医学免疫学：溶血空斑试验(PFC测定)
临床免疫学检验 名词解释整理
抗原抗体反应：是指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。
抗原抗体间的结合力涉及静电引力、范德华力、氢键和疏水作用力，其中疏水作用力最强，它是在水溶液中两个疏水基团相互接触，由于对水分子的排斥而趋向聚集的力。
亲和性（affinity）：是指抗体分子上一个抗原结合点与一个相应抗原表位（AD）之间的结合强度，取决于两者空间结构的互补程度。
亲合力（avidity）：是指一个完整抗体分子的抗原结合部位与若干相应抗原表位之间的结合强度，它与亲和性、抗体的结合价、抗原的有效AD数目有关。
抗原抗体反应的特点：特异性、可逆性、比例性、阶段性。
带现象（zone phenomenon）：一种抗原-抗体反应的现象。
在凝集反应或沉淀反应中，由于抗体过剩或抗原过剩，抗原与抗体结合但不能形成大的复合物，从而不出现肉眼可见的反应现象。
抗体过量称为前带，抗原过量称为后带。
免疫原（immunogen）：是指能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。
免疫佐剂（immuno adjustvant）：简称佐剂，是指某些预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的物质。
半抗原（hapten）：又称不完全抗原，是指仅具有与抗体结合的能力(抗原性)，而单独不能诱导抗体产生（无免疫原性）的物质。
当半抗原与蛋白质载体结合后即可成为完全抗原。
载体（carrier）：结合后能给予半抗原以免疫原性的物质。
载体效应：初次免疫与再次免疫时，只有使半抗原结合在同一载体上，才能使机体产生对半抗原的免疫应答，该现象称为~。
单克隆抗体（McAB）：将单个B细胞分离出来，加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生的针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，即~。
多克隆抗体（PcAb）：天然抗原分子中常含多种不同抗原特异性的抗原表位，以该抗原物质刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产生含有针对不同抗原表位的免疫球蛋白，即~基因工程抗体（GEAb）：是利用DNA重组及蛋白工程技术，从基因水平对编码抗体的基因进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体。
抗体空斑实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握抗体空斑实验的原理和方法。
2. 了解抗体形成细胞（B淋巴细胞）的功能和特性。
3. 通过抗体空斑实验检测和分析抗体生成细胞的功能。
二、实验原理抗体空斑实验（Plaque Formation Cell Assay, PFC）是一种体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的方法。
其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，然后提取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液。
将细胞悬液与一定量的SRBC混合，在补体的参与下，抗体形成细胞会释放出溶血素，导致周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的溶血空斑。
每个空斑代表一个抗体形成细胞，空斑的数量和大小可以反映抗体生成细胞的功能和特性。
三、实验材料与试剂1. 材料：- 家兔或小鼠- 绵羊红细胞（SRBC）- 家兔淋巴结或小鼠脾细胞- 平皿、离心机、显微镜、温箱、水浴箱等2. 试剂：- Hanks液（含Ca2+、Mg2+）- PBS（含Ca2+、Mg2+）- 底层琼脂（1.4%）- 表层琼脂（0.7%）- 补体（新鲜豚鼠血清）- 小牛血清（56℃灭活30min）四、实验步骤1. 免疫动物：将绵羊红细胞免疫家兔或小鼠，使其产生抗体。
2. 制备细胞悬液：取出家兔淋巴结或小鼠脾细胞，制成细胞悬液。
3. 准备琼脂平板：将底层琼脂加入Hanks液，融化后倒入平皿中，待凝固。
4. 混合细胞悬液：将细胞悬液与SRBC混合，加入适量的补体。
5. 倒平板：将混合液倒入平皿中的底层琼脂上，待凝固。
6. 覆盖表层琼脂：将表层琼脂加入Hanks液，融化后倒入平皿中，待凝固。
7. 温育：将平皿放入温箱中，37℃温育24-48小时。
8. 观察：用显微镜观察溶血空斑的形成情况。
五、实验结果与分析1. 实验结果：- 观察到平皿中形成了多个溶血空斑，每个空斑大小不一。
- 空斑数量较多，说明抗体生成细胞的功能较强。
2. 结果分析：- 溶血空斑的形成表明实验动物产生了抗体。
- 空斑数量和大小反映了抗体生成细胞的功能和特性。
溶血空斑实验报告
一、实验目的1. 掌握溶血空斑实验的基本原理和方法。
2. 了解溶血空斑实验在免疫学中的应用。
3. 检测实验动物抗体形成细胞的功能。
二、实验原理溶血空斑实验（Plaque Forming Cell assay, PFC）是一种体外检测单个抗体形成细胞（B淋巴细胞）的方法。
其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫家兔或小鼠，取家兔淋巴结或小鼠脾细胞制成细胞悬液，与高浓度绵羊红细胞混合后加入琼脂糖凝胶中。
其中每个释放溶血性抗体的B淋巴细胞在补体的参与下可溶解周围的绵羊红细胞，在周围形成一个可见的空斑。
一个空斑代表一个抗体形成细胞（即B细胞），空斑的数量反映机体的体液免疫功能。
空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。
三、实验材料与试剂1. 器材：平皿、37℃水浴箱、离心机、显微镜、移液器、吸管等。
2. 试剂：（1）SRBC悬液：取无菌脱纤维羊血，用NS或PBS离心洗涤3次，每次以2000rpm，5min，用PH7.2的PBS（含Ca2+、Mg2+）悬成细胞浓度为2.0×10^9个/mL。
（2）Hanks液（含Ca2+、Mg2+）：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%和0.7%两种浓度。
（3）底层基：将琼脂糖用Hanks液配成1.4%浓度。
（4）表层基：将琼脂糖用Hanks液配成0.7%浓度。
（5）补体：新鲜豚鼠血清或小牛血清，56℃灭活30min。
四、实验方法1. 免疫脾细胞悬液的制备（1）小鼠免疫：取10只小鼠，每只小鼠腹腔注射1ml SRBC悬液，免疫3次，每次间隔2周。
（2）脾细胞悬液的制备：无菌取小鼠脾脏，剪碎，用生理盐水洗涤，加入适量生理盐水制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1.0×10^6个/mL。
2. 溶血空斑实验（1）将底层基加入平皿中，置于37℃水浴箱中溶化。
（2）取适量脾细胞悬液加入底层基中，轻轻混匀。
（3）加入适量表层基，轻轻混匀。
（4）加入适量补体，轻轻混匀。
（5）将平皿置于37℃水浴箱中孵育4h。
PFC法玻片小室测IgM
原理： 溶血空斑试验是体外检测单个抗体形成细胞（B 淋巴细胞）的一种方法，即将经绵羊红 细胞（SRBC）免疫过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的 SRBC 结合，于 37℃作用下，免疫活性淋巴细胞能释放出溶血素，在补体的参与下，使抗体形成细胞周围的 SRBC 溶解，从而在每一个抗体形成细胞周围，形成肉眼可见的溶血空斑。每个空斑表示一 个抗体形成细胞， 空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。 由于溶血空斑试验具有特异 性高，筛选力强，可直接观察等优点，故可用做判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力 学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。 悬液的制备将 16 只 BALB/c 小鼠随机分为两组， 实验组 8 只小鼠， 灌胃给药 5000mg/kg， 每日一次。 对照组小鼠 8 只， 依同法喂等量自来水。 连续 8 天实验， 前 4 天， 以 5%新鲜 SRBC 生理盐水悬液 0.4ml 免疫 16 只小鼠， 第 8 天将小鼠处死取脾制成悬液备用。 将 15%的 SRBC 悬液 50µl、1：5 稀释的补体 50µl、1× 106 个/毫升小鼠脾细胞悬液 20µl 和 Hank’s 液 180µl 混匀后，灌注于小室内。37℃ 1.5 h 后取出对着光亮处计数溶血空斑数，并计算出每 106 个 脾细胞中的空斑数。 1 绵羊红细胞（SRBC）的制备
参考文献： [1] SIMPSON M A,GOZZO J J.Spectrophotometric determination of lymphocyte
mediated sheep red blood cell hemolysis in vitro[J].Journal Of Immunological Methods,1978,21(1):159-165.
医学免疫学实验：溶血空斑形成实验
溶血空斑形成实验一、实验目的学习溶血空斑形成实验的实验原理与步骤，掌握用溶血空斑形成实验检查动物的抗体产生功能。
二、实验原理溶血空斑试验，又称空斑形成细胞（Plague Forming Cel , PFC ）试验，是一种体外检测抗体形成细胞的方法。
将一定量洗涤过的绵羊红细胞注射入小鼠腹腔，四天后将小鼠杀死，取脾脏制成脾细胞悬液，内含抗体形成细胞。
然后将脾细胞、绵羊红细胞，补体混合孵育。
由于脾细胞所分泌的抗体和绵羊红细胞表面抗原结合形成抗原抗体复合物，在补体作用下可使红细胞溶解，于特制的小室内形成肉眼可见的溶血空斑。
一个空斑即代表一个抗体形成细胞。
三、实验材料1.解剖器械、试管、1ml 吸量管2.载玻片、石蜡盘、酒精灯、微量加样器3. BALBC 小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）4.5％和10％绵羊红血球（SRBC )5.补体（豚鼠血清，经SRBC 吸收，临用时稀释成合适浓度）四、实验步骤1.腹腔注射0.5mlSRBC,4天后拉颈椎处死，取出脾放在已加入6ml Hank液的平皿中，用100目不锈钢网研磨过滤混匀。
2.吸取1ml加入试管中，加满Hank液混匀，离心1000rpm，10min。
3.吸取1ml Hank液加入试管中，重悬脾细胞沉淀，细胞密度约1 ×107/ml。
4.取1 ×107/ml 脾细胞100μl；10%SRBC 200 μl；补体200 μl；Hank液1ml。
5.混匀后，用尖吸管灌小室、封蜡、标记、平放于玻片盘，37 ℃孵育30min。
五、实验结果肉眼观察空斑，计数小室出现的溶血空斑数，对于模糊不清的空斑，可以在低倍镜下观察。
注意区分气泡和溶血空斑，真正的溶血空斑中心必有一个淋巴细胞。
加试管1混合液的小室有多个透明的溶血空斑形成，加试管2混合液的小室（对照）没有。
一个空斑即代表一个空斑形成细胞（抗体形成细胞）。
六、讨论1.在小室注入液体时不要留有气泡。
溶血空斑试验PFC试验PPT课件
4、制备灌注液：
实验组：脾细胞悬液100μl＋15％SRBC 100 μl＋补体 100 μl＋Hank’s液500 μl
对照组：脾细胞悬液100μl＋15％SRBC 100 μl＋Hank’s 液600 μl
5、灌注小室: 2管分别灌注2个小室，石蜡密封小室的两侧 6、 孵育： 37℃培养箱中40min
（三）材料与器材
1、小鼠，5％和15％SRBC，补体，Hank’s液 2、解剖器械，试管，载玻片，石蜡，100目不锈钢
网，双面胶带 3、37℃培养箱
（四）实验方法
1、免疫小鼠：4天前5％SRBC腹腔注射免疫小鼠
2、制备脾细胞悬液：颈椎脱臼处死小鼠，取脾在不锈钢 网上研磨（7 ml Hank’s液），1000 rpm离心6 min，去上 清，加1 ml Hank’s液悬浮脾细胞
溶血空斑试验
PFC实验
（一）实验目的
掌握PFC实验原理、实验操作和结果观察；
（二）实验原理
溶 血 空 斑 试 验 或 空 斑 形 成 细 胞 试 验 （ Plague forming cell, PFC)，体外检测抗体形成细胞。 1、SRBC＋B细胞＝记忆性B细胞（抗体形成细胞） 2、SRBC＋抗体形成细胞＝（抗原＋抗体复合物） 注意事项
（1）小室注入液体时不要留有气泡； （2）小室边缘需用石蜡封严； （3）37℃孵箱孵育时，必须放平，不可倾斜；
（六）实验结果
观察溶血空斑现象 区分： 溶血空斑：比周围颜色浅，折光性差，边缘不整齐。 气泡：比周围亮，折光性好，边缘整齐。
讨论
• 分析溶血空斑形成的原因
经典溶血空斑实验的原理
经典溶血空斑实验的原理在经典的溶血空斑实验中，首先需要准备红细胞悬液和抗血清。
红细胞悬液可以通过离心血液样本获得，而抗血清可以是已知含有特定抗体的人类或动物血清。
抗血清里的抗体能与红细胞上的抗原决定基结合并引起免疫反应。
实验开始前，需要配制一定浓度的抗血清稀释液。
为了确定正常血清对红细胞的影响，还需要准备一组对照试管，其中只加入红细胞悬液，不加入抗血清。
此外，还要准备一组阴性对照试管，其中既不加入抗血清，也不加入红细胞悬液。
接下来的步骤是将相应的抗血清和红细胞悬液混合。
通常，将一定量的抗血清与一定体积的红细胞悬液混合于平板或试管中。
然后，将混合物在适当条件下培养一段时间（通常为1-2小时），使抗体和红细胞发生反应。
在一定的反应时间后，观察混合物的现象。
如果抗体与红细胞上的抗原决定基结合，那么红细胞可能会发生凝聚或溶解。
凝聚通常表现为红细胞的团块状聚集，而溶解则表现为呈现空心的透明空斑。
观察结果后，可以通过显微镜直接观察试管内的现象或者使用显微镜将聚集后的红细胞和溶解后的空斑在幻灯片上涂片，然后在镜下观察。
通过对比不同试管内的结果，就可以初步判断存在的抗体种类。
如果一个特定抗体与待测的红细胞悬液混合后形成了空斑，那么可以推测该血液样本中存在该抗体。
相反，如果加入正常血清后试管中没有出现空斑或聚集现象，那么可以认为该血液样本中没有与正常抗体反应的抗体。
需要注意的是，溶血空斑实验只能初步判断抗体的存在，不能确定抗体的种类，因为不同抗体对红细胞的作用机制不同，有的抗体可以引起热凝集现象，有的可以引起冷凝集现象，而有些抗体则可以引起溶解等。
所以，在鉴定抗体种类时，还需要进行进一步的试验，如冷凝集试验、ELISA等。
在实际应用中，溶血空斑实验被广泛用于免疫学研究、血型鉴定、自身免疫性溶血性贫血的诊断等。
通过检测抗体与红细胞之间的反应，溶血空斑实验为临床诊断提供了有力的工具。
同时，该实验的原理也为研究免疫学和血液学提供了实验基础。
溶血空斑实验的原理及应用
溶血空斑实验的原理及应用1. 溶血空斑实验介绍溶血空斑实验是一种常用的实验方法，用于检测溶血素和溶血抗体对红细胞产生的溶血现象。
通过此实验可确定溶血素或溶血抗体对红细胞膜的破坏能力。
2. 溶血空斑实验的原理溶血空斑实验的原理基于溶血素或溶血抗体与红细胞的相互作用。
溶血素或溶血抗体与红细胞结合后，会导致红细胞膜破坏，形成溶血空斑。
3. 溶血空斑实验的步骤溶血空斑实验的步骤如下：•选择适当的红细胞供试验•准备适当稀释的溶血素或溶血抗体溶液•将稀释的溶液与红细胞混合，孵育一段时间•离心样品，观察沉淀•根据结果判断溶血程度4. 溶血空斑实验的应用溶血空斑实验在许多领域有广泛的应用，包括以下几个方面：4.1 血型鉴定溶血空斑实验可用于血型鉴定。
通过将不同血型的红细胞与已知抗血清进行反应，观察是否出现溶血空斑，从而确定血型。
4.2 疾病诊断溶血空斑实验可用于某些疾病的诊断，如溶血性贫血。
溶血性贫血的患者红细胞易受到溶血素的破坏，通过溶血空斑实验可以检测红细胞抵抗溶血的能力。
4.3 药物毒性测试溶血空斑实验还可用于药物毒性测试。
某些药物可能对红细胞膜产生损伤，通过溶血空斑实验可以评估药物的毒性。
4.4 免疫学研究溶血空斑实验在免疫学研究中也有重要应用。
通过溶血空斑实验可以检测抗体与红细胞间的相互作用，从而研究免疫反应机制。
5. 结论溶血空斑实验是一种常用的实验方法，可用于血型鉴定、疾病诊断、药物毒性测试以及免疫学研究等领域。
通过观察溶血空斑的形成情况，可以了解溶血素或溶血抗体对红细胞的影响，为相关领域的研究和诊断提供一定的依据。
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(Plaque forming cell assay)
小鼠B细胞溶血空斑形成试验
➢ 溶血空斑试验是基于抗原抗体反应可活化补体， 溶解细胞的原理来检测抗体形成细胞的一种体外 试验方法，用于检测动物的抗体产生功能的经典 的试验。
➢ 将SRBC免疫过的小鼠脾细胞制成细胞悬液，与一 定量的SRBC混合，在补体参与下，使抗体产生细 胞周围的SRBC溶解，形成一个肉眼可见的溶血空 斑。主要用于测定B细胞抗体产生能力。
机， • 载玻片、双面胶、微量加样器、Tip头、棉签、石
蜡、石蜡锅、温箱等。
1.脾细胞悬液的制备
5％ SRBC 0.4ml腹腔内注射免疫小鼠
实
验
4d后
流
颈椎脱臼处死小鼠，取脾脏，放入已加8ml Hank’s液的平皿中，研磨，200目筛网过滤
程
离心：1000r/min×10min
去上清，加2ml Hank’s液制成脾PFC试验的基本原理及实验方 法；
2. 了解PFC试验的临床意义。
实验原理
➢ 抗原刺激B细胞活化分泌特异性抗体 ➢ 抗原抗体复合物经典途径激活补体系统
实验材料
• 小鼠18～22g， • 5％、15％SRBC，补体，Hank’s液， • 解剖器械（剪刀、镊子）， • 空平皿、筛网、组织研磨器、吸管、试管、离心
2.制作小室
取洁净载玻片两张
实
验
用双面胶在中间和两端各粘一条，将
流
两张玻片黏在一起即成2个小室
程
3.配制小室灌注液
准备2支试管，按照下表加样：
实 验 脾细胞悬液 流 15%SRBC 程 补体
实验管（μl） 对照管 （μl）
100
100
100
100
100
-
Hank’s液
500
600
混匀，分别灌注小室（注满），石蜡封口，
37度，40min.
实验组
对照组
结果：
实验组出现无数个透明的溶血空斑，而对照组无。 溶血空斑边缘不规则，而气泡透亮、边缘规则。
实验组
对照组
气泡 空斑
B细胞 浆细胞
• 【注意事项】 1.灌注时防止气泡的出现。