重排并整理得：
（3） 上式即Scatchard方程 ，以[RL]/[L]为纵轴，以[RL] 为横轴作图得一直线 直线斜率为-1/Kd, 横轴截距为[RT], 纵轴截距为 [RT]/Kd
受体配体结合研究
受体配体结合研究受体配体结合是生物学和药物学领域重要的研究方向之一、受体是细胞膜表面或细胞质内的蛋白质，具有识别和结合特定配体的能力。
配体通常是小分子化合物，如药物或激素，它们通过与受体结合，触发一系列信号传导途径，从而影响细胞的功能和生理过程。
最早的受体配体结合研究是通过体外实验，例如配体结合实验、放射性配体标记和配位化学等。
这些实验可以测量配体与受体之间的亲和力和结合常数，以及分析受体的配体结合位点和结构。
这些技术对于确定配体与受体之间的相互作用非常有帮助，但是它们无法提供有关具体的结合机制和动力学信息。
随着分子生物学和生物化学技术的迅速发展，如克隆、表达和纯化受体蛋白以及X射线晶体学等，科学家们能够研究配体与受体之间的分子相互作用。
例如，利用蛋白质晶体学技术，科学家们可以解析受体蛋白的三维结构，并确定配体结合位点和相互作用。
通过这些实验方法，研究人员可以深入了解配体与受体之间的分子结构和机制，为药物设计和发展提供重要的信息。
近年来，结构生物学、生物物理学和计算生物学等领域的快速发展，为受体配体结合研究提供了新的技术和方法。
例如，通过成像技术（如活体成像、原位荧光染色），科学家们可以观察受体与配体之间的动态相互作用过程。
同时，分子动力学模拟和计算机模拟等方法也被广泛应用于研究受体配体结合的动力学和热力学特性，以及预测和设计新的配体。
此外，近年来出现了一种新的研究方法，即细胞荧光成像。
这种技术可以通过荧光标记受体和配体，实时观察受体与配体在活细胞中的相互作用。
这种方法可以为单个分子级别的受体配体结合提供直观的图像信息，有助于我们更好地理解细胞中的信号传导过程。
总之，受体配体结合研究在生物学和药物学中具有重要意义。
通过对受体与配体之间相互作用的深入研究，我们可以揭示生物体内的信号传导机制，开发新的药物和治疗方法。
同时，随着新技术和方法的不断出现，我们相信受体配体结合研究将会进一步深入，为人类的健康做出更大贡献。
受体放射自显影术2
试验主要点
2 冷冻切片机 （1）由冷冻机与切片室组成。最低温度可调至-25℃ 或-30℃，一般在-20 ~ -15℃时较易切片。 （2）切片厚度可调，由数微米至数十微米。 （3）切片刀上附有可移动的防卷板，裱片时将其移开， 切片保留在切片刀上。 （3）根据标本块的大小，一张载玻片上可裱贴2-3张。
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最佳结合条件的选定
2 保温时间的选定 （1）标本于带盖封闭的盒，并漂浮在25℃的水浴中。 （2）平行的标本(载玻片)上滴加选定浓度的标记配基。 （3）选择恒温，作用时间为：10、20、30、40、50、 60min， Tris-HCl缓冲液冲洗后。 （4）用蒸馏水中快速冲洗一次，快速吹干后收集载玻 片上的所有组织，进行放射性测量。 （5）根据试验结果选出结合率高，而且隐定的反应时 间。
SA为放射性配基的比活度(Ci/mrnol)。
受体容量(mmol/ml)= 银粒计数/单位面积）×[(Bq/mg组织)/（银粒计数/单位面 积）]×(1/SA)×1/(3.7×1010Bq)
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试验要点
标本制备过程必须采用将标本速冻后，用冷冻切片机切片。 防止结合后受体与配基的解离、扩散、流失和受体活性失 活。 1 标本的速冻 在保温杯中加入干冰至1/3-1/2高度并加入己烷，使呈稀 薄的混合物达-78℃。将标本放在自制的有柄的带孔金属 容器中，标本和容器间衬一个纸片，持容器柄将标本送入 干冰己烷混合液中至标本表面和芯部变白、变硬，将标本 与纸一起取出，纸片上可以编号。切片时将纸片撕去，将 标本用2%梭甲计算
由切片上单位面积中银粒计数换算成受体容量(mmol/ml) 方法： （1）用已知放射性比活度(SA)的标记配基与组织细胞混合制成标准源。 （2）将标准源与切片在相同条件下进行自显影，测量标准源的放射性 比活度(Bq/mg组织)。 （3）测定标准源的自显影结果(银粒计数/单位面积)。 （4）计算两者转换因数(由单位面积的银粒计数转换成Bq/mg组织)。
受体配体简
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1. 单点法实验的数据处理
通常是计算饱和区的受体密度， 通常是计算饱和区的受体密度，即受体最大结合容量 （maximum binding capacity，Rmax）。 ， ）。 受体密度的表示方式有以下几种： 受体密度的表示方式有以下几种： 胞浆胞膜等的受体含量： 蛋白； ① 胞浆胞膜等的受体含量：fmol/mg蛋白； 蛋白 胞核的受体含量： ② 胞核的受体含量：fmol/mgDNA； ； 完整细胞受体的含量：结合位点/cell（site/cell）或 ③ 完整细胞受体的含量：结合位点 （ ） fmol/106细胞。 细胞。
由式（ ）整理可得： 由式（1.1）整理可得 KD ＝ [RT-RL][L] [RL] 将上式整理可得： 将上式整理可得 [RL] = [RT] － 1_ × [RL] [L] KD KD
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以复合物浓度[RL]为横坐标，以复合物浓度和游 为横坐标， 以复合物浓度 为横坐标 离配体的浓度比值[RL]/[L]为纵坐标作图，即为 为纵坐标作图， 离配体的浓度比值 为纵坐标作图 Scatchard作图。 作图。 作图 简单单位点系统Scatchard作图为一条直线，斜 作图为一条直线， 简单单位点系统 作图为一条直线 ），横轴截距为 率为 -（1/KD），横轴截距为 （ ），横轴截距为[RT]，纵轴截距为 ，纵轴截距为[RT]/ KD（见图 ）。 （见图3）。
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RBA的应用 的应用
神经递质 激素和药物等的作用机制 疾病的病因和发病机制 新药设计和药物筛选 受体显像与受体介导治疗
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二、概 述
1. 受体的分类 类(class) 膜受体 核受体 亚类（subclass） 型 (type) 亚型 (subtype)
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2. 受体与配体结合的基本特点
配体与受体的结合方式
配体与受体的结合方式
配体与受体是化学和生物学中重要的概念，它们之间的结合方式可以有多种形式。
一种常见的配体与受体的结合方式是通过静电相互作用。
基于电荷性质，配体的正、负离子与受体的负、正离子可以相互吸引，形成稳定的结合。
另一种结合方式是通过氢键。
氢键是一种弱的非共价键，但它在生物分子的结合中起到了关键作用。
配体和受体之间的氢键可以提供附加的结合力。
还有一种结合方式是通过疏水效应。
疏水效应是指在溶液中，亲水性的分子倾向于与其他亲水性分子聚集在一起，形成疏水性区域。
配体和受体之间的疏水效应可以促使它们结合。
除了上述方式，配体与受体的结合还可以受到空间构型和化学键等因素的影响。
受体和配体相互作用的研究进展
受体和配体相互作用的研究进展在生物医学领域的研究中，受体和配体相互作用的研究一直是一个热门的话题。
受体是一种蛋白质或其他分子，它们在细胞膜上或细胞内通过与分子配体结合发挥生物活性。
有很多不同类型的受体，例如G蛋白耦联受体、酪氨酸激酶受体和离子通道受体等。
而配体是受体结合的小分子，它们可以是内源性的（例如激素、神经递质或代谢产物等），也可以是外源性的（例如药物或毒素等）。
受体和配体之间的相互作用在生物学中扮演着至关重要的角色。
在药物研发中，通过针对受体的变异和调节配体活性，可以研制出新型的药物。
因此，对于受体和配体相互作用的研究具有重要的理论和应用价值。
本文将讨论受体和配体相互作用的研究进展。
一、受体和配体相互作用的研究方法受体和配体相互作用的研究早期主要依赖生物化学和药理学方法。
例如，利用受体溶液和放射性标记的配体，并在放射计数器中测量其结合，可以获得配体与受体的结合亲和力和结合容量等信息。
这种方法可以通过竞争性结合实验研究不同配体的选择性和特异性。
然而，这种方法需要大量的蛋白质样品，并且可能会出现非特异性结合和标记假阳性等缺点。
近年来，科学家们开发了许多新的研究方法，来研究受体和配体相互作用。
其中最重要的一种方法是晶体学。
晶体学是一种利用蛋白质晶体的X射线衍射模式来确定受体的结构的方法。
通过X射线衍射模式，科学家可以了解蛋白质的三维结构，以及其与配体结合的模式。
这种方法对于药物设计来说尤为重要，因为它可以帮助研究人员了解药物如何结合并激活或抑制受体，并为新药开发提供有力的支持。
另一种方法是计算机模拟。
计算机模拟可以在不需要大量蛋白质样品的情况下，对受体和配体相互作用进行研究。
通过计算机模拟，科学家可以预测配体和受体之间的相互作用方式，从而指导药物设计和开发。
该方法与实验相结合，可以有效地提高受体和配体相互作用的研究效率和准确性。
二、受体和配体相互作用在药物研发中的应用在药物研发中，受体和配体相互作用的研究是非常重要的。
受体分析检查-检验核医学
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Scatchard作图
简单单位点系统在Scatchard作图中应呈一条 直线。
RL RT 1 RL
L KD KD
以[RL]/[L]对[RL]作图，即为Scatchard作图。
编号 TB1 NSB1 TB2 NSB2 TB3 NSB3 TB4 NSB4 TB5 NSB5 TB6 NSB6
WBC/GCR
3H-Dex
ul
nM
10
4.383H-Dex多点RBA
Dex(ul) 5
PBS补足体 积ul 90 85 80
25
10.95
75
25
10.95
12.5
通过结合反应得知一定数量的组织或细胞与 该放射性配体结合的受体数量，即结合位点 数。配体与受体的亲和力以结合反应的平衡 解离常数表示。
定性RBA则通过反应量效关系、某些参数的
变化等判断受体的类型、结合方式（单位点 系统或多位点系统）、受体与配体相互作用 特点等。
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一、RBA的主要优点
1、高灵敏度 2、特异性强、专一性好 3、受体制剂的多用性
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二、受体的分类
膜受体 核受体
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（一）膜受体
由胞膜外、胞膜内、跨膜区组成。按跨膜区又 可分为：
1、G蛋白偶联受体（神经递质、前列腺素等） 2、单一跨膜区有激酶活性受体（细胞因子） 3、单一跨膜区无激酶活性受体（生长因子、INS） 4、离子通道型受体（Na+、K+、Cl-、Ca++等）
力越低。
受体与配体的结合与信号传导
受体与配体的结合与信号传导受体与配体的结合与信号传导是细胞通讯的重要方式。
细胞通过表面上存在的受体来感知环境中的化学信号（配体），然后通过配体与受体的结合来传导信号，从而调控细胞的生理功能和代谢过程。
本文将探讨受体与配体的结合机制以及信号传导的相关过程。
一、受体与配体结合的机制受体通常是膜蛋白，可以通过细胞膜上的特定结构域与外界的配体结合。
这些结构域可以是受体蛋白上的独立结构，也可以是其他蛋白质或糖蛋白与受体蛋白发生相互作用形成的复合物。
受体与配体的结合是一个高度特异的过程，要求受体和配体之间的互补性。
互补性决定了受体和配体之间的结合能力和结合稳定性。
受体与配体的结合可以触发多种生理响应。
例如，G蛋白偶联受体（GPCR）是一类重要的受体，在配体结合后能够激活细胞内的G蛋白，进而激活或抑制下游的信号通路。
另一类重要的受体是酪氨酸激酶受体（RTK），它们能够在配体结合后磷酸化自身或其他蛋白质，从而激活下游的信号传导级联反应。
二、信号传导的过程受体与配体的结合只是信号传导过程的第一步，之后信号需要通过细胞内的一系列反应级联传递到细胞质或细胞核内，从而引发生理效应。
当受体与配体结合后，受体会发生构象改变，从而促使受体活性的改变。
对于GPCR这类受体，激活后的受体能够结合G蛋白，使其从静止状态转变为活动状态。
活化的G蛋白能够激活或抑制下游信号通路，从而产生一系列的细胞效应。
对于RTK这类受体，配体结合后会引发自身磷酸化，随后通过激活多个信号通路，如Ras-MAPK通路和PI3K-Akt通路，最终调控细胞增殖、分化、迁移等生理过程。
细胞内信号传导的过程可以是线性的，也可以是网络的。
线性信号传导是指一个信号通路中的每个组分都是按照特定的顺序依次激活的，而网络信号传导是指多个信号通路能够同时或逐步地激活，最终集成产生细胞的反应。
线性信号传导更为简单，但网络信号传导更加复杂也更加灵活。
三、受体与配体结合与疾病的关联受体与配体结合及信号传导功能异常会导致多种疾病的发生。
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第五节 放射配体受体结合实验方法与技术
一、基本概念
1、受体（ receptor） 一类介导细胞信号转导的功能蛋白质，可与周围环境中微量化学
物质发生特异性结合，通过信息放大系统，触发后续的生理或药理效应。
2、配体（ligand） 能与受体特异结合的物质，如神经递质、药物或激素等。
3、判断受体的标准 真正的受体必须具备：饱和性、特异性、可逆性、高亲和性、结
构专一性、立体选择性、区域分布性、亚细胞或分子特征、有内源性配体等。
4、受体的基本分类 化学门控离子通道受体； G蛋白耦联受体。
5、受体调节的方式
1）共价调节（covalent modification） 尤其是蛋白磷酸化反应在受体的脱敏过程中起了
非常重要的调节作用。以乙酰胆碱受体为例，细胞内cAMP升高所引起的蛋白磷酸化可使乙
酰胆碱受体对乙酰胆碱的脱敏速度增加8～10倍。
2）非共价调节（non-covalent modification）影响受体功能的非共价调节机制包括①膜
电位的变化；②机械性改变受体的分布（斑片钳技术）；③受体和其他膜蛋白（如G蛋白）
或某些小配体（阴离子，阳离子，核苷酸）之间的变构影响；④膜脂质环境的改变等。
3）协同性调节（coordinate regulation）已知不同受体可含有同源受体区如胰岛素受体和
上皮生长因子-抗溃疡素受体中的酪氨酸激酶区。由此可推测一种受体被激活后可能通过一
共同密码（code）来调节同一细胞上的其他许多受体。
4）链锁反应（receptor cascades） 另外一种可能的调控机制，即一个受体被激活之后，
可能会释放一种细胞外信使，激活第二个细胞表面受体。称之为放大性的链锁反应。
二、放射配体结合法的应用领域
1、阐明药物作用机制；2、新药设计和药物筛选；3、探讨疾病的病因、发病机理，提
高临床合理用药和诊断水平；4、测定组织或血液中药物浓度；5、探寻新的受体、受体亚型
和内源性配体。
三、放射受体结合实验技术简介
1、放射配体的选择 需要非常高的选择性，并要求与靶受体有很高的亲和性，解离常
数最好小于10nmol/L，还要考虑配体的生物学以及生物化学特征。拮抗剂性配体必须能阻
断激动剂与靶受体结合引起的生物学效应。放射性受体结合试验中，最常用的放射性同位素
是氚，[3H]配体的主要优点是氚化过程不影响配体的生物活性，使用较安全，其信号必须用
闪烁技术加以放大。放射配体的另一个重要特性是特异性结合与非特异性结合的比率，理想
的配体应有不少于99%的特异性结合。
2、组织的选择和制备 用于放射受体结合试验的理想的组织应含有高密度的靶受体和
低密度的与配体非特异结合的受体。用于放射受体结合试验的组织可取自脑、外周组织、天
然表达或移植受体的细胞株等。
3、缓冲液 最常用的缓冲液是50mmol/L，PH为7.4的Tris-Cl的缓冲液；重碳酸盐、
磷酸盐和HEPES缓冲液亦可用于结合试验。
4、非特异性结合的测定 非特异性结合的测定原理是加入大量的对靶受体具有药理活
性的并可使受体饱和的非放射性配体。特异性结合量是指配体与靶受体结合量，可由总结合
量中减去非特异性结合量求出。
5、孵育条件 结合实验应该用能产生最大特异结合和适宜的孵育条件。需要经过大量
的实验才可摸索出最佳的测定条件。
6、放射配体-受体复合体与游离放射配体的分离
最常用的最有效的分离方法是过滤，结合试验中最常用的滤纸是玻璃纤维滤纸。通常用2～
5ml冷缓冲液冲洗2～3次就足够了。过滤完成后，滤纸置于盛有闪烁液的闪烁瓶中进行液
闪测定。当放射配体解离较快时，可用离心的方法将放射配体-受体复合物从游离配体中分
离出来。其它方法还有：凝胶过滤色谱法、凝胶过滤透析术、免疫沉淀法等。