显微镜成像方法与技术-3
实验三 电子显微镜技术的演示
实验三电子显微镜技术的演示背景知识：普通光学显微镜通过提高和改善透镜的性能，使放大率达到1000~1500倍左右，但一直未超过2000倍。
这是由于普通光学显微镜的放大能力受光的波长的限制。
为了从更高的层次上研究物质的结构，必须另辟蹊径，创造出功能更强的显微镜。
20世纪20年代法国科学家德布罗意发现电子流也具有波动性，其波长与能量有确定关系，能量越大波长越短，比如电子学1000伏特的电场加速后其波长是0.388埃，用10万伏电场加速后波长只有0.0387埃，于是科学家们就想到是否可以用电子束来代替光波，这是电子显微镜即将诞生的一个先兆。
用电子束来制造显微镜，关键是找到能使电子束聚焦的透镜，光学透镜是无法会聚电子束的。
1926年，德国科学家蒲许提出了关于电子在磁场中运动的理论。
他指出：“具有轴对称性的磁场对电子束来说起着透镜的作用。
”这样，蒲许就从理论上解决了电子显微镜的透镜问题，因为电子束来说，磁场显示出透镜的作用，所以称为“磁透镜”。
1931年，德国柏林工科大学的Knoll和Ruska制作成功第一台电子显微镜──它是一台经过改进的阴极射线示波器，成功地得到了铜网的放大像──第一次由电子束形成的图像，加速电压为7万，最初放大率仅为17倍。
尽管分辨率还不如光学显微镜高，但它却证实了使用电子束和电子透镜可形成与光学像相同的电子像。
经过不断地改进，1933年Ruska和Bodo Von Borries又制成了第二台两级短焦距的电子显微镜，获得了金属箔和纤维的放大1万倍的电子图像。
虽然放大率得到提高，但分辨率当时还刚刚达到光学显微镜的水平。
1937年应西门子公司的邀请，Ruska建立了超显微镜学实验室。
1939年西门子公司制造出分辨本领达到30埃的世界上最早的实用电子显微镜，并投入批量生产。
随后，透射电镜的商业产品由美国无线电公司于1941年开始制作生产。
电子显微镜的出现使人类的洞察能力提高了好几百倍，不仅看到了病毒，而且看见了一些大分子，即使经过特殊制备的某些类型材料样品里的原子，也能够被看到。
光学显微技术
7、微分干涉显微
differentialmicroscope） （differential-interference microscope） 1952年，Nomarski在相差显微镜 年 在相差显微镜 原理的基础上发明。 原理的基础上发明 DIC显微镜使细胞的结构 显微镜使细胞的结构， 。 DIC显微镜使细胞的结构，特 别是一些较大的细胞器， 别是一些较大的细胞器，如 优点: 优点 能显示结构的三维立体投影影 DIC显微镜 显微镜 线粒体等， 核、线粒体等，立体感特别 与相差显微镜相比，标本可厚,折 像。与相差显微镜相比，标本可厚 折 下的硅藻 适合于显微操作。目前 强，适合于显微操作。，故影像立体感更强。 射率差别更大， 射率差别更大 故影像立体感更强。 （伪彩色） 伪彩色）
3Figure 3-2. Interference between light waves. When two light waves combine in phase, the amplitude of the resultant wave is larger and the brightness is increased. Two light waves that are out of phase partially cancel each other and produce a wave whose amplitude, and decreased. therefore brightness, is decreased.
像基因注入、核移植、转基 基因注入、核移植、 因等的显微操作常在这种显 微镜下进行。 微镜下进行。
四种类型显微镜对成纤维细胞观察效果的比较： 四种类型显微镜对成纤维细胞观察效果的比较： (A) 明视野显微镜 (B) 相差显微镜 (C) 微分干涉显微镜 (D) 暗视野显微镜
超分辨显微镜的工作原理与成像技术
超分辨显微镜的工作原理与成像技术超分辨显微镜是一种先进的光学显微镜，具有很高的分辨率和成像能力，可以观察到微观领域中细小的结构和现象。
本文将介绍超分辨显微镜的工作原理和成像技术，以及其在生物医学、材料科学和纳米技术等领域的应用。
一、工作原理超分辨显微镜的工作原理基于曲折规律和波的衍射。
传统光学显微镜由于照明光束的衍射限制，无法分辨出比光的波长还要小的物体细节。
而超分辨显微镜通过使用特殊的技术，克服了这一限制。
1.1 衍射极限传统光学显微镜的分辨率受到衍射极限的限制。
衍射极限（称为耐克斯特准则）是由德国物理学家安德烈亚斯·耐克斯特提出的，规定了光学系统能够分辨物体的最小尺寸，即0.61倍的照明光波长。
超过这个极限，显微镜就无法分辨出物体的细节。
1.2 超分辨技术超分辨显微镜采用了多种技术来突破衍射极限，实现更高的分辨率。
其中最常见的技术包括：1.2.1 利用荧光标记超分辨显微镜可以通过利用荧光标记结合合适的成像技术，将被观察物体的特定部分标记出来，并对其进行成像。
这些标记物在光的刺激下会发出荧光信号，通过检测和分析这种信号，可以实现纳米级的分辨率。
1.2.2 利用近场效应近场光学显微镜利用装载在探针尖端的金属纳米结构，利用探针与样品之间的极短距离来增强照明光的局部电场，从而实现超分辨成像。
这种技术在表面等离子激元共振和原子力显微镜中得到广泛应用。
1.2.3 利用建构性干涉通过将两束光进行干涉，可以在显微镜中形成特定的干涉模式。
这种模式包含了被观察物体的高频细节信息。
运用适当的算法和数学处理，可以从干涉模式中提取出高分辨率的图像。
二、成像技术超分辨显微镜采用多种成像技术来获取高分辨率图像。
以下是几种常用的成像技术：2.1 结构光成像结构光成像利用相干光束通过物体表面，通过记录物体与光束的相互作用，实现高分辨率的三维成像。
利用这种技术，可以获得具有亚微米分辨率的物体表面拓扑图像。
2.2 荧光成像荧光成像是利用带有荧光标记的样品在激发光线照射下发出的荧光信号进行成像。
光学显微成像技术原理分析
光学显微成像技术原理分析光学显微成像技术是一种将物体的微小细节放大并显示到人类视野中的技术。
该技术的应用范围广泛，可以帮助科学家们研究微生物、细胞、组织等生物体系统。
在工业、医学和生物学研究领域，光学显微成像技术都扮演着重要的角色。
光学显微镜（OM）是一种使用可见光束的光谱成像技术。
它利用光学透镜系统将一个小样品放大，并显示在一个结果的图像上。
这个图像可以由人类视觉系统看到。
要理解OM的工作原理，首先我们需要了解光学成像原理。
成像原理可以用光的传播方式来解释。
当光经过一个介质（例如空气，玻璃或液体）时，它的速度会改变，这会影响光线的传播方式。
光进入透镜系统中时，透镜会将其聚焦并放大。
成像原理是基于光线的反向传播方式的。
当我们在看样品时，它的组成会影响样品在显微镜留下的光线。
例如，细胞的内部结构可以通过折射率差异和反射率来探测。
光学显微成像技术有许多种形式，包括亮场显微镜、荧光显微镜和偏光显微镜等等。
这些成像技术使用不同的技术来增强成像效果。
下面将对其中两种常见的成像技术进行简要介绍。
亮场显微镜是最常见的光学显微成像技术。
它使用亮光照射样品，并通过传输光使得样品成像。
它的原理是根据样品对光的吸收和散射效应来显示图像。
它适用于对内部结构不透明的样品进行观察。
例如，可以使用亮场显微镜观察昆虫的结构，该结构不透明且可以反射光线。
荧光显微镜则是专门用来观察荧光染料的成像技术。
在得到样品后，先使用荧光染料使特定的细胞或组织发出特定颜色的荧光。
这些荧光可以在黑暗的环境下被观察到，并通过摄像机记录下来。
荧光显微镜的优点是可以使各个标记成分之间更加清晰可见，扫描深度也比亮场显微镜更深。
总之，光学显微成像技术已经成为许多科学领域的重要工具。
我们继续不断提高技术的能力与灵敏性，使得它在医疗上，生命科学领域，以及研究各种工业领域均能发挥重要的作用。
3d显微镜技术原理
3d显微镜技术原理3D显微镜技术原理引言：3D显微镜技术是一种先进的显微镜技术，它可以提供具有深度感的三维显微图像。
这种技术在许多领域有着广泛的应用，如生物医学研究、材料科学和纳米技术等。
本文将介绍3D显微镜技术的原理及其应用。
一、3D显微镜技术的基本原理1. 光学原理：3D显微镜技术是基于光学原理实现的。
当光线通过样品时，会发生散射和折射现象。
通过对光线的散射和折射进行测量和分析，可以获得样品的三维形貌信息。
2. 双目视差原理：3D显微镜技术利用双目视差原理来实现对样品的三维成像。
通过在显微镜中加入两个成像系统，分别对样品进行观察，然后通过计算两个成像系统之间的视差，可以获得样品的三维信息。
3. 图像处理算法：为了获得更准确的三维图像，3D显微镜技术还需要进行图像处理。
常用的图像处理算法包括双目视差算法、结构光投影算法和相位测量算法等。
这些算法可以提取图像中的深度信息，并生成真实的三维图像。
二、3D显微镜技术的应用1. 生物医学研究：3D显微镜技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
通过观察和分析生物样品的三维结构，可以揭示生物体内部的微观结构和功能。
例如，在细胞研究中，可以利用3D显微镜技术观察细胞的形态和内部结构，进而研究细胞的功能和疾病发生机制。
2. 材料科学：3D显微镜技术在材料科学领域也有着重要的应用。
通过观察和分析材料的三维形貌和微观结构，可以研究材料的性能和功能。
例如，在金属材料研究中，可以利用3D显微镜技术观察金属晶粒的形态和分布，进而研究金属材料的力学性能和耐腐蚀性能。
3. 纳米技术：3D显微镜技术在纳米技术领域有着重要的应用。
由于纳米材料具有特殊的物理和化学性质，利用传统的显微镜技术往往无法观察到纳米结构的细节。
而3D显微镜技术可以提供高分辨率的三维图像，能够观察到纳米材料的形貌和结构。
三、3D显微镜技术的发展趋势1. 高分辨率：随着器件制造技术的不断进步，3D显微镜技术的分辨率也在不断提高。
光学显微镜技术
光学显微镜技术第一章概述第一节显微镜的作用人眼对微观世界观察的局限性光学显微镜是人类探索微观世界的光学精密仪器光学显微镜的发展在很大程度上决定了人们对生命现象的认识第二节显微镜的类型根据照明源的性质一、光学显微镜：利用可见光（或紫外光）为照明源，一般有单式及复式显微镜两类。
复式显微镜可分为：1.普通型：常规使用。
2.特种型：如荧光、相衬显微镜等；供专门观察和研究。
3.高级型：万能显微镜。
4.共焦激光扫描显微镜（Confocal）。
第三节光学显微镜的发展简史1625年法布尔提出显微镜的概念1610年伽利略制造出具有物镜、目镜及镜筒的复式显微镜1611年开普勒说明了显微镜的原理1665年虎克制造出放大140倍的显微镜，提出“Cell”的概念1684年惠更斯制造出双透镜目镜：惠更斯目镜19世纪阿贝提出显微镜的完整理论1902年艾夫斯建立了双目镜系统1935年泽尼克发现了相衬原理，并因此获得诺贝尔奖20世纪60年代微分干涉衬显微镜问世20世纪80年代共焦激光扫描显微镜开始应用第四节显微镜的基本光学原理一、折射与折射率光线的折射现象物质的折射率二、透镜的性能凸透镜可以会聚光线凹透镜可以发散光线三、透镜的成像质量象差：是指透镜所形成的象与理想象在形状、颜色等方面存在差异。
色差：由于不同的颜色光线折射率差异而形成的象差。
色差的校正（1）采用单色光为光源。
（2）利用透镜的性质。
四、显微镜的成象（几何成象）原理利用凸透镜成象原理物镜成象：利用物体在凸透镜一倍焦距以外二倍焦距以内，成倒立的放大的实象。
目镜成象：是利用物体在凸透镜一倍焦距以内，成正立的放大的虚象。
显微镜成象原理：第二章、显微镜的主要光学技术参数第一节数值孔径（Numerical Aperture，NA）数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体间介质的折射率（η）和孔径角（u）半数正弦的乘积。
用公式表示：NA= ηsin u/2数值孔径代表了物镜或聚光镜光通量的大小，是衡量物镜或聚光镜性能高低的重要指标。
【显微光学】显微镜光学原理及技术参数详解
显微镜光学原理及技术参数详解目录1 第一章：显微镜简史 (2)2 第二章显微镜的基本光学原理 (2)2.1 折射和折射率 (2)2.2 透镜的性能 (2)2.3 影响成像的关键因素—像差 (2)2.3.1 色差（Chromatic aberration） (3)2.3.2 球差(Spherical aberration) (3)2.3.3 慧差(Coma) (3)2.3.4 像散（Astigmatism） (3)2.3.5 场曲（Curvature of field） (4)2.3.6 畸变（Distortion） (4)2.4 显微镜的成像（几何成像）原理 (4)2.5 显微镜光学系统简介 (5)3 第三章显微镜的重要光学技术参数 (5)3.1 数值孔径 (6)3.2 分辨率 (6)3.3 放大率 (7)3.4 焦深 (7)3.5 视场直径（Field of view） (7)3.6 覆盖差 (8)3.7 工作距离 (8)4 第四章显微镜的光学附件 (8)4.1 物镜 (9)4.2 目镜 (11)4.3 聚光镜 (11)4.4 显微镜的照明装置 (12)4.5 显微镜的光轴调节 (13)5 第五章各种显微镜检术介绍 (14)5.1 金相显微镜 (14)5.2 偏光显微镜（Polarizing microscope ） (17)5.3 体视显微镜（Stereo microscope） (19)1第一章：显微镜简史随着科学技术的进步，人们越来越需要观察微观世界，显微镜正是这样的设备，它突破了人类的视觉极限，使之延伸到肉眼无法看清的细微结构。
显微镜是从十五世纪开始发展起来。
从简单的放大镜的基础上设计出来的单透镜显微镜，到1847年德国蔡司研制的结构复杂的复式显微镜，以及相差，荧光，偏光，显微观察方式的出现，使之更广范地应用于金属材料，生物学，化工等领域。
2第二章显微镜的基本光学原理2.1折射和折射率光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现像，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。
生物细胞的三维显微成像和分析方法
生物细胞的三维显微成像和分析方法随着科技的不断发展，生物学领域的研究也得到了前所未有的发展。
其中，生物细胞的研究成为热门话题之一。
生物细胞是指生命体中最基本的结构单位。
它具有很强的复杂性和多样性，研究其结构和功能十分重要。
生物细胞的研究成果对于医学、环保、食品和工业等领域具有广泛的应用价值。
而现代生物学中，生物细胞的三维显微成像和分析方法是不可或缺的。
本文将从显微镜技术和成像方法两个方面探讨生物细胞的三维显微成像和分析方法。
显微镜技术当前常用的生物细胞三维成像和分析方法主要依赖于某些显微镜技术，包括光学显微镜、共聚焦激光扫描显微镜、三维结构光显微镜、电子显微镜、原子力显微镜、多光子显微镜等技术。
光学显微镜是一种使用可见光成像技术的显微镜，是生物学研究中最常用的显微镜。
它可以通过透射光成像或者反射光成像来观察细胞组织的结构和分布。
这种显微镜的成像分辨率不高，但是便于操作，因此广泛应用于生物学研究。
与光学显微镜不同，共聚焦激光扫描显微镜（confocal microscopy）利用数码成像和激光共聚焦技术来观察生物细胞。
它激光扫描的同时，通过逐渐减小探底孔径、选择光的反射或荧光来收集图像数据，进而还原出三维图像。
共聚焦激光扫描显微镜具有高侦测灵敏度、高分辨率和成像精度高等特点，成为研究细胞形态和三维结构的主要工具之一。
另外，三维结构光显微镜（structured illumination microscopy）是一种新型的三维成像技术。
它通过腔调控光场的特殊模式，针对样品器表面对光场传播过程中产生的像差进行校正和补偿，关键近场成像技术将器表特征量化并可视化成立体图像。
这种三维成像技术具有成像效率高、成像分辨率高等优势。
成像方法高分辨率的成像方法是三维显微成像的重要支撑技术，其中景深成像技术和荧光成像技术具有广泛的应用价值。
景深成像技术是一种普遍存在于光学成像系统中的技术。
它采用调节各点焦距/光程的方法来为图像增加景深，能够有效解决高倍率下聚焦范围狭窄的问题。
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利用中间镜的可变倍率来控制电镜的放大倍数。
TEM分裂极靴设计透镜示意图
投影镜 的作用是把经中间镜放大（或缩小）的像（电子衍射花样）进一步放大，并 投影到荧光屏上，它和物镜一样，是一个短焦距的强磁透镜。投影镜的激磁电流是
固定的。因为成像电子束进入投影镜时孔镜角很小（约10-3rad），因此它的景深和
包括荧光屏
和照相机构。在荧光屏下面放置 一下可以自动换片的照相暗盒， 照相时只要把荧光屏竖起，电子 束即可使照相底片曝光。由于透 射电子显微镜的焦长很大，虽然 荧光屏和底片之间有数十厘米的
间距，仍能得到清晰的图像。
TEM的电子源在顶端，透镜系统（4、7、8） 将电子束聚焦于样品上，随后将其投影在 显示屏（10）上。控制电子束的设备位于 右方（13和14）。
第三讲、电子显微镜镜
电子显微镜
电子显微镜，简称电镜，是根据电子光学原理，用电子束和电子透镜代替光束 和光学透镜，使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器。 在光学显微镜下无法看清小于0.2μm的细微结构，这些结构称为亚显微结构或超 微结构。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分 辨率。1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜，电子束的波长 要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成 反比，也就是说电压越高波长越短。目前透射电镜的分辨力可达0.2nm。
4.真空系统 真空系统的作用有两方面，一方面可以在阴极和地之间加以很高的电 压，而不会将空气击穿产生电弧，另一方面可以将电子和空气原子的撞击频率减小 到可以忽略的量级，这个效应通常使用平均自由程来描述。标准的TEM需要将电子 的通路抽成气压很低的真空，通常需要达到10−4 帕。由于TEM的元件如样品夹具和 胶卷盒需要经常插入电子束通路，或者需要更换，因此系统需要能够重新抽成真空。 因此，TEM不能采用永久密封的方法来保持真空，而是需要装备多个抽气系统以及 气闸。
像距都非常大。即使改变中间镜的放大倍数，使显微镜的总放大倍数有很大的变化， 也不会影响图像的清晰度。有时，中间镜的像平面还会出现一定的位移，由于这个 位移距离仍处于投影镜的景深范围之内，因此，在荧光屏上的图像仍旧是清晰的。 电子图像的放大倍数为物镜、中间镜和投影镜的放大倍数之乘积。
3. 观察和记录装置
电镜的分辨本领
在光学中，分辨率（分辨极限）即指光学仪器可以分辨的两个物点之间的最小距离。 由于瑞利斑（爱里斑）的关系，显微镜物镜的分辨极限为： δ＝0.61λ/n sinθ
式中λ为入射光波长，n是物方介质的折射率，2θ为物镜对物体的张角（孔径角），n
sinθ为物镜的数值孔径，以N.A.表示。 通过增大数值孔径或缩短光源波长都可以提高物镜的分辨率。 从增大数值孔径N.A.来提高分辨率是很有限和困难的，最有效的方法是缩短光源的波 长，电镜所采用的电子波长λ为： λ＝12.25Å/√ V 可见，只要提高加速电压V就可以得到短波长的电子波，分辨率也就相应得到提高。
JEM-2010F透射电镜
工作原理
透射电镜的总体工作原理是：由电子枪发射出 来的电子束，在真空通道中沿着镜体光轴穿越 聚光镜，通过聚光镜将之会聚成一束尖细、明 亮而又均匀的光斑，照射在样品室内的样品上； 透过样品后的电子束携带有样品内部的结构信 息，样品内致密处透过的电子量少，稀疏处透 过的电子量多；经过物镜的会聚调焦和初级放 大后，电子束进入下级的中间透镜和第1、第2 投影镜进行综合放大成像，最终被放大了的电
数纳米到数微米不等。原子量越高、电压越低，样本就必须越薄。样品较薄镜光栏，参与成像，在 图像中显得较亮。反之，样品中较厚或较密的部分，在图像中则显得较暗。如果样 品太厚或过密，则像的对比度就会恶化，甚至会因吸收电子束的能量而被损伤或破 坏。
第一部实际工作的TEM， 现在在德国慕尼黑的遗址 博物馆展出。
物 镜
物 体
θ
一、透射电镜
透射式电子显微镜（TEM，Transmission Electron Microscopy，亦称投射式电 子显微镜）因电子束穿透样品后，再用电子透镜成像放大而得名。它的光路与光学 显微镜相仿，可以直接获得一个样本的投影。通过改变物镜的透镜系统人们可以直 接放大物镜的焦点的像。由此人们可以获得电子衍射像。使用这个像可以分析样本 的晶体结构。在这种电子显微镜中，图像细节的对比度是由样品的原子对电子束的 散射形成的。由于电子需要穿过样本，因此样本必须非常薄。组成样本的原子的原 子量、加速电子的电压和所希望获得的分辨率决定样本的厚度。样本的厚度可以从
电镜的分类
电子显微镜按结构和用途可分为透射式电子显微镜、扫描式电子显微镜、反射 式电子显微镜和发射式电子显微镜等。透射式电子显微镜常用于观察那些用普 通显微镜所不能分辨的细微物质结构；扫描式电子显微镜主要用于观察固体表面 的形貌，也能与X射线衍射仪或电子能谱仪相结合，构成电子微探针，用于物质 成分分析；发射式电子显微镜用于自发射电子表面的研究。
子影像投射在观察室内的荧光屏板上；荧光屏
将电子影像转化为可见光影像以供使用者观察。
基本的TEM光学元件布局图
TEM的结构
TEM由几大部分组成：照明系统；成像系统；记录系统；真空系统；电气系统。 1. 照明系统 电子枪 主要由电子枪和聚光镜组成。
是发射电子的照明源。
聚光镜
是把电子枪发射出来的电子束进一步会聚后照射到样品上。
照明系统的作用就是提供一束亮度高、照明孔径角小、平行度好、束流稳定的照明 源。
电子枪的构成
2. 成像系统 即电子光学系统，又称镜筒，是透射电镜的主体。成像系统主要由物 镜、中间镜和投影镜组成。
物镜 是用来形成第一幅高分辨率电子显微图像或电子衍射花样的透镜。透射电子
显微镜 分辨本领的高低主要取决于物镜。因为物镜的任何缺陷都被成像系统中其 它透镜进一步放大。欲获得物镜的高分辨率，必须尽可能降低像差。通常采用强激 磁，短焦距的物镜。物镜是一个强激磁短焦距的透镜，它的放大倍数较高，一般为 100-300倍。目前，高质量的物镜其分辨率可达0.1nm左右。 中间镜 是一个弱激磁的长焦距变倍透镜，可在0-20倍范围调节。当M>1时，用来 进一步放大物镜的像；当M<1时，用来缩小物镜的像。在电镜操作过程中，主要是