蛋白质组学主要技术简介
蛋白质组学三大基本技术
蛋白质组学三大基本技术
1、质谱技术：质谱技术是蛋白质组学中最常用的和最基本的技术，它可以检测和识
别各种生物样品中的蛋白质和其他大分子有机物，从而可以提高研究的准确性，特别是在
研究动态蛋白信号转导及表观遗传因子的时候，质谱技术的应用更加广泛。
质谱技术包括
两种：基于气相法的高级数据库技术，和基于液相法的maldi技术。
质谱技术主要是利用
质谱仪来获取受体上蛋白质结构的数据，然后利用数据库搜索，来识别出蛋白质结构特征
及在受体上的结合状态。
2、SDS-PAGE技术：SDS-PAGE技术是一种蛋白电泳分析技术，它可以分离组成复合蛋
白的每个蛋白质组分，并对蛋白质的组成成分及其特有的分子量进行测定，是一种蛋白质
分类及检测的基础性技术。
SDS-PAGE技术利用聚丙烯酰胺亚胺(SDS)作为为分子内部量均
分剂，可将蛋白链折叠、聚集形成单个分子，然后进行电泳分离操作，在膜隔开一定距离，然后再对所获取到的蛋白分子特征进行识别，以得出它的结构和分子量的信息，进而得出
受体上分子的特征及其功能。
3、免疫淋巴细胞技术：免疫淋巴细胞技术是实验可能性较好、分离效果更好。
它以
电泳分离技术作为分离介质，从新鲜样品中分离出完整的肽盐化药物，可有效地检测及克
隆受体上的蛋白片段及肩膀，进而得出蛋白质组学上受体特征及其功能。
蛋白质组学及技术介绍PPT通用课件.ppt
3.二相SDS-PAGE
丙烯酰胺/甲叉双丙烯 酰胺溶液
分离胶缓冲液
10%（w/v）过硫酸铵 溶液
（30.8%T，2.6%C）：30%（W/V）丙烯酰胺和 0.8%甲叉双丙烯酰胺的水溶 液。将 300g 丙烯酰胺和 8g 甲叉双丙烯酰胺溶解于去离子水中，最后用去离
研究 内容
蛋白质的研究内容主要有两方面：
1、结构蛋白质组学：主要是蛋白质表达模型的研究，包括蛋白质氨基酸序列 分析及空间结构的解析种类分析及数量确定; 2、功能蛋白质组学：主要是蛋白质功能模式的研究，包括蛋白质功能及蛋白 质间的相互作用。
研究 内容
蛋白质组学可分为三个主要领域： 1、蛋白质的微特性以供蛋白质的规模化鉴定和他们的后翻译饰； 2、“差异显示”蛋白质组学供蛋白质水平与疾病在广泛范围的有力应用比 较； 3、应用特定的分析技术如质谱法（包括串联质谱法、生物质谱法）或酵母 双杂交系统以及其他蛋白质组学研究新技术研究蛋白质-蛋白质相互作用。
该方法所研究的蛋白均是在体内经过翻译后修饰的，并且是可 分离的天然状态的相互作用蛋白复合物，能够反映正常生理条件下的 蛋白质间相互作用
蛋白质相互作用
2、酵母双杂交系统：
该系统利用真核细胞调控转录起始过程中，DN A结合结构域(binding domain,BD)识别DNA上的特异序列并使转录激活结构域(activation domain, AD)启动所调节的基因的转录这一原理，将己知蛋白X和待研究蛋白Y的基 因分别与编码AD和BD的序列结合，通过载体质粒转入同一酵母细胞中表 达，生成两个融合蛋白。若蛋白X和Y可以相互作用，则AD和BD在空间上 接近就能形成完整的有活性的转录因子，进而启动转录，表达相应的报告 基因;反之，如果X和Y之间不存在相互作用，报告基因就不会表达。这样， 通过报告基因的表达与否，便可确定是否发生了蛋白质的相互作用。
蛋白质组学的研究技术
蛋白质组学的研究技术
1. 蛋白质组分离技术
在蛋白质组学研究中，最先要做的就是将蛋白质分离出来，从而得到纯度较高的蛋白质。
目前常用的蛋白质分离技术包括凝胶电泳、液相色谱和质谱等方法。
其中，凝胶电泳是最常用的蛋白质组分离技术之一，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和二维凝胶电泳（2-DE）等。
蛋白质组学的目的在于研究蛋白质的种类和结构，因此鉴定蛋白质是非常重要的一个环节。
目前比较流行的蛋白质组鉴定技术主要包括质谱和基因组学方法。
其中，基因组学方法包括通过对已知的基因组序列进行比对，来鉴定和预测蛋白质序列。
而质谱则主要是通过对蛋白质的分子量和氨基酸序列等特征进行分析和鉴定。
蛋白质的表达和生物学功能密不可分，因此研究蛋白质的表达非常重要。
目前可供选择的蛋白质组表达技术包括基因工程技术和化学合成技术等。
其中，基因工程技术是最常用的表达技术之一，可以通过将外源DNA序列转化到宿主细胞或者器官中来表达蛋白质。
蛋白质组学研究产生的数据量非常大，因此需要利用计算机和大数据分析技术来对数据进行处理和分析。
这其中涵盖了数据清洗、数据预处理、特征提取和建模等多个方面。
此外，还需要采取一些数据可视化的方法，以让研究人员更直观的观察和理解数据。
蛋白质组学的应用范围非常广泛，包括药物研发、疾病诊断和治疗等领域。
例如，蛋白质组学在癌症诊断、药物靶点鉴定和药物作用机制等方面都有着重要的应用，这些应用也推动了蛋白质组学的迅速发展。
总之，蛋白质组学技术不断创新和发展，可以解决大量生物学和生物医学领域中的重要问题，对于深入探究蛋白质生物学领域的各种问题具有不可替代的作用。
蛋白质组学技术
蛋白质组学技术
蛋白质组学技术指在蛋白质组学研究中所用到的各种技术。
质谱技术是蛋白质组学技术中可实现高通量分析的技术之一，可用于蛋白质组的定性和定量分析。
百泰派克生物科技提供基于质谱的蛋白质组学分析服务。
蛋白质组学技术
蛋白质组学技术指在蛋白质组学研究中所用到的各种技术，包括蛋白质分离纯化技术、鉴定和测序技术、定量技术以及生物信息学分析技术等等。
纯化蛋白质的常规技术一般基于色谱，如离子交换色谱（IEC）、尺寸排阻色谱（SEC）和亲和色谱。
分析选择性蛋白质则可以使用ELISA和western blot技术，但是这些技术一般仅限于分析少数单个蛋白质，且无法确定蛋白质的表达水平。
质谱技术可用于确定蛋白质的氨基酸序列。
利用ICAT、iTRAQ等标记技术可对蛋白质组进行定量分析。
X 光散射技术和核磁共振（NMR）则可提供蛋白质的三维结构信息，这可能有助于理解蛋白质的生物学功能。
蛋白质组学技术。
蛋白质组学技术应用
蛋白质组学研究通过利用不同的技术来鉴定和量化细胞、组织或生物体中存在的总蛋白质，通过使用一种或多种蛋白质组学技术可完整描述细胞的结构和功能信息，以及细胞对各种类型的压力和药物的响应机制。
蛋白质组学技术可被用于多种不同
的研究环境，如用于检测各种诊断标志物、疫苗生产候选物，开发新药物，了解致病机制、应对不同信号改变的表达模式，以及解释不同疾病中的功能蛋白途径等。
蛋白质组学技术及其在疾病研究中的应用
蛋白质组学技术及其在疾病研究中的应用蛋白质是生命现象中最为重要的一类分子，它们承担着细胞的各种生理活动，构建着生物体内的结构与功能。
对于疾病的研究而言，蛋白质的作用至关重要，理解各种蛋白质的功能和相互作用关系，对于治疗各种疾病具有重要的参考价值。
而蛋白质组学技术正是探索蛋白质这一领域的重要手段之一。
一、蛋白质组学技术简介蛋白质组学技术是指通过一系列的实验手段，尝试从全局的角度解析细胞和组织中的所有蛋白质及其功能。
主要包括蛋白质质谱和蛋白质芯片两个方面。
1. 蛋白质质谱蛋白质质谱是指利用质谱技术对蛋白质进行分析鉴定。
它的工作流程主要包括蛋白质的提取、分离、消化、质谱检测等步骤。
其中最关键的环节是质谱检测，通过对蛋白质的质谱图谱进行解析，可以得到蛋白质的序列信息、结构信息以及定量信息等。
2. 蛋白质芯片蛋白质芯片是一种将具有致病性的蛋白质以及与之相关的蛋白质进行组合，构建成芯片的技术。
它可以通过与样品中的蛋白质结合，快速检测肿瘤标记物、生物标志物等。
在蛋白质芯片上，可以将不同样品的蛋白质进行定量比较，了解不同样品的蛋白质差异。
二、蛋白质组学技术在疾病研究中的应用1. 肿瘤研究蛋白质组学技术在肿瘤研究中扮演着重要的角色。
它可以通过对肿瘤细胞和正常细胞中的蛋白质组成进行比较，找到在肿瘤病理生理过程中发生变化的蛋白质。
利用这些蛋白质可以筛选潜在的生物标志物和靶向治疗药物。
例如，HER2在人类乳腺癌中的异常表达，可以通过蛋白质质谱技术进行检测，并导入临床治疗。
2. 器官移植研究同种异体移植是治疗某些疾病的有效手段。
但是，历经多次移植后，移植物无法被宿主体所接纳，这成为了制约移植效果的关键因素。
在器官移植领域，蛋白质组学技术能够帮助研究人员了解移植物和宿主体之间发生的相互作用。
例如，通过分析术前和术后的血浆样本，可以发现具有免疫调节功能的蛋白质在器官移植过程中发挥了重要作用。
3. 神经退行性疾病研究神经退行性疾病是一类严重的疾病，目前并没有有效的治疗手段。
蛋白质组学三大基本技术
蛋白质组学三大基本技术
蛋白质组学是一种研究蛋白质结构和功能的科学，它为研究蛋白质及其相互作用提供了一种有效的手段。
蛋白质组学的基本技术主要有质谱分析、电泳分析和免疫分析三种。
质谱分析是蛋白质组学中最重要的技术，它可以确定蛋白质的结构和物质组成，以及蛋白质之间的相互作用。
质谱分析主要通过电喷雾电离和高能质谱来确定蛋白质的结构和物质组成，从而可以研究蛋白质的自由基反应和结合反应。
电泳分析是蛋白质组学中另一重要的技术，它可以用来检测蛋白质的结构和特性。
电泳分析主要通过静电层析、交叉层析、离子交换层析、聚焦层析等手段来研究蛋白质的结构和特性，从而可以研究蛋白质的分子量、组成以及与其他蛋白质之间的相互作用。
免疫分析是蛋白质组学中最后一项基本技术，它可以用来研究蛋白质的抗原性和抗体识别特性。
免疫分析通常通过免疫印迹、免疫沉淀、免疫荧光和免疫质谱等方法，来检测蛋白质的抗原性和抗体识别特性，从而研究蛋白质的结构和功能。
总之，蛋白质组学的基本技术包括质谱分析、电泳分析和免疫分析三种，它们可以帮助我们研究蛋白质的结构和功能，为蛋白质组学的研究提供了重要的技术支持。
蛋白质组学及技术介绍
蛋白质组学及技术介绍蛋白质组学是研究细胞、组织和生物体中蛋白质产生、结构、功能以及相互作用的一门科学。
蛋白质是生物体中最重要的有机物之一，扮演着许多生理和生化过程的关键角色。
蛋白质组学的目标是通过大规模研究蛋白质的组成、结构和功能，深入了解生物体的调控机制和疾病的发生发展规律。
蛋白质组学的研究内容包括蛋白质的鉴定、分类、结构分析、表达调控、功能研究等。
与基因组学类似，蛋白质组学也具有高通量、全面性、定量性等特点。
蛋白质组学研究可以帮助科学家在生物体水平上揭示生物的基本功能，并揭示蛋白质在各种生理和病理过程中的重要作用。
1.蛋白质分离技术：蛋白质组学研究需要从复杂样品中分离目标蛋白质。
常用的蛋白质分离方法有SDS-、二维电泳等。
其中，二维电泳是一种常用的高分离效果的方法，可以将蛋白质根据等电点和分子量进行分离，更好地了解蛋白质组成。
2.质谱法：质谱法是蛋白质组学研究中最重要的技术之一、质谱法可以用来鉴定蛋白质的氨基酸序列、确定修饰位点、测定蛋白质的分子量等。
常用的质谱方法包括MALDI-TOF、ESI-MS等。
3. 蛋白质组分析软件：蛋白质组学研究得到的大量数据需要通过蛋白质组分析软件进行处理和分析。
这些软件可以对质谱数据进行解析、蛋白质鉴定和定量分析等。
常用的分析软件包括Mascot、MaxQuant等。
4.蛋白质相互作用研究技术：蛋白质在生物体内通常与其他蛋白质相互作用，形成复杂的蛋白质网络。
蛋白质相互作用研究技术可以帮助科学家了解蛋白质在细胞内的功能调控机制。
常用的蛋白质相互作用研究技术有酵母双杂交、蛋白质亲和纯化、共免疫沉淀等。
5.大规模蛋白质组测定技术：蛋白质组学研究需要同时分析大量的蛋白质样品。
目前，已经发展出了很多高通量、全面性的蛋白质组测定技术，如蛋白质芯片技术、TMT标记质谱技术等。
这些技术可以同时分析大量样品，提高研究效率。
总之，蛋白质组学及其相关技术在生物学、生物医学研究中具有重要的地位和应用前景。
蛋白质组学主要研究技术
蛋白质组学主要研究技术目前蛋白质组学的研究手段主要依靠分离技术、质谱技术和生物信息学的发展。
分离技术要求达到高分辨率和高重复率，质谱技术主要包括MALDI-TOF、Q-TOF与MS/MS等质谱设备以及样品的预处理，生物信息学则利用算法的改进和数据库查询比对的完善提高数据结果的判断。
1. 蛋白质组学的分离技术目前蛋白质组学研究广泛采用的是双向电泳技术。
高通量性、对实验要求低、操作简便快速是双向电泳具有的最大优点，它特别适合大规模的蛋白质组学研究。
尽管当前蛋白质的分离技术多种多样，但目前仍然没有一种可以彻底地取代双向电泳技术。
从1975年，O’Farrells[8]等将IEF与SDS-PAGE结合创立了2D-PAGE电泳技术以来。
双向电泳技术在多个方面都得到了提高和改进：(1) IPG胶条的使用。
传统的载体两性电解质等电聚焦存在上样量小、长时间电泳过程中pH梯度不稳定、阴极漂移现象及其导致的碱性蛋白损失、不同批次间重复性差等问题。
IPG 胶条的使用使这些问题得到了极大的改善，这使蛋白质双向电泳数据库的建立成为现实；(2) 样品制备：蛋白质样品的质量好坏从根本上决定了电泳最终结果的好坏。
双向电泳的样品制备有两个关键点，即如何使样品中蛋白质充分溶解以及尽可能减少影响等电点聚焦的杂质，特别是带电杂质。
采用超声或核酸酶处理的方法可以去除核酸，超速离心可除去脂类和多糖，透析、凝胶过滤或沉淀/重悬法可以降低盐浓度。
近来的研究发现磺基甘氨酸三甲内盐（ASB14-16）的裂解效果最好，而2mol/l的硫脲和4%的表面活性剂CHAPS的混合液能促使疏水蛋白从IPG到第二相胶的转换。
以三丁基膦（TBP）取代β-巯基乙醇或DTT，可以完全溶解链间或链内的二硫键，增强了蛋白质的溶解度，并促进蛋白质向第二向的转移。
另外，双向电泳中对低丰度蛋白的分离识别比较困难，除了显色技术的局限外，还存在容易被高丰度蛋白掩盖的问题，这样得到的蛋白质图谱很不完整，经常会忽略那些在生命过程中发挥重要功能的微量活性分子。
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自发辐射
原子在没有外界干预的情况下，电子 会由处于激发态的高能级E2 自动跃迁至低 能级E1，这种跃迁称为自发跃迁。 自发辐射光子频率
E2 E1 h
E2 E1
h
受激辐射 当原子中的电子处 E2 E1 于高能级时，若外来 h 光子的频率恰好满足 时，电子会在外来光子的诱发下向低能 级跃，并发出与外来光子一样特征的光 子----受激辐射。 E2 E1
蛋白质组学主要技术简介
杨学习 生物技术学院
蛋白质组（proteome）
Proteome＝PROTEins + genOME，意思是
Proteins expressed by a genome（基因组表达的所
有蛋白质）。
一个基因组、一种生物或一种细胞/ 组织所表达的
全套蛋白质
人蛋白质清单的估计
同普通SDS-PAGE类似。
无需浓缩胶？
在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非 限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。
Hale Waihona Puke 注意：进行第二向SDS-PAGE时，要求恒温， 但温度不要低于15℃，否则会引起凝胶收缩， 影响蛋白从胶条向第二向凝胶的转移。
7. 2D胶的染色
理想显色剂的7S
安全（safety）：
灵敏（sensitivity）：
简单（simplicity）： 特异性（specificity）： 快速（speed）： 稳定（stability）： 兼容性（synergy）：
有机染料和银染:会减少胶内蛋白质产量。
胶体考马斯亮蓝染色灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍
形态上（普通染色）
表型或功能上（荧光染色） （同质性）
二、二维凝胶电泳技术
二维电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2DE)，又称双向电泳
第一向:等电聚焦分离，第二向:SDS-PAGE 两种不同性质
等电点
分子量
分辨率远高于其他任何一种单一的电泳方法，是目 前分析混合蛋白质样品最有效的手段。
三、生物质谱技术
原理:将样品离子化,根据不同的质量和电荷差 异确定分子量的技术
应用:蛋白质序列分析 蛋白质修饰分析
最重要的鉴定技术（支柱）
1.概述
化合物分子受到电子流冲击后，形成的带正电荷分子离子及碎片离子， 按照其质量m和电荷z的比值m/z（质荷比）大小依次排列而被记录下 来的图谱，称为质谱。
一个细胞的蛋白质组
5000条多肽
一个人瞬时的蛋白质组 100 000条多肽
一个人整个生命周期的蛋白质组 1 000 000 条多肽
蛋白质组研究整体技术的特点
规模化 通量化 自动化
技术目标（要求）
有效分离
准确鉴定
合理分析
预分离 同质 均一
激光捕获显微切割（LCM）技术
双向电泳实验流程
1. 2. 3. 4.
样品制备（Sample preparation） 固相预制胶条的水化（IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（IEF） 胶条的平衡（IPG strip equilibration）
5.
6. 7. 8.
胶条转移
第二向SDS-PAGE电泳（SDS-PAGE electrophresis） 凝胶的染色及检测（Detection/Staining） 图像分析（Software analysis）
银染:线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。缺点是：对某些种类 的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。
负染:
能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。 结果
表现为胶面着色而蛋白质点透明。
速度快（5~15min），蛋白质的生物活性能保持。 它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。
第三步：含复合表面活性剂的蛋白溶解液
膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。
1、样品制备
样品中核酸的去除
对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形
成复合物后会出现假象迁移和条纹。
解决方法：
不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解
合成载体两性电解质（SCA）同核酸结合形成复合
物，通过超速离心来去除复合物
质谱分析法（Mass Spectrometry, MS）是在高真空系统中测定样
品的分子离子及碎片离子质量，以确定样品相对分子质量及分子结构
的方法。
同位素质谱、无机质谱、有机质谱、生物质谱
发展概况:
第一台质谱仪是英国科学家阿斯顿（F.W.Aston，1877—1945）于 1919年制成的。
下室温12h,使IPG干胶条边水化膨胀边上样。
IPG IEF 中pH梯度的选择
常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，预
试验确定。
3. 第一向 等电聚焦 (isoelectric focusing, IEF)
聚焦时间的优化
理论上讲，要获得最好的图谱质量和重复性所需最佳时间是IEF分离 达到稳定态所需的时间。
Laser Capture Micro-dissection，是直接在光 学显微观察的基础上，利用激光能量对特定 的组织或细胞类型进行切割，从而获得均一 性的样品。
– 提到激光时脑海中的第一印象？
激光应用
• 军事
– 激光测距 – 直接摧毁 – 激光制导
激光应用
– 医疗：
• 最早的激光医疗应用：1961年12月在哥伦比亚长老会医院用红 宝石激光器进行了视网膜肿瘤治疗； • 肿瘤治疗； • 眼科手术：视网膜焊接、近视治疗； • 美容； • 外科手术等。
8. 图像分析
在用双向电泳进行差别表达蛋白质组分析时， 需要利用软件对产生的2D胶进行差别分析，
以寻找差别表达蛋白。
常用的软件如安玛西亚公司的Image Master
2D Elite或Image Master 2D Planium分析软件。
Image analysis with ImageMaster Platinum
德国Carl Zeiss公司PALM激光显微切割系统
第三代技术特点：
全自动系统，速度快 适应蛋白分析的需求
荧光激发模块
无接触的样品收集方式
•样品收集器可快速更换收集管 •多样品收集，可以通过软件控制自动选择样 品收集器的收集管
适用的组织样品
LCM优点和特性
快速简单、有效减少交叉污染 样品的切割与分离由激光一步完成，并可以保 持被分离的样品的完整性。 对制样的要求灵活多样，使用范围较广
发现了多种元素同位素 研究了53个非放射性元素 发现了天然存在的287种核素中的212种 第一次证明原子质量亏损。 他为此荣获1922年诺贝尔化学奖。
Present in (a) and (c) not (b)
/blog/introduction-to-2d-gel-electrophoresis/
视频
/html/video/2009/0807/1968.ht ml /html/video/2009/0807/1967.ht ml /html/video/2009/0807/1966.ht ml
第一代激光微切割技术
laser capture microdissection (LCM)
1995年Liotta教授等进一步发展的非接触性激光显微切割技 术（non-contact laser microdissection of membranemounted native tissue）使得显微切割实现了高度精确、
h
全同光子
实验表明，受激辐射产生的光子与外 来光子具有相同的频率、相位和偏振 方向。
光放大 在受激辐射中通过一个光的作用，得 到两个特征完全相同的光子，如果这两个 光子再引起其它原子产生受激辐射，就能 得到更多的特征完全相同的光子----光放 大，激光。
粒子数正常分布和粒子数反转
E2
E1
N2 N1
Laser Microbeam Microdissection LMM Laser Pressure Catapulting LPC
基于第一代的缺点，开创性地采用紫外激光沿样品外缘切割的工 作方式，利用激光离焦面的冲击力，将分离后的样品向上弹射 收集
-
系统特性： 无接触方式捕捉样本，避免污染 无热传送，无损DNA、RNA和蛋白结构或 或细胞的存活能力 激光切割精度小于1微米 可将不同种类的细胞，自动分类切割到不 同的离心管内
1、样品制备
防止化学修饰、聚集和沉淀
添加酶抑制剂
防蛋白质水解，目前多用PMSF、
EDTA/EGTA或甲苯磺酰赖氨酸氯甲酮（TLCK）
/甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）等
低温
防聚集、沉淀
2. IPG 胶条重泡胀(rehydration)和 上样(loading)
一般采用预制的IPG干胶条（商品化），需要用重泡胀 液(rehydration solution)使其重性水化膨胀成凝胶，使 样品能够充分进入凝胶内，完成上样。 可用重泡胀液在室温浸泡12h后上样，或在低电压(30v)
差别分析(Differential analysis)