第四章 酶工程
第四章酶工程酶的提取与分离纯化ppt课件
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
细菌细胞壁的结构
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
loSg loS0 g K sI
I：离子强度，I = 1/2∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数
S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。
b. 添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，
使细胞膜结构改变或破坏。
食品生物技术基础-酶工程
(1)自然酶
是指由生物材料中分离出来的酶。 主要靠微生物发酵生产，应用于工业和医学。 食品工业、制药工业、制革工业、酿造工业及纺 织工业使用酶制剂后可以大大地改造、革新工艺 流程并降低成本。 主要使用的自然酶，多数使用微生物来源的酶的 粗制剂。
特点：价格低，生产方式简单； 应用方便，不要辅因子参加； 产品种类少，应用范围窄。
第一节 酶工程概述
早期的酶工程技术主要是从动物、植物、微生物材料中提取、分离、 纯化制造各种酶制剂，并将其应用于化工、食品和医药等工业领域。 ７０年代后，酶的固定化技术取得了突破，使固定化酶、固定化细 胞、生物反应器与生物传感器等酶工程技术迅速获得应用。
随着第三代酶制剂的诞生，应用各种酶工程技术制造精细化工产品 和医药用品，及其在化学检测、环境保护等各个领域的有效应用， 使酶工程技术的产业化水平在现代生物技术领域中名列前茅，并正 在与基因工程、细胞工程和微生物工程融为一本，形成一个具有很 大经济效益与社会效益的新型工业门类。
1971年第一届国际酶工程学术会议在美国召 开,当时的主题即是固定化酶，进一步开展了 对微生物细胞固定化的研究。 1973年,千烟一郎首次利用固定化的大肠杆菌 细胞生产L-天冬氨酸。 1978年,日本的铃木等固定化细胞生产 α 淀粉酶研究成功。所以说,70年代是固定化细 胞技术取得进展的时期。
（3）酶工程热点——— 酶法转化、折分合成手性药物及精细 化合物 ；
（4）构建新酶——— 抗体酶、核酶及人工合成酶是一个前沿 生长点 。
第二节
食品酶的生产与分离纯化
1、酶的生产
2、酶的制备——分离纯化
3、酶的保存
酶制剂有固态的也有液态的，那这些酶制剂是怎样产生的呢？ 1．可以采用一定的技术直接从动植物或微生物的组织、细胞中将 酶提取出来。（提取法）
《酶工程》 课后习题答案
① 酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新技术，是工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类所需产品或者服务于其它目的地一门应用技术。
② 比活力：指在特定条件下，单位质量的蛋白质或者 RNA 所拥有的酶活力单位数。
③ 酶活力：也称为酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。
其大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高。
④ 酶活国际单位 : 1961 年国际酶学会议规定：在特定条件(25℃，其它为最适条件 )下，每分钟内能转化1 μmol 底物或者催化1 μmol 产物形成所需要的酶量为 1 个酶活力单位，即为国际单位(IU)。
⑤ 酶反应动力学:指主要研究酶反应速度规律及各种因素对酶反应速度影响的科学。
酶的研究简史如下：(1)不清晰的应用：酿酒、造酱、制饴、治病等。
(2)酶学的产生： 1777 年，意大利物理学家 Spallanzani 的山鹰实验； 1822 年，美国外科医生 Beaumont 研究食物在胃里的消化； 19 世纪 30 年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。
1684 年，比利时医生Helment 提出 ferment—引起酿酒过程中物质变化的因素(酵素)；1833 年，法国化学家 Payen 和Person 用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶； 1878 年，德国科学家 K hne 提出 enzyme—从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”(希腊文)。
(3)酶学的迅速发展(理论研究)： 1926 年,美国康乃尔大学的”独臂学者”萨姆纳博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质;1930 年，美国的生物化学家 Northrop 分离得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结晶，确立了酶的化学本质。
I.酶工程发展如下：①1894 年，日本的高峰让吉用米曲霉制备淀粉酶，酶技术走向商业化：②1908 年，德国的Rohm 用动物胰脏制得胰蛋白酶，皮革软化及洗涤；③1911 年， Wallerstein 从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清；④1949 年，用微生物液体深层培养法进行－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕；⑤1960 年，法国科学家 Jacob 和 Monod 提出的控制子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量；⑥1971 年各国科学家开始使用“酶工程”这一位词。
酶工程 重点整理总结
第一章绪论1、何为酶工程，试述其主要内容和任务。
答：（1）酶工程：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。
（2）主要内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。
（3）主要任务：经过预先设计，通过人工操作获得人们所需的酶，并通过各种方式使酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。
2、酶有哪些显著的催化特性？答：（1）酶催化作用的专一性强（①绝对转移性：一种酶只能催化一种第五进行一种反应；②相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应）；（2）酶催化作用的效率高（107~1013倍）；（3）酶催化作用条件温和。
3、简述影响酶催化作用的主要因素。
答：（1）底物浓度的影响：决定酶催化作用的主要因素。
酶催化反应速度随底物浓度增加现增加在逐步趋向平衡再反而下降。
（2）酶浓度的影响：底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。
（3）温度的影响：适宜温度范围内，酶能进行催化反应，最适温度条件下，酶的催化反应速度达到最大。
一般60°C以上易失活，5°C以下活性极低，Taq聚合酶95°C下仍稳定。
（4）PH的影响：适宜PH范围内，酶才能显示其催化活性，最适pH条件下，酶催化反应速度达到最大。
（5）抑制剂的影响：在抑制剂的影响下，酶的催化活性降低甚至丧失，从而影响酶的催化功能，有竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制。
（6）激活剂的影响：在激活剂的作用下，酶的催化活性提高或者由无活性的酶生成有催化活性的酶。
如Ca、Mg、Co、Zn、Mn、等金属离子和Cl等无机负离子。
5、简述酶活力单位的概念和酶活力的测定方法。
答：概念：在特定条件下（温度可采用25°C，pH等条件均采用最适条件），每1min催化1μmol的底物转化为产物的酶量定义为1个酶活力单位（IU）。
第四章 酶工程
丙酮酸+CO2+ATP+H2O 草酰乙酸+ADP+Pi
正反应、逆反应都用同一名称
DH2+NAD+D+NADH+H+
DH2NAD+氧化还原酶
各大类酶的 特殊命名规则
转移酶为供体 受体被转移 基团转移酶
氧化还原酶往往可 命名为供体受体 氧化还原酶，
值得注意的是来自不同物种或同 一物种的不同组织或不同细胞器 的同一种酶，虽然他们催化同一 个生化反应，但它们本身的一级 结构可能并不相同，命名也有所 区别
酶的一级结构
酶的二级结构
多肽链主 链原子的 局部空间 排列
酶的 二级 结构
螺旋结构 β-折叠
没有考虑到它的侧链的构象 或与其它部分的相互关系
酶蛋白的-螺旋结构
酶蛋白的折叠结构
由-螺旋、折叠和随机结构 构成的溶菌酶的空间结构
酶的三级结构
指单一的多肽链 或共价连接的多 肽链中，所有原 子在空间上的排 列
酶活性中心示意图
酶的活性中心构成
酶分子中的 氨基酸残基
酶 的 活 性 中 心
辅酶或辅助因子 或它们的部分 结构
酶的结构
四级结构
二级结构
酶的结构
三级结构
一级结构
酶的一级、二级、三级和四级结构示意图
酶的空间结构
三级结构
二级 结构
第四章 酶工程
SDS-PAGE （1）带电粒子在电场中向着与其自身所带电荷相反
的电极移动的过程； （2）在外电场作用下，电泳迁移率主要依赖于酶的
相对分子质量，与所带的净电荷和形状无关； （3）为了减少对流扩散，电泳过程一般在浸透了缓
冲液的聚丙烯酰胺凝胶上进行； （4）电泳分离的蛋白质的量通常较小（约数毫克），
超滤
（1）在一定的正压力或负压力驱动下，将料液强制 通过一定孔径的超滤膜，部分小分子溶质和溶剂透过膜 而成为超滤液，大分子酶和蛋白质等物质被截留，从而 达到分离纯化目的，也可用于酶液的浓缩和脱色；
（2）超滤膜截留颗粒直径范围为2～200nm，相当 于相对分子质量1,000～500,000；
（3）构成超滤膜的主要材料有醋酸纤维、尼龙、聚 砜、陶瓷等。
（五）酶分离纯化的原则
根据溶解度变化的纯化方法较适宜于早期纯化阶段， 规模较大；而柱层析法或电泳分离更适宜于后期的纯 化过程，规模较小。 某些价格昂贵的层析介质及方法，只用于纯化过程 的最后几步。
（六）酶纯度与酶活力
实验室常用SDS-PAGE来检验酶的纯度。酶分子结 构高度复杂，同一种酶制剂，采用不同方法检验结果 可能不一致，酶纯度应注明达到哪种纯度，如电泳纯、 HPLC纯等。 比活力：每毫克酶蛋白具有的酶活力单位数。一般 情况下，酶的比活力随酶纯度的提高而提高。酶纯度 也可用酶的比活力来衡量。
（1）自然酶：由生物材料中分离出来的酶制成的 酶制剂。价格低，生产方式简单；应用方便，不需辅 因子参加；产品种类少，应用范围窄。
（2）化学修饰酶：通过酶分子的化学修饰达到改 性变构的目的。主要用于酶学研究和疾病治疗。
（3）固定化酶：酶分子通过吸附、交联、包埋及 共价结合等方法束缚于某种特定支持物上发挥酶的作 用。它在食品工业上具有较大的应用价值。
酶工程-04-酶的提取与分离纯化
三足离心机 32 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
1、差速离心
采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒 先后分离的方法。
应用范围:大小和密度有较大差别的颗粒。
大
中
小
33 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
2、密度梯度离心
在离心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐 降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的表面，经过离心，不 同大小、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成 若干条不连续的区带。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
渗出液 40
膜分离技术的地位和影响
美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程 ，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一 种技术，能像膜技术这么广泛地被应用”
日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研 究和开发。
常用的离心介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr
36 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
先把一定浓度的铯盐溶液与样品液混合均匀，也可将一定量 的铯盐加到样品液中使之溶解。 在选定的离心力作用下，经过足够时间的离心分离。 铯盐在离心力的作用下，在离心力场中沉降，自动形成密度 梯度。 样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成 区带。
梯度介质：蔗糖密度梯度系统
34 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
密度梯度的制备：密度梯度混合器
35 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
3、等密度梯度离心
当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围 时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒一直移动到与他 们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带。
酶工程 第四章酶的分离纯化 第一节细胞破碎
第一节 细胞破碎
2．表面活性剂处理 表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用， 使细胞膜结构破坏，增加膜的透过性。
表面活性剂有离于型和非离子型之分，对细胞破碎效 果而言，离子型表面活性剂较有效，但由于离子型表面活 性剂会使酶的结构破坏，引起酶变性失活。所以，在酶的 提取方面一般不采用离子型表面活性剂。而采用非离子型 的特里顿(Triton)、吐温(Tween)等表面活性剂。例如，用 特里顿X—100处理诺卡氏菌细胞，从而提取胆甾醇氧化 酶，用胆酸盐处理细胞，提取一种膜结合的葡聚糖酶等。 处理完后，可采用凝胶层析等方法，将表面活性剂除去， 以免影响酶的进一步分离纯化。
•
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
由于溶菌酶等上述列举的酶价格较高，而且外加酶本身混入细胞
破碎液中成为杂质，故此，外加溶菌酶的方法难以用于大规模工业生
产。
第一节 细胞破碎
2.自溶法
将细胞在一定的pH值和适宜的温度条件下保温一段时 间，通过细胞本身存在的酶系将细胞破坏，使胞内物质释 出的方法称为自溶法。
自溶法效果的好环取决于自溶条件。主要有温度、pH 值、离子强度等。自溶时间一般较长，不易控制，为防止 其他微生物在自溶液中滋长，必要时可加入甲苯、氯仿、 叠氮钠等杀菌剂。
第一节 细胞破碎
三、渗透压法
渗透破碎是破碎细胞最温和的方法之一。细胞在低渗 溶液中由于渗透压的作用，溶胀破碎。如红血球在纯水中 会发生破壁溶血现象。但这种方法对具有坚韧的多糖细胞 壁的细胞，如植物、细菌和霉菌不太适用，除非用其他方 法先除去这些细胞外层坚韧的细胞壁。
四、化学破碎法
化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细 胞膜的结构改变或破坏的方法。
表面活性剂处理法对膜结合酶的提取特别有效，在实 验室和生产中均已成功使用。
《酶工程》王金胜版 1-4章 笔记
酶工程第一节概述一、酶的概念和作为生物催化剂的特点1、酶的概念：酶是由生物产生的具有催化作用的生物大分子，大部分在体内，小部分在体外，具有活性中心和特殊构象2、作为催化剂的特点1）极高的催化效率2）高度专一性——绝对专一性（一种酶只作用于一种底物）相对专一性（作用于一类底物或一种化学键）立体异构专一性（对底物立体构型的特异要求）3）活性可调节性（合成的诱导和阻碍、降解的促进、激活物和抑制物的调节作用，代谢物对酶的反馈调节，酶的变构调节、酶的化学修饰）4）酶的不稳定性（一定的ph和温度）二、酶的化学组成、结构和催化机理1.酶的化学本质和组成：本质是蛋白质（检测高度纯化和结晶的酶一级结构）根据组成分为：单纯酶（组成成分仅为氨基酸的一类酶）和结合酶（蛋白质-酶蛋白+非蛋白的小分子-辅助因子）全酶=酶蛋白+辅助因子2.酶的辅助因子酶蛋白—酶反应的专一性辅助因子—传递电子、原子、某些化学基团酶含有的金属离子—酶活性中心组成部分、连接底物盒酶分子的桥梁、稳定酶蛋白分子构像的必需品：常见的有k，na，mg，cu,Zn,Fe等3.酶结构与功能结构特征：一级结构：酶蛋白的20种氨基酸种类、数目和排列顺序（-sh参与组成酶活性中心）空间结构—维持酶活性中心所必需的构象。
肽链ß折叠—保持酶分子的球状椭圆状为主，折叠结构之间å以及折叠肽段相连功能部位：酶分子表面多种功能性区域。
酶活性中心与必需基团：酶活性中心：活性部位。
由在一级结构上可能很远但在空间结构上彼此靠近的氨基酸残基，集中在一起形成的，具有一定空间结构的区域，该区域与底物相结合并催化底物转化为产物。
活性中心的必须基团：分为结合基团、催化基团。
是酶发挥催化作用与底物直接接触的基团。
诱导契合作用：底物接近酶是，诱导酶分子的构象变得能与底物配合，进而催化底物分子发生化学变化。
4.催化机理：降低反应活化能、中间产物学说、酶作用高效率机理（邻近效应、定向效应、底物分子变形或扭曲、酸碱催化、共价催化、金属离子的催化、活性中心的低介电信、协同催化）活化能：从初态到活化态所需的能量5.酶的分类：氧化还原酶（乳酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶）转移酶类（甲级转化酶、氨基转化酶、己糖激酶、磷酸化酶）水解酶类裂合酶类异构酶类连接酶类三、酶的分类和命名第二节酶促反应动力学（反应速度规律和因素）一、底物反应动力学1.单底物反应动力学-异构、裂解酶（仅底物浓度变化，与酶促反应关系——一级反应-混合级反应-零级反应）米氏方程km米氏常数=酶促反应为最大速度一半时的底物浓度mol／L2.双底物反应动力学（1）序列反应二、抑制反应动力学抑制剂-不变性，活性下降1不可逆抑制作用的抑制剂以共价键与酶的必需基团进行结合专一性不可抑制剂非专一性不可你抑制剂（一类或者几类基团）2.可逆抑制作用抑制剂以解离平衡为基础，非共价结合，物理方法去除后，活性恢复（1）竞争性抑制作用—与底物结构相似，竞争酶活性中心（2）非竞争性抑制作用—与活性中心以外的必需基团结合，不影响酶和底物。
第四章__酶工程原理及其在食品工业中的应用详解
（2）离子吸附法。通过离子效应，将酶分子固定到 含有离子交换基团的固相载体上。 常见的载体：DEAE-纤维素、 DEAE-葡聚糖凝胶、 CM-纤维素、DOWEX-50等。 优点：操作简单，处理条件温和，能得到酶活回收 率较高的固定化酶。 缺点：酶与载体的结合力较弱，当离子强度高、缓 冲液种类或pH值发生变化时，酶容易脱落。
酶工程一般工艺流程示意图
胞外酶
胞内酶 菌种→基因改造→发酵→发酵酶液→预处理→细胞分离→细 胞破壁→碎片分离→提取→精制→酶制剂及其改造 酶制剂 ↓ 原料→前处理→杀菌→酶反应器→反应液→产品提取→成品
（二）酶工程的发展历程 1.20世纪50～60年代早期的酶工程技术，主要是从 动物、植物和微生物原料中提取、分离、纯化制造各种 酶制剂，并将其应用于化工、食品和医药等工业领域。 2.20世纪70年代后期，酶的固定化技术取得了突破， 使固定化酶、固定化细胞、生物反应器与生物传感器等 酶工程技术迅速获得应用。 3.目前，各种酶工程技术已用于制造多种精细化工 产品和医药产品，并且在食品工业、化学检测和环境保 护等各个领域中得到了有效的应用。
（二）非机械破碎法 1.酶溶法 加酶法:常用的有溶菌酶、蛋白酶、糖苷酶等，它们 对细胞壁或细胞膜进行酶解，使细胞破碎。 自溶法：在微生物生长代谢过程中，控制一定条件， 诱发微生物产生少量的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力， 以达到细胞自溶的目的。 2.化学渗透法 用有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素或金属 螯合物等处理，使细胞壁或膜的通透性（渗透性）改变， 从而使胞内物质有选择地渗透出来。
（三）根据酶分子电荷性质的方法 1.离子交换层析 根据被分离物质与分离介质（离子交换剂）间异种电 荷的静电引力的不同来进行物质分离的。不同离子交换剂 上的可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使不同物质 分离。 离子交换剂根据活性基团的性质分为阳离子交换剂和 阴离子交换剂。酶具有两性性质，可用阳离子交换剂，也 可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。
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• 3）、改变基团的电化学性质，分子内基 团的相互作用力与其它物质之间的反应 性，从而使酶蛋白分子侧链基团发生化 学改变； • 4）、利用小分子或大分子 物质对活性部 位或活性部位之外的侧链基团进行共价 化学修饰（如果所用的化学修饰剂是水 不溶性的，就成为固定化酶），以改变 酶的稳定性。
第四章
酶工程
主讲人：黄 循 吟
一、概述
• 问题：1、什么是酶？酶作为催化剂有何 特点？ • 2、什么是酶工程？发展历程如何？ • 3、酶工程研究的内容是什么？
• 酶 ：是具有催化活性的生物物质。 • 作为催化剂，酶具有催化剂的共性： • 1）、只需要很少量就可以催化大量物质 反应，在反应前后其质量不变； • 2）、它只能加速可逆反应达到平衡的时 间，而不能改变反应的平衡点； • 3）、只能催化热力学允许发生的反应。 • 作为生物催化剂，酶具有自己的特性：
• • • •
改造—改变蛋白质的一级结构的过程。 修饰—把侧链基团的共价变化。 手段和方法 ： 1）、酶蛋白主链经过水解酶的有限水解 作用，去掉部分主链或置换一级结构上 某些aa残基，使活性部位的构象发生某 些变化，而从达到改性与改构的目的； • 2）、用双功能基团试剂将酶蛋白分子间、 亚基间或分子内不同肽链部分间进行交 联，使分子加固，提高其稳定性；
• 2）、酶稳定性变化： • 在酶转化反应中，天然酶对温度、有机 溶剂、极端PH值及金属离子等十分敏感， 稳定性差； • 天然酶使用后通常不回收，不能连续使 用，使用效率低，产品成本高，产品质 量受影响。 • 固定化酶的最大特点是既有生物催化剂 的功能，又具有固相催化剂的特性。与 天然酶相比，固定化酶的优点是：
• 3）、可利用细胞内辅助因子再生系统和 酶系统，催化一系列反应； • 4）、细胞生长停滞期短，细胞密度大、 反应快、抗污染能力强； • 5）、可以连续使用，大大节约生长细胞 耗用的养料； • 6）、应用固定化细胞生物反应器进行连 续反应，可避免反馈抑制和产物的分解； • 7）、固定化细胞的稳定性大都比游离细 胞高。
• 在使用固定化细胞时，要注意以下问题： • 一是必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否 则会影响产物纯度； • 二是必须抑制细胞内蛋白酶对所需酶的分解作 用； • 三是细胞内有多种酶存在，会产生副作用产物， 必须设法抑制非目的酶的活性，如加入去污剂， 热处理等； • 四是固定化细胞利用的主要是胞内酶，而细胞 膜会对底物和产物的进出造成障碍，因此主要 用于小分子底物的反应，而不适用于大分子 底 物。
2、固定化细胞的性质和特点
• 细胞固定化后，其中酶的性质，稳定性与固定 化酶一样，但因其颗粒微小，难以截留或定位。 固定化细胞既有细胞特征又有生物催化剂功能， 也具有固相催化剂的特点。其优点主要表现在： • 1）、无须进行酶的分离纯化，节省起始投资； • 2）、细胞保持原始的生命活动状态，酶在细 胞内环境中稳定性较高，进行完整的细胞固定 化时，酶活力损失少；
• 本法优缺点：操作简单，符合细胞的生 长条件，不影响细胞生长及酶活性。但 吸附容量小，结合强度低。 • 3）、包埋法：将细胞定位于凝胶网格内 的技术。 • 优缺点：细胞容量大，操作简便，酶活 力回收率高。但扩散阻力大，易改变酶 的动力学行为，不适于催化大分子底物 与产物的转化反应。
（四）、固定化方法和载体的 选择
二、酶的开发与生产
• • • • • • 1、目的酶生产菌株的获得： 1）、从自然界分离筛选； 2）、人工诱变育种； 3）、遗传工程育种。 2、酶的生产方式： 通过各种方法得到优良的菌株，是酶生 产的先决条件。要想有效地进行酶生产， 还必须探讨该菌种产酶的最适培养条件。
• • • • •
1）、培养方法； 2）、工业大规模生产的工程和工艺条件； 3）、是胞内酶还是胞外酶？ 4）、分离纯化的方法和条件； 5）、酶纯度的鉴定。
• • • • • •
3）、有一定的机械强度； 4）、有一定亲水性及良好的稳定性； 5）、有一定疏松网状结构，颗粒均匀； 6）、共价结合时具有可活化基团； 7）、有耐受酶及微生物的能力； 8）、廉价易得。
（五）、固定化生物催化剂的 性质和特点
• 1、固定化酶的性质和特点： • 1）、酶活力的变化：酶固定化后活力大都有 所下降。其原因可能是： • 一是活性部位的重要氨基酸侧链基团与载体相 结合； • 二是酶的空间结构发生变化； • 三是酶志底物结合时产生空间位阻效应； • 四是包埋法固定化酶还有底物和产物扩散阻力 的增大。
• 优缺点：操作简单，可选用不同电荷和 不同形状的载体，固定化过程可能同时 实现了纯化，固定化酶的活力较高。 • 最适固定酶量无法估计，结合力不强， 容易脱落，污染产物等。
2、包埋法
• 将酶或细胞定位于凝胶网格或微囊内的技术。 主要用于水溶液性小分子底物的转化反应。 • 1）、凝胶包埋法：将酶 或细胞定在具有网格 结构的高分子凝胶中。 • 常用的凝胶材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇 等合成高分子材料以及卡拉胶、海藻胶、琼脂、 明胶及胶原等天然材料大分子。 • 基本操作过程：
• 优缺点（P111）： • 2）、微囊包埋法：包有酶的微囊也称为 人工细胞。制备微囊固定化酶的方法主 要有界面聚合法、界面沉淀法和液中干 燥法等。 • 常用界面聚合法即利用不溶于水的高 聚物单体在油-水界面上聚合成膜的过程 将酶包裹起来。
3、交联法
• 应用多功能或双功能试剂在酶与酶或 酶与载体之间进行交联固定化的技术。
• 1、固定化方法 的选择：一般而言，对酶 的固定化多采用共价结合、离子结合和 物理吸附法等，有时还可跟交联法配合 使用；而固定化细胞则以包埋法为主。 • 考虑因素： • 1）、安全性； • 2）、固定化酶操作的稳定性； • 3）、成本。
• 2、载体的选择：酶及细胞固定化过程中 所用的水不溶性固体支持物称为载体 或 基质。它的来源、结构及性质各不相同。 因此在固定化过程 中，需根据酶促反应 性质、底物类型及固定化方法，选用相 应的载体。方法 不同使用的载体也不同 （P114表4-1）。 • 载体 选择的条件： • 1）、固定化过程不引起酶的变性； • 2）、对酸碱度有一定的耐受力；
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1）、催化效率高； 2）、专一性强； 3）、反应条件温和； 4）、活力可被调控； 5）、对环境条件比较敏感。
• 酶工程：利用酶的特异性催化功能或微 生物细胞、动植物细胞、细胞器的特定 功能，并通过工程化为人类生产有用的 产品及提供有益服务的技术。 • 酶 工程发展所经历的历程： • 1）、自然酶的开发应用； • 2）、固定化酶和固定化细胞； • 3）、多酶 反应器； • 4）、仿生技术。
• 离子吸附法：是将解离状态的酶溶液与离子交 换树脂混合后，酶蛋白通过离子键与树脂结合 在一起。然后洗去末结合的杂质和酶，即可得 到固定化酶。 • 这种方法 结合能力较强，如多糖离子交换 剂每克载体吸附酶蛋白量为50—150mg。 • 影响载体吸附的因素较多。如溶液PH值、离子 浓度、温度、酶蛋白浓度及载体比表面积等 （具体的影响同学自学）。
三、固定化技术
• （一）、概述： • 问题：什么是固定化技术？它产生的背 景和发展历史如何？ • 固定化技术是通过化学或物理方法把酶 或细胞束缚在一定的区域内，将之固定 后再进行催化作用。 • 它产生的背景和发展历史：
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1）、发现于1916年； 2）、诞生于60年代； 3）、成熟于70年代； 4）、实用化并大规模应用于80年代。
（二）、酶的固定化方法
• 自60年代以来，科学家对酶和细胞的 固定化技术进行了大量的研究，迄今为 止，具体的固定化方法多达一百种以上。 根据所用载体及操作方法的差别可分为 三类：
• 1、载体结合法（将酶定位于载体表面）： • 1）、共价结合法：这是一种广泛应用的制备 固定酶的方法。是将酶分子上非活性部位的功 能基团与载体上的活性基团进行共价结合的方 法。 • 在用共价结合法进行酶固定时，首先是利 用化学方法将载体活化，再与酶分子上的某些 基团反应，形成共价键，将酶结合在载体上。 载体活化是重要问题，活化过程首先要考虑使 载体获得能与酶分子特定基因产生特异反应的 活泼基因，而且要求与酶偶联时反应条件要尽 可能温和。
• 一是稳定性比天然酶高，使用半衰期比较长； • 二是反应后酶与底物容易分开，并可长期反复 使用； • 三是反应液中没有残留酶，因此易于纯化，产 品质量高； • 四是具有一定的机械强度，成型后装入节省能量； • 五是酶的利用率高，产品成本低； • 六是转化过程基本无三废排出。因此称为（无 公害酶）。
• 无论采用哪种方法，都必须采取适当的 措施来提高细胞膜的通透性，以提高酶 的活力及转化效率。 • 意义：固定化细胞具有极其良好的工业 应用前景，它对传统发酵工艺的技术革 新改造具有极其重要的影响，有可能逐 渐取代发酵工艺。
• 固定化酶（细胞）的指标： • 相对酶活力—具有相同酶蛋白量的固定 化酶与游离酶活力的比值。 • 酶的活力回收率—固定化酶的总活力与 用于固定化的酶总活力之百分比。 • 固定化酶的半衰期—固定化酶的活力下 降到初始活力一半所经历的时间。用t1/2 表示。
四、酶分子的改造与修饰技术
• 问题：1、为什么要对酶分子进行改造与 修饰？什么是改造？什么是修饰？ • 2、酶分子改造与修饰的目的与任 务是什么？ • 3、理论依据是什么？ • 4、手段和方法如何？
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改造原因： 目的和任务： 酶分子改造和修饰的内容： 酶是具有催化活性的生物物质。绝大多数是蛋 白质。因此酶分子改造和修饰的内容是通过主 链的“切割”、“剪接”和侧链基团的化学修 饰，对酶蛋白进行分子改造，以改变酶分子物 理化学性质及生物活性或赋给酶新的功能，并 最终达到人工设计合成高效的具有生物活性的 非天然酶分子。这种技术也称为生物分子工程。
（三）、细胞的固定化技术
• 1、定义：将细胞限制或定位于特定的空 间位置的方法 。 • 被限制或定位于特定空间位置的细胞称 为固定化细胞。 • 2、固定化细胞分为三种类型： • 一是固定化死细胞。细胞经过处理后只 保留所需酶的活性，而其它的酶系和整 个细胞都已失活；