细胞工程

细胞工程第1章细胞培养的设施与基本条件1、什么是细胞培养？细胞培养是最值培养的一种形式，所谓组织培养（tissue culture）习惯上泛指所有的体外培养，即器官培养、组织培养和细胞培养的总称。

其本意是指从活的机体中提取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术称为组织培养。

2、细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离为单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单细胞层生长，或在培养液呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。

3、细胞工程实验室与其他一般实验室的主要区别：严格保持无菌环境，避免微生物及其他有害因素的影响。

4、细胞工程实验室设计•原则防止微生物污染和有害因素影响•要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘划分不同功能区或用铝合金隔板隔开无菌操作区应在室内较少走动的内侧•清洗和消毒安置在另室5、细胞工程实验室核心部分：准备室、缓冲间、培养室6、细胞培养设备•CO2培养箱：CO2培养箱设定的条件为37 ℃，5％CO2 。

•使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。

②保持培养箱内空气干净。

定期消毒（90 ℃，14 h)。

③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。

7、生物安全防护水平（BSL）由一级防护屏障（安全设备）和二级防护屏障（实验室设施）组合构成四级生物安全水平。

一级生物安全防护水平（BSL－1）：适合于非常熟悉的病源，不会经常引发健康成人疾病，对实验人员和环境潜在危险小。

一般也不使用特殊的遏制设备和设施。

二级生物安全防护水平（BSL－2）：适合于对人和环境有中度潜在危险的病源，应在生物安全柜中或其它物理遏制设备中进行。

三级生物安全防护水平（BSL－3）：该会引发严重的、可能致死的疾病的病源。

在生物安全柜或其他物理遏制装置中进行，或由穿戴合适防护服及设施的实验人员进行。

实验室经过特殊设计和施工。

四级生物安全防护水平（BSL－4）：处理特别危险的传染源8、细胞培养的基本条件无菌条件：净化工作室，高效过滤器，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清细胞检测条件：倒置显微镜，高速离心机，移液器细胞保存条件：液氮罐实验室安全：生物实验室安全，P1,P2,P3,P4实验室安第2章清洗与消毒1、清洗目的：清除影响细胞生长的杂质和微生物。

要求：清洗后的器皿要干净、透明、无油迹，且无任何残留物质。

清洗完毕后的器皿在消毒前必须进行严密包装，以便消毒及储存，防止落入灰尘及消毒后再次被污染。

2.、玻璃器皿的清洗清洗后玻璃器皿的要求：干净、透明、无油迹、无残留物质玻璃器皿清洗的四个步骤：1.浸泡：新器皿→水完全浸泡过夜→刷洗→2-5%盐酸浸泡过夜/煮沸30min；用后器皿→完全浸入水中过夜，避免内部气体遗留。

2.刷洗：优质洗衣粉/清洗剂→软刷洗涤→净水彻底冲去洗液。

注意事项—保护表面光洁度；不留死角3.浸酸：清洁液酸缸浸泡，≥6小时或过夜。

清洁液变绿应重新配制4.冲洗：洗涤装置或手工流水冲洗10min以上→蒸馏水清洗3～5次，备用。

晾干/烘干→包装→高压(15磅20min)/干热(160℃,2h)3、胶塞的清洗细胞培养中所用的橡胶制品主要是瓶塞。

新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理胶塞的常规清洗方法：用后胶塞→水中浸泡→2％NaOH/洗衣粉煮沸10～20min (除蛋白质)→自来水冲洗→1％(2-5%盐酸)稀盐酸浸泡30min(15min)→自来水冲洗5次→蒸馏水冲洗5次→煮沸10-20min→晾干备用。

新胶塞(带滑石粉)→自来水冲洗→常规清洗方法4、塑料制品的清洗一次性物品：多无毒、已无菌处理，开包即用。

可重复使用制品：使用次数不宜过多。

清洗过程：残留附着物→脱脂棉清拭→流水冲洗→晾干→2％NaOH浸泡过夜→自来水冲洗→2-5％盐酸浸泡30min→自来水和蒸馏水冲洗→晾干→75%酒精浸泡/紫外线照射30min，备用。

不宜用毛刷刷洗，防止划痕。

用后应立即浸入水中，防附着物干结。

5、包装严密包装的目的：便于消毒及储存，防止再次被污染。

包装材料：用皱纹包装纸、硫酸纸、牛皮纸、棉布、铝饭盒、特制玻璃消毒筒、较大培养皿、锡箔等。

局部包装：培养瓶、滤器、盐水瓶、吸管(脱脂棉堵塞管接口端)、消毒筒管(筒底垫棉花)的口→先密封→再牛皮纸包起来备用。

全包装：较小培养皿、加样器吸头等。

铝饭盒包装：注射器、金属器械等。

包装注意事项：注意期限；标明品名等。

6、消毒：目的：严防培养物细菌、真菌和病毒等污染物理灭菌法化学消毒法抗生素消毒7、消毒与灭菌1消毒：杀死物体上病原微生物的方法；并不一定能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物2灭菌：杀死物体上所有微生物的方法3防腐：防止或抑制微生物生长繁殖的方法。

4.无菌：不存在活的微生物。

5.无菌操作：防止微生物进入机体或局部环境的操作技术。

8、影响消毒灭菌效果的因素1.影响因素：（1）消毒剂的性质、浓度与作用时间（2）微生物的污染程度（3）微生物的种类和生活状态（4）环境中有机物（5）温度、湿度、酸碱度（6）化学拮抗物2.注意事项①严格掌握所用消毒剂的浓度、消毒时间与使用方法。

②使用新鲜配制的消毒剂。

③消毒剂应置于消毒过的清洁容器内贮放备用。

④待消毒物品须洗刷干净，去除油污及血、脓等有机物方可消毒。

⑤挥发性消毒液应贮放在有盖容器内，并定期测量比重。

9、思考题：1.配制清洁液时应注意哪些问题?如何判断清洁液已经失效?2.细胞培养室常见的消毒方法有哪些?3.胶塞如何清洗?为什么?4.干热消毒和湿热消毒的区别有哪些?5.常用的化学消毒方法有哪些?第3章细胞工程的技术基础Ⅰ、无菌操作技术：细胞在体外培养过程中最怕被污染，因此，防止污染是决定细胞培养成败的关键。

无菌概念和无菌操作必须贯穿整个培养过程的始终。

1、实验器具和材料的准备在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。

有关数据的计算要事先做好。

根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。

这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。

2、洗手和着装：原则上和外科手术相同。

3、无菌培养操作进行培养时，动作要准确敏捷，不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。

Ⅱ、培养细胞的观察1、肉眼观察培养物颜色及混浊度2、倒置显微镜观察细胞生长状态1、细胞计数法细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，用以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法。

细胞计数的原则：”S”型计数，遵循数上不数下数左不数右的原则。

注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

计算细胞数量：细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×1042、细胞生长曲线细胞生长曲线是观察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标，以培养时间（d）为横坐标、细胞密度为纵坐标所做出的曲线。

常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为纵座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。

3、细胞分裂指数细胞分裂指数是指分裂期细胞在全部细胞中所占的百分率，用以表示细胞的增殖旺盛程度。

一般计数1000个细胞中的细胞分裂指数。

公式4、细胞贴壁率细胞贴壁率又称接种存活率，用于观察贴壁附着生长细胞，主要反映细胞的生存能力，和部分底物材料的相容性。

5、细胞周期细胞周期是指一个母细胞分裂结束后形成的细胞至下一次再分裂结束形成两个子细胞的时间，仅指一个细胞的分裂生长周期时间。

6、细胞活力测定方法MTT比色法：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。

二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。

再用酶标仪测定OD值。

CCK-8 法（Cell Counting Kit-8）：试剂中含有WST-8【2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基）-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体【1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲脂】(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料(Fromazan dye)。

甲瓒染料的数量与活细胞数量成正比，因此可以根据测定吸光度值来测定增值细胞和活细胞数。

Ⅲ、细胞培养中常用的染色方法1、活体染色体外活体染色就是在体外条件下用某种染色剂（即活体染料）对活的细胞或组织进行染色，而不影响活细胞的生命活动的一种方法。

利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，经染色的培养物还可以继续进行培养。

活体染料：1）碱性活体染料：a、噻嗪类（次甲基蓝、甲苯胶蓝）b、哑喷类（量焦油蓝、量焦油紫）c、吖嗪类（中性红、詹纳斯绿）d、三酚苯甲烷类（甲基紫、维克多利亚蓝）2）酸性活性染料：（台盼蓝、刚果红、吡咯蓝）体外活体染色一般用碱性活体染料。

酸性活体染料只用于体内活体染色，体外活细胞难以着色。

体内活体染色时，注射的染料浓度可高达1％～2％。

体外活体染色以1‰～0.3 ‰浓度较为合适可以用平衡盐溶液、PBS或生理盐水配制2、活体染色的方法（1）台盼蓝染色1）用Hank’s液配制0.1％台盼蓝溶液；2）用0.5％胰蛋白酶：0.2％EDTA＝1：1混合液消化培养的贴壁细胞；3）加入适量的Hank’s液制成细胞悬液；4）每毫升细胞悬液加入10μl 0.1％台盼蓝溶液，混匀；5）用毛细吸管吸少许混合液置细胞计数板，并在显微镜下计数；6）计数1000个细胞中的活细胞（不着色）和死细胞（染上蓝色）数目。

计算活细胞百分比。

（2）吖啶橙荧光染色：吖啶橙是一种常用荧光染料，用于直接观察活细胞或固定染色观察细胞。

它可与细胞内的DNA、RNA结合，但发出的荧光颜色也不一样，DNA呈亮绿色，RNA呈橘红色至火红色。

3、染料排除检测法由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却不被排除，因而细胞显示一定的颜色。

而活细胞由于能排除进入细胞内的染料，故不易着色。

1、台盼蓝排除检测法2、溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法：溴化乙锭（EB）和碘化丙锭（PI）均为荧光染料，可与DNA特异结合。

1）染液配制：取EB或PI 5mg、枸橼酸钠0.1g、NP-40 0.3ml，共溶于100ml蒸馏水中，避光保存。