利用基于表面等离子体共振的生物光学传感器检测牛奶中氨苄青霉素残留的方法

利用基于表面等离子体共振的生物光学传感器检测牛奶中氨苄青霉素残留的方法张增福，徐可欣＊，刘　瑾，黄福祥，于海霞（天津大学　精密测试技术及仪器国家重点实验室，天津 ３０００７２）摘 要：采用表面等离子体共振的生物光学传感器的方法，利用生物分子相互作用分析原理及传感器对折射率的高度敏感性，结合传感器金膜表面绑定抗氨苄青霉素单克隆抗体的技术，实现了牛奶中氨苄青霉素含量的定量检测。

实验中利用微型表面等离子体共振传感器构建了测量系统，介绍了传感器表面的处理方法，并对氨苄青霉素浓度为０、１０、５０、１００ｎｇ／ｍｌ的牛奶样品进行了测量，通过对测量结果进行分析，得到了不同氨苄青霉素浓度的传感器响应图，对牛奶中氨苄青霉素含量的最低检测限达到了５０ｎｇ／ｍｌ。

结果表明，基于表面等离子体共振的光学生物传感器在牛奶抗生素药物残留检测方面具有很好的应用前景。

关键词：生物传感器；表面等离子体共振；牛奶；抗体；氨苄青霉素Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　Ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｉｎ　Ｍｉｌｋ　ｂｙ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｌａｓｍｏｎ　Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ－ｂａｓｅｄ　Ｏｐｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ　Ａｓｓａｙ　ＭｅｔｈｏｄＺＨＡＮＧ　Ｚｅｎｇ－ｆｕ，ＸＵ　Ｋｅ－ｘｉｎ＊，ＬＩＵ　Ｊｉｎ，ＨＵＡＮＧ　Ｆｕ－ｘｉａｎｇ，ＹＵ　Ｈａｉ－ｘｉａ（Ｓｔａｔｅ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，　Ｔｉａｎｊｉｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｔｉａｎｊｉｎ ３００７２，　Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ　：Ｔｈｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　（ＳＰＲ）－ｂａｓｅｄ　ｏｐｔｉｃａｌ　ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｍｐｉｃｉｌｌｌｉｎ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｉｎ　ｍｉｌｋｉｓ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．　Ｔｈｅ　ａｓｓａｙ　ｉｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｂｉｏ－ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　（ＢＩＡ）　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｈｉｇｈ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ　ｉｎｄｅｘｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｏｒ．　Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ａｎｔｉ－ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｏｒ　ｓｕｒｆａｃｅ，　ｔｈｅ　ａｓｓａｙ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ．　Ｔｈｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗａｓ　ｅｑｕｉｐｐｅｄ　ｗｉｈ　ｍｉｎｉａｔｕｒｅｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＳＰＲ　ｓｅｎｓｏｒ．　Ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｏｒ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｗａｓ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ，　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｔｏ　ｃｏｖｅｒｔｈｅ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｒａｎｇｅ　ｆｒｏｍ　０　ｎｇ／ｍｌ　ｔｏ　１００　ｎｇ／ｍｌ．　Ｗｉｔｈ　ａｎａｌｙｚｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔｓ，　ｔｈｅ　ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍｓ　ｏｆ　ｍｉｌｋｓａｍｐｌｅｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．　Ｔｈｅ　ｌｉｍｉｔ　ｏｆ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ　ｃａｎ　ｒｅａｃｈ　５０　ｎｇ／ｍｌ．　Ｉｔ　ｉｓｓｕｒｅ　ｔｈａｔ　ｔｈｉｓ　ａｓｓａｙ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＳＰＲ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｃａｎ　ｂｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｉｎ　ｍｉｌｋ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ；ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ｍｉｌｋ；ａｎｔｉｂｏｄｙ；ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ中图分类号：ＴＳ２０７．５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００８）０６－０３５３－０４收稿日期：２００７－０７－０５基金项目：国家高技术研究发展计划项目（２００６ＡＡ０６Ｚ４０１）作者简介：张增福（１９７９－），男，博士，研究方向为牛奶中抗生素残留检测。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｂｉｏｔｓｉｎｇ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ＊通讯作者：徐可欣（１９５６－），男，教授，博士，研究方向为生物医学光子学及其红外光谱学。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｋｅｘｉｎ＠ｔｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ抗生素常用来治疗乳牛的感染，乳牛在用药后３～５ｄ内所产的奶中就会含有抗生素。

若抗生素残留在牛奶中，长期饮用就会导致人体对抗生素的免疫，也可引起对抗生素过敏的人产生过敏反应，同时，还会间接地培养抗药细菌，增加疾病的治疗难度。

氨苄青霉素是常用β－内酰胺类抗生素的一种，对其快速、精确的检测具有重要的意义和作用。

目前日常应用的抗生素检测方法主要有生物检测法和酶联免疫法［１－２］，然而这两种方法要么耗时长、精度低，要么要消耗价格昂贵的一次性试剂盒。

基于表面等离子体共振技术有希望弥补现有方法的缺陷，因此近些年来，国外利用表面等离子体共振传感器检测牛奶中抗生素研究的兴趣越来越高。

Ｇａｕｄｉｎ　Ｖ等采用了化学处理方法和酶处理的方法对牛奶样品处理后进行检测［３］，瑞典Ｇｕｓｔａｖｓｓｏｎ　Ｅ等人基于羧肽酶活性的β－内酰胺受体蛋白对青霉素Ｇ等内酰胺类抗生素进行测量［４－７］，均得到了较好的测量效果，然而这两种方法均对样品进行复杂的预处理，不利于实际应用。

本研究旨在探索一种基于表面等离子体共振（ｓｕｒｆａｃｅｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｎｓｏｎａｎｃｅ，ＳＰＲ）的牛奶中氨苄青霉素残留的检测方法。

１材料与方法１．１仪器装置与试剂１．１．１仪器装置系统组成如图１所示，微量注射泵（Ｋｄ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　公司），能够自动控制注射器来恒速注射液体，Ｓｐｒｅｅｔａ表面等离子体共振测量系统（ＴＩ美国德州仪器），用来监测流过传感器金膜表面的液体折射率的变化［８］，六通道选择阀（ｕｐｃｈｕｒｃｈ），可以进行不同试剂间的选择切换，根据需要向传感器选择注入不同试剂。

１．１．２试剂牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、丁二酸酐（ｓｕｃｃｉｎｉｃａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、二甲亚砜（ＤＭＳＯ）美国　Ａｍｒｅｓｃｏ公司；１－（３－二甲氨基丙基）－３－乙基碳二亚胺盐酸盐（ＥＤＣ．ＨＣｌ）、Ｎ－羟基琥珀酰亚胺（ＮＨＳ） 上海延长生化有限公司；乙醇胺（ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ） 美国Ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ公司；大鼠单克隆抗氨苄青霉素抗体（ｍｏｕｓｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙａｎｔｉ－ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ，ＭｃＡｂ） 美国　ＵＳＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　公司；氨苄青霉素　（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ，生物分子级） 德国ＳＥＲＶＡ公司；ｐＨ７．４　１０ｍｍｄ／Ｌ磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）；实验中用到所有的试剂均为分析纯；水为去离子水。

１．２ＳＰＲ生物传感器的制备１．２．１传感器金膜表面预处理为了降低抗体非特异性反应，需要在传感器金膜表面修饰一层交叉连接的蛋白层。

如图２所示，首先在金膜表面修饰一层用ＥＤＣ／ＮＨＳ活化的ＢＳＡ，形成均匀的交叉连接的蛋白层，再利用磷酸二氢钠盐和ＤＭＳＯ配制的丁二琥珀酸酐溶液（ｐＨ６．５）浸泡蛋白质层，使蛋白质层羧化，成为金膜和抗体的连接纽带。

１．２．２氨苄青霉素抗体在ＳＰＲ传感器上的固定调节液体流速为１０μｌ／ｍｉｎ，向传感器内通入ＰＢＳ溶液，待基线稳定后通入ＥＤＣ／ＮＨＳ（体积比为１：１）５～１０ｍｉｎ，活化羧化的ＢＳＡ蛋白质层，形成有活性的ＮＨＳ酯蛋白层，通入ＰＢＳ缓冲液冲洗，待基线稳定后再通入ＭｃＡｂ　１０ｍｉｎ，ＭｃＡｂ通过与活化的蛋白层发生反应，通过氨基形成共价键连接，为了封住未反应的活化羧基官能团，通入１ｍｏｌ／Ｌ乙醇胺溶液，封闭没有反应的活化ＮＨＳ酯蛋白层。

１．３样品的测定样品的测定采用了两种方法，其一是利用ＳＰＲ直接测量的方法，即传感器的金膜表面未绑定特异性抗体的测量方法，用来定性分析；其二是间接测量的方法，即金膜表面经过抗体修饰后再进行测量的方法。

ＳＰＲ测量的检出限的确定均以传感器响应大于该测量基线噪音标准差的三倍，实验中分别配制了含不同浓度的抗生素牛奶样品。

其中直接测量配制了氨苄青霉素含量为０、４０、２３００ｍｇ／Ｌ的样品，间接测量时首先配制含氨苄青霉素浓度为２０００ｎｇ／ｍｌ的牛奶样品待用，再分别取一定量的所配样品并将其按比例稀释为１０、５０、１００ｎｇ／ｍｌ的牛奶样品待测。

２结果与分析２．１基于ＳＰＲ传感器的直接测量直接测量就是在ＳＰＲ传感器的金膜表面未绑定特异性抗体，直接对样品进行测量，由于直接测量时金膜表面未修饰特异性抗体蛋白，ＳＰＲ传感器测量结果对应的是样品的非特异性绑定的传感器响应，因此其测量的图１ 表面等离子体共振测量实验装置示意图Fig.1 Schematic diagram of SPR measurement system注射器注射泵控制盒ＳＰＲ传感器废液池选择阀计算机Ａ．ＳＰＲ传感器；Ｂ．金膜表面；Ｃ．ＢＳＡ蛋白层；Ｄ．羧化连接键；Ｅ．氨苄青霉素抗体；Ｆ．氨苄青霉素。

图２ 传感器金膜表面结构示意图Fig.2 Schematic illustration of configuration in AU surface ofsensorＦＡＢＣＤＥ精度很低，满足不了抗生素测量的精度要求，仅能作定性的判断。

如图３所示，抗生素浓度高达４００ｍｇ／Ｌ时传感器的响应却仅为６４ＲＵ，传感器金膜表面的基线响应的三倍为４５ＲＵ作为可信测量。

如表１所示，直接测量方法仅能够区分到浓度约为４００ｍｇ／Ｌ的样品，响应为６４ＲＵ，达不到抗生素测量的要求。

浓度（ｍｇ／Ｌ）折射率（ＲＩＵ）相对响应（ＲＵ）０１．３２５１０１０４００１．３２５１６５６４２３００１．３２６３０８１２０７表１ 不同浓度样品的直接测量结果Table 1 Direct detrcting results of different concentration samples 注：ＲＵ为响应单元（ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｕｎｉｔｓ，ＲＵ）。

１ＲＵ＝１×１０－６ＲＩＵ。

图４　显示了抗氨苄青霉素抗体在传感器金膜表面固定时折射率响应的变化，通入抗体前后的响应变化为２２２４ＲＵ，说明抗体已固定在金膜表面，１ＲＵ响应相当于１ｐｇ／ｍｍ２的量［９］，以此计算表面抗体的覆盖量为２．２ｎｇ／ｍｍ２。