蛋白质脱盐方法
实验三 凝胶层析法脱盐和分离蛋白质(0806)
实验三凝胶层析法脱盐和分离蛋白质(0806)一. 实验简介凝胶层析法是一种分离和纯化生物大分子的常用方法，其主要原理是根据分子大小和形状的差异，利用透明的分离层析介质，如凝胶，将混合样品中不同分子大小的生物大分子分离开来。
凝胶层析法通常用于脱盐、分离蛋白质等。
本实验的目的是学习凝胶层析法脱盐、分离蛋白质的方法。
二. 实验原理凝胶层析法脱盐：混合物中含有大量的低分子量离子和缓冲盐，它们也会进入凝胶层析介质中影响蛋白质分离。
通过凝胶层析法脱盐，可以去除这些离子物质，以得到更加纯净的蛋白质分离物。
凝胶层析分离蛋白质：凝胶层析法可以根据不同蛋白质的分子大小和形状来实现蛋白质的分离。
当样品溶液滴入凝胶层析柱内时，样品中的蛋白质将通过内部凝胶介质进行筛选。
与凝胶介质孔径相同或较小的蛋白质将受到凝胶层析柱中的阻滞作用而滞留在柱中；与凝胶介质孔径较大的蛋白质将通过凝胶层析柱被快速洗出。
三. 实验步骤1. 准备材料实验材料：1) 蛋白质混合物：约 0.5-1.0mg（例如淀粉酶和白蛋白的混合物）2) 已经平衡的蛋白质专用凝胶层析柱3) 凝胶层析缓冲液（一般为去离子水、Tris-HCl缓冲液等）4) 洗脱缓冲液（一般为含有酸或碱的缓冲液制成）5) 1.5mL或2mL离心管6) 滴液瓶7) 称量纸片8) 显微管或小型蛋白尺等实验设备：1) 离心机2) 通透性过滤膜（一般为0.22μm）3) 震荡器2. 脱盐操作1) 用去离子水或Tris-HCl缓冲液质加样品混合物。
3) 打开已经平衡的蛋白质专用凝胶层析柱端盖上的镊子，注意不要触碰凝胶层析床。
4) 将过滤的样品加入柱中，注意不要使样品溢出。
5) 用凝胶层析缓冲液清洗管子，直至清洗液中的OD值降至一定程度；一般要求OD < 0.01。
3. 分离蛋白质操作1) 将缓冲液的 pH 值调整为选择的蛋白质分离介质 pH 值，并将蓝色染料加入。
3) 将处理过的样品，也就是蛋白质混合物缓慢地加入柱中。
蛋白质脱盐
蛋白质脱盐——凝胶过滤法【实验目的】了解凝胶过滤层析技术的工作原理，掌握凝胶过滤层析技术，获得脱盐后的目的蛋白质溶液【实验原理】目的蛋白质用盐析法从细胞裂解中沉淀分离后，其中尚有大量的硫酸铵，需要脱盐才能获得较纯的样品。
常用的脱盐方法有透析法、电透析法和凝胶过滤法。
透析法及电透析法耗时长，样品稀释度大，不易放大进行大规模生产，所以工业生产中应用较少。
凝胶过滤层析脱盐过程中盐分子和蛋白质分子大小差异巨大，蛋白质溶液中小分子的盐分子随着层析流动相进入孔径较小的固定相致辞使其在层析中的迁移速率小，而蛋白质因分子尺寸较大，不能随流动相进入固定相中，因此在层析柱中的迁移速率大，首先从层析术中流出，实现脱盐。
用凝胶过滤法脱盐时，为了使盐同蛋白质充分地分离，除了应选用足够长的层析柱之外，还应对样品的体积加以限制。
样品的体积如果过大就导致蛋白质带同盐带不能分开。
一般来就，样品体积不超过床体积的30%。
这一数据的确定是根据盐和蛋白质的分离体积（Vsep）决定的。
两种物质分离体积的定义为，当两种物质的混合物在凝胶过滤层析柱上能够完全分离时的最小体积（参看图一）。
它在数值上等于：Vsep=V eB-V eAC1/2 V由于种种原因（例如样品在柱中的微小振动、固定相和流动相之间的不平衡，样品在柱中发生的纵向扩散等），产生的洗脱峰总是比理论值要宽得多。
如果上柱用的样品体积等于Vsep时，由于上述原因，两种物质的洗脱曲线会重叠造成分离失败（如图二所示），因此，上样体积应Vsep，但是上样体积过小会造成样品过度稀释。
为了提高脱盐样品的得率，上样体积一般15-20%床体积。
一般脱盐层析柱，应为粗短型柱，以提高脱的工作效率。
用凝胶过滤层析技术对白质溶液进行脱盐处理时，样品的浓度对分离效果，没有影响，但是，如果样品浓度过大，就会造成样品粘度增大，引起层析带和洗脱速率不稳定，造成洗脱曲线变宽和扭曲。
在选用洗脱液时，应考虑蛋白质的稳定性和蛋白质同层析介质之间的非特异性吸附作用，所以一般选用离子强度大于0.02的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液，如果脱盐后的蛋白质溶液要进行冷冻干燥处理时，应选用可以挥发的缓冲物质制备洗脱液，例如，乙酸铵、碳酸氢铵、乙酸乙烯二胺盐等。
蛋白质脱盐方法的介绍
蛋白质脱盐方法的介绍
蛋白大分子脱盐要求在样品制备中经常遇到，选择合适的脱盐方法显得非常重要。
在蛋白回收率、脱盐效率、蛋白生物活性、操作难易程度、耗时等方面需要综合考虑，找到合适的脱盐方式。
蛋白质用盐析法从细胞裂解中沉淀分离后，其中尚有大量的硫酸铵，需要脱盐才能获得较纯的样品。
常用的脱盐方法有透析法、电透析法和凝胶过滤法。
透析法及电透析法耗时长，样品稀释度大，不易放大进行大规模生产，所以工业生产中应用较少。
凝胶过滤层析脱盐过程中盐分子和蛋白质分子大小差异巨大，蛋白质溶液中小分子的盐分子随着层析流动相进入孔径较小的固定相致辞使其在层析中的迁移速率小，而蛋白质因分子尺寸较大，不能随流动相进入固定相中，因此在层析柱中的迁移速率大，首先从层析术中流出，实现脱盐。
一般脱盐层析柱，应为粗短型柱，以提高脱的工作效率。
用凝胶过滤层析技术对白质溶液进行脱盐处理时，样品的浓度对分离效果，没有影响，但是，如果样品浓度过大，就会造成样品粘度增大，引起层析带和洗脱速率不稳定，造成洗脱曲线变宽和扭曲。
c18色谱柱脱盐法
c18色谱柱脱盐法
C18色谱柱脱盐法是一种利用色谱柱进行脱盐的方法，特别是一种C18色谱柱脱盐法。
该方法主要基于反相色谱原理，利用C18柱作为固定相，根据不同物质在柱子上的亲疏水性差异进行分离。
脱盐过程则通过调整流动相的成分和条件实现。
具体来说，C18柱脱盐的步骤包括：
1.平衡柱子：使柱子的状态达到平衡，以便后续的分离操作。
2.加载样品：将需要分离的样品加载到柱子上。
3.洗脱盐离子：通过流动相的作用，使盐离子在柱子上停留，而目标物质则通过柱子流出。
4.收集目标物质：收集通过柱子流出的目标物质，完成脱盐过程。
这种方法在蛋白质脱盐中应用较多，如还原烷基化及酶解前的脱盐步骤。
以上信息仅供参考，可以咨询专业的技术人员获取具体信息。
蛋白质质谱如何脱盐？
蛋白质质谱如何脱盐？蛋白质质谱是一种常用的生物分析技术，可以帮助科学家研究蛋白质的结构和功能。
然而，在进行蛋白质质谱分析之前，通常需要将样品中的盐类去除，以避免干扰质谱信号。
本文将介绍蛋白质质谱脱盐的方法步骤，帮助读者更好地理解这一过程。
1. 胶束吸附法胶束吸附法是一种常见的蛋白质脱盐方法。
该方法利用胶束的特性，将盐类吸附在胶束表面，从而实现蛋白质的脱盐。
具体步骤如下：准备一种适当的胶束溶液，如十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。
将待脱盐的蛋白质样品与胶束溶液混合，并充分搅拌。
离心样品，使胶束与蛋白质沉淀。
将上清液转移至新的离心管中，即可得到脱盐后的蛋白质样品。
胶束吸附法的优点是操作简单，适用于大多数蛋白质样品。
然而，该方法可能会引入胶束残留物，对后续实验产生干扰。
2. 水合剂沉淀法水合剂沉淀法是另一种常用的蛋白质脱盐方法。
该方法利用水合剂与盐类形成复合物，从而使蛋白质与盐类分离。
具体步骤如下：准备一种适当的水合剂，如聚乙二醇（PEG）溶液。
将待脱盐的蛋白质样品与水合剂溶液混合，并充分搅拌。
将混合物置于低温环境中，使水合剂与盐类结合形成沉淀。
离心样品，将上清液转移至新的离心管中，即可得到脱盐后的蛋白质样品。
水合剂沉淀法的优点是能够有效去除大部分盐类，适用于对盐敏感的蛋白质样品。
然而，该方法可能会引入水合剂残留物，需要进一步的处理步骤。
3. 水质谱法水质谱法是一种高效的蛋白质脱盐方法，利用质谱仪的特性将盐类与蛋白质分离。
具体步骤如下：将待脱盐的蛋白质样品溶解于适当的溶剂中，如水或有机溶剂。
将样品注入质谱仪中，利用质谱仪的分离功能将盐类与蛋白质分离。
收集质谱仪输出的蛋白质信号，即可得到脱盐后的蛋白质样品。
水质谱法的优点是操作简单、高效，并且不引入任何残留物。
然而，该方法需要使用质谱仪设备，成本较高，不适用于所有实验室。
4. 离子交换法离子交换法是一种常用的蛋白质脱盐方法，利用离子交换树脂将盐类与蛋白质分离。
实验十一 蛋白质脱盐
实验十一蛋白质脱盐(透析和凝胶过滤)在蛋白质的研究中，经常要进行蛋白质脱盐，即将蛋白质同其它盐类小分子分离开。
蛋白质脱盐的方法很多，各有优缺点。
以下仅介绍常用的透析和凝胶过滤方法，可根据实验条件和要求选用。
（一）蛋白质透析一. 目的学习透析的基本原理和操作。
二. 原理蛋白质是大分子物质，不能透过透析膜而小分子物质可以自由透过。
在分离提纯蛋白质的过程中，常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分开。
三. 仪器、试剂、材料1.仪器烧杯；玻棒；离心机；离心管；冰箱；电炉。
2.试剂。
1％氯化钡溶液；硫酸铵粉末；1mol/L EDTA；2%NaHCO33.材料透析管（宽约，长12－15cm）或玻璃纸;皮筋；鸡蛋清溶液：将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1：20混匀，然后用六层纱布过滤。
四. 操作方法1.透析管（前）处理：先将一适当大小和长度的透析管放在1mol/L EDTA溶液中，煮沸10分钟，再在2％ NaHCO溶液中煮沸10分钟，然后3再在蒸馏水中煮沸10分钟即可。
2.取5ml蛋白质溶液于离心管中，加4g硫酸铵粉末，搅拌使之溶解。
然后在4℃下静置20分钟，出现絮状沉淀。
3.离心：将上述絮状沉淀液以1000转/分的速度离心20分钟。
4.装透析管：离心后倒掉上清夜，加5ml蒸馏水溶解沉淀物，然后小心倒入透析管中，扎紧上口。
5.将装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中，进行透析，并不断搅拌。
6.每隔适当时间（5－10分钟），用氯化钡滴入烧杯的蒸馏水中，观察是否有沉淀现象。
五. 结果处理记录并解释实验现象。
六. 注意事项1. 硫酸铵盐一定要充分溶解，才能使蛋白质沉淀下来。
七. 思考题起何作用？在透析袋处理过程中， EDTA和NaHCO3（二）凝胶过滤一. 目的学习凝胶过滤的基本操作技术，了解凝胶过滤脱盐的原理和应用。
二. 原理凝胶过滤的主要装置是填充有凝胶颗粒的层析柱。
目前使用较多的凝胶有葡聚糖凝胶（Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）和聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel-P）等。
蛋白质的盐析与透析
蛋白质的盐析与透析一、实验目的1.了解蛋白质的分离纯化方法2.掌握蛋白质的盐析及透析方法二、实验原理在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，蛋白质即从溶液中沉淀析出，这种作用称为盐析。
盐析法常用的盐类有硫酸铵、硫酸钠等。
蛋白质用盐析法沉淀分离后，需脱盐才能获得纯品，脱盐最常用的方法为透析法。
蛋白质在溶液中因其胶体质点直径较大，不能透过半透膜，而无机盐及其它低分子物质可以透过，故利用透析法可以把经盐析法所得的蛋白质提纯，即把蛋白质溶液装入透析袋内，将袋口用线扎紧，然后把它放进蒸馏水或缓冲液中，蛋白质分子量大，不能透过透析袋而被保留在袋内，通过不断更换袋外蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完为止。
透析常需较长时间，宜在低温下进行。
三、实验材料和试剂10%鸡蛋白溶液，含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液，饱和硫酸铵溶液，硫酸铵晶体，1%硝酸银溶液。
四、实验步骤（一）蛋白质盐析取10%鸡蛋白溶液5ml于试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，微微摇动试管，使溶液混合后静置数分钟，蛋白即析出，如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵溶液，观察蛋白质的析出；取少量沉淀混合物，加水稀释，观察沉淀是否会再溶解。
（二）蛋白质的透析注入含鸡蛋清的氯化钠蛋白溶液5ml于透析袋中，将袋的开口端用线扎紧，然后悬挂在盛有蒸馏水的烧杯中，使其开口端位于水面之上。
经过10分钟后，自烧杯中取出1ml溶液于试管中，加1%硝酸银溶液一滴，如有白色氯化银沉淀生成，即证明蒸馏水中有Cl-存在。
再自烧杯中取出1ml溶液于另一试管中，加入1ml 10%的氢氧化钠溶液，然后滴加1-2滴1%的硫酸铜溶液，观察有无蓝紫色出现。
每隔20分钟更换蒸馏水一次，经过数小时，则可观察到透析袋内出现轻微混浊，此即为蛋白质沉淀。
继续透析至蒸馏水中不再生成氯化银沉淀为止。
实验报告记录透析完毕所需的时间。
附：胶棉半透膜的制备市售5%的胶棉液，加入干燥的150mL锥形瓶中，将锥形瓶横斜不断转动，使瓶的内壁和瓶口都均匀沾有胶棉液。
实验6 凝胶层析法脱盐和分离蛋白质
实验6 凝胶层析法脱盐和分离蛋白质（一）原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。
脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。
前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。
所以，要根据具体情况选择使用。
前实验中样品体积较小，凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。
（二）试剂与器材（1）Sephadex G-25。
（2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液。
（3）奈氏（Nessler）试剂：于500ml锥形瓶内加入碘化钾150g，碘110g，汞150g及蒸馏水100ml。
用力振荡7～15min，至碘的棕色开始转变时，混合液温度升高，将此瓶浸于冷水内继续振荡，直到棕色的碘转变为带绿色的碘化钾汞液为止。
将上清液倾入2000ml量筒内，加蒸馏水至2000ml，混匀备用。
（4）20%（W/V）磺基水杨酸溶液。
（5）1.5cm×20cm层析柱。
（6）黑、白比色磁盘。
（三）操作（1）取层析柱1支（1.5cm×20cm），垂直固定在支架上，关闭下端出口。
将已经溶胀好的Sephadex G-25中的水倾倒出去，加入2倍体积的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并搅拌成悬浮液，然后灌注入柱，打开柱的下端出口，继续加入搅匀的Sephadex G-25，使凝胶自然沉降高度到17cm左右，关闭出口。
待凝胶柱形成后，在洗脱瓶中加入0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液以3倍柱体积的磷酸盐缓冲流过凝胶柱，以平衡凝胶。
（2）凝胶平衡后，用皮头滴管除去凝胶柱面的溶液，将盐析所得全部IgG样品加到凝胶柱表面，打开柱下口，控制流速让IgG样品溶液慢慢浸入凝胶内。
凝胶柱面上加一层的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并用此缓冲液洗脱，控制流速为0.5ml/min左右。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
蛋白质脱盐方法
蛋白质是生物体中重要的分子，对于研究其结构和功能具有重要意义。
然而，在进行蛋白质研究时，常常需要将蛋白质从混合物中分离出来，并去除其中的盐类。
这就需要采用蛋白质脱盐方法。
蛋白质脱盐是指通过一系列的操作步骤将蛋白质样品中的盐类去除，以便于后续的实验操作。
下面将介绍几种常用的蛋白质脱盐方法。
一、盐析法
盐析法是一种常用的蛋白质脱盐方法。
它利用蛋白质在高盐浓度下溶解度降低的特点，通过控制溶液中的盐浓度，使蛋白质从溶液中沉淀出来。
盐析法操作简单，适用于大多数蛋白质。
盐析法的步骤如下：
1. 将蛋白质溶液加入适量的高盐缓冲液中，使蛋白质溶解。
2. 缓慢加入低盐缓冲液，使盐浓度逐渐降低。
3. 盐浓度降低到一定程度后，蛋白质会出现沉淀，可以通过离心将沉淀物和上清液分离。
4. 将沉淀物溶解在适量的低盐缓冲液中，即可得到脱盐后的蛋白质溶液。
二、透析法
透析法是一种利用半透膜将蛋白质与溶液中的盐类分离的方法。
透
析法操作简单，适用于大分子量的蛋白质。
透析法的步骤如下：
1. 将蛋白质溶液装入透析袋中，封闭袋口。
2. 将封闭的透析袋放入含有低盐缓冲液的容器中。
3. 通过半透膜的作用，蛋白质会逐渐从高盐浓度的溶液中透析到低盐浓度的溶液中。
4. 定期更换低盐缓冲液，直到蛋白质完全脱盐。
三、离子交换层析法
离子交换层析法是一种利用离子交换树脂将蛋白质与溶液中的盐类分离的方法。
离子交换层析法操作相对复杂，但可以实现高效的蛋白质脱盐。
离子交换层析法的步骤如下：
1. 将蛋白质溶液加载到预先平衡的离子交换树脂柱上。
2. 通过适当的缓冲液进行洗脱，将蛋白质与盐类分离。
3. 收集洗脱液中的蛋白质溶液，即可得到脱盐后的蛋白质。
四、超滤法
超滤法是一种利用超滤膜将蛋白质与溶液中的盐类分离的方法。
超滤法操作相对简单，适用于小分子量的蛋白质。
超滤法的步骤如下：
1. 将蛋白质溶液加入超滤装置中。
2. 施加适当的压力，使溶液通过超滤膜。
3. 盐类和其他小分子量物质会通过超滤膜排除，蛋白质则被滞留在超滤膜上。
4. 收集超滤液中的蛋白质溶液，即可得到脱盐后的蛋白质。
蛋白质脱盐方法包括盐析法、透析法、离子交换层析法和超滤法等。
根据不同的实验需求和蛋白质特性，可以选择适合的脱盐方法。
通过合理的操作步骤，可以有效地将蛋白质从混合物中分离出来，并去除其中的盐类，为后续的实验提供纯净的蛋白质样品。