实验三 蛋白酶的固态发酵及提取实验

实验 蛋白酶的固态发酵及提取实验

一、 实验目的和要求

1掌握蛋白酶固态发酵基本原理和工艺过程

2 熟悉和掌握蛋白酶提取的基本原理和工艺过程

3 了解影响固态发酵的发酵的各种因素及曲霉产酶特性

4 掌握蛋白酶的分析方法

二、 实验原理

固态发酵法作为一个古老的生物工艺早在几千年前已在食品和调味品上得到了应用。与液体发酵相比，固态发酵操作简易、工艺简单、能耗低、无废水废渣产生，不造成对环境的二次污染。因此，固态发酵法目前在生产有机酸、发酵食品、酶制剂及动植物弃物、垃圾的处理和利用等方面有着广泛的应用。本实验利用曲霉属菌种，通过固体发酵法生产蛋白酶并提取并制得粗酶制品。

三、 实验流程

四、 实验材料及仪器设备

菌种：米曲霉3042

种曲培养基：麸皮 6g ，豆粕 4g 水 10mL

固态发酵培养基：麸皮 10g, 豆粕 10g ， 水 20mL, 121℃灭菌30min 后冷却待用。 仪器与设备：恒温培养箱、灭菌锅、接种铲、超净工作台、紫外可见分光光度计(配石英比色杯)、离心机(10mL 、10000rpm)，水浴锅、移液枪、250mL 和500mL 三角瓶等。 试剂：磷酸盐缓冲溶液(pH=7.5)，5%三氯乙酸溶液、生理盐水、1.5%酪蛋白溶液

五、 实验过程

1 种曲制备：取250mL 三角瓶装入20g 固体培养基，121℃灭菌30min 后冷却待用。用接种环接种斜面种子，32℃静置培养48小时，可观察到培养基表面长满菌丝，制得种曲。中间每隔一定时间观察培养物的变化情况，并记录。

2 发酵：取500mL 三角瓶装入湿料（麸皮 10g, 豆粕 10g ， 水 20mL ），121℃灭菌30min 后冷却待用。用接种铲取适量种曲接种，振荡摇匀，30℃静置培养。培养20小时后，菌丝应布满培养基，第一次摇瓶，使培养基松散；每隔12小时检查一次，观察培养物的变化情况，记录，摇瓶。培养时间达到72小时后结束发酵。

3 蛋白酶提取与分析：发酵结束后，将发酵培养物1g 与15mL 生理盐水混合，研磨，米曲霉菌种纯化

制成斜面 种曲制备 接种发酵 麸曲(粗酶) 麸曲(粗酶) 生理盐水浸提 过滤 活力测定 稀酶液

之后将混合液离心(8000rpm、5min)取上清液，得粗酶液，采用酪蛋白底物法测定蛋白酶活力。

六、蛋白酶活力测定

蛋白酶的活力测定采用酪蛋白水解法。蛋白酶水解酪蛋白产生氨基酸，其中酪氨酸和色氨酸在275nm处具有最大光吸收，吸光度的增加值与蛋白质的活力成正比。一个酶活力单位定义为37℃、1min内水解酪蛋白产生275nm吸光度相当于1ug酪氨酸所需的酶量。

分别取两只试管加入2mL 1.5%的酪蛋白溶液和0.8mL缓冲液，一支作为被测样品，另一支作为对照。向对照管中加入2mL 5%三氯乙酸，使蛋白质变性出现白色絮状沉淀，再加入0.4mL 适当稀释后的酶液，摇匀。向样品管中直接加入0.4mL酶液，摇匀。二者同时放入37℃水浴中反应15min.向样品管中加入2mL 5%三氯乙酸终止反应。离心分离(9000rpm、10min)，分别取上清液，测定二者的吸光度，计算酶活力。公式如下：

X-蛋白酶活力（u/mL）

V-反应液总体积（mL）

C –酪氨酸浓度(mg/mL)

N-稀释倍数

t-水解时间

V1-酶液的体积(mL)

181.9—酪氨酸分子量

七、实验报告内容和数据处理

1 观察发酵过程中的现象并记录，分析。

2 计算酶液的蛋白酶活力，并分析实验结果。

八、思考题

1 固态发酵培养基的含水量的高低变化对发酵和产酶过程有什么影响？

2 为什么在发酵过程中需要每隔一定时间，摇动三角瓶？该过程工业上称为“翻曲”