生物工程研究生实验内容

《生物工程综合实验》实验指导书

张彩莹编写

适用专业：2016级生物工程专业研究生

生命科学与技术学院

2016年10月

前言

随着生物技术的发展，生物工程的专业技术人员的需求更为迫切，特别是生物技术已经渗透到各个行业，并已蓬勃发展。生物技术的发展不但要有深厚的理论基础，而且要求专业技术人员具有较强的动手能力。由于该学科是一门实践性较强的科学，所以在培养生物工程专业学生时要特别注意学生实验能力的培养，尤其是专业基本操作。

本专业学生的实验课程已经包括生物化学实验、微生物实验、基因工程实验、细胞工程实验和发酵工程实验等基础课程实验。这些实验为培养学生的基本操作能力、提高学生的实际动手能力等奠定了良好的基础，但是这些实验都是单个的小实验，各个实验各自为一体，没有系统地相互关联，所以学生完成实验后没有一个完整的概念。

本课程是在原有课程实验的基础上开设的综合性实验，放弃了原来单独小实验的结构，改为独立的大实验，增加了学生的设计性和主动性。这些实验既注重和加强了原来各自的实验内容，又注意到相互联系，使学生有一个完整的操作过程，对理解生物工程技术有了进一步的认识。

根据教学计划的安排，本课程设置了两个综合实验：（1）DNA的分离提取及核酸电泳；（2）从生物组织中分离提取活性物质及鉴定。以期通过这两个综合实验的完成，使同学们充分了解生物技术原理并熟练掌握生物活性物质分离、纯化与鉴定的常用方法。涉及的方法有：溶剂提取法、酶活力测定、物质含量测定(分光光度法)。本课程主要以学生自己动手操作为主，教师指导学生完成实验内容，使同学们在开放的实验环境下，充分发挥主观能动性，摸索试验条件，解决具体问题，培养应用基本理论去分析和解决实际问题的能力。

希望通过这些实验和探索，让同学们获得生物工程专业基本的实验技术训练，为今后独立从事科研和开展相关专业工作打下扎实的基础。

实验须知

生物工程综合大实验教学是生物工程专业课程的重要组成部分，是使学生进一步理论联系实际，掌握生物工程专业学生所具备的基本操作技能，提高学生分析和解决问题能力，养成严密科学态度和良好工作作风必不可少的教学环节。为此，提出下列实验须知：

1．遵守实验室制度，维护实验室安全，不违章操作，严防爆炸、着火、中毒、触电、漏水等事故的发生。若发生事故应立即报告指导教师。

2．实验前作好预习，明确实验内容，了解实验的基本原理和方法，能自行设计实验方案，安排好当天计划，争取准时结束。实验过程中应养成及时记录的习惯。凡是观察到的现象和结果及有关的重量、体积、温度或其他数据，应立即如实记录，实验完毕后，认真总结，写好报告，及时交给老师。

3．在实验室里要保持安静，不许大声喧嚷，不许抽烟、不迟到、不随便离开，实验台面应保持清洁，玻璃器皿及时清洗干净，存放在适当的位置，废弃的固体和滤纸等丢入废物桶内，绝不能丢入水槽、下水道和窗外，以免堵塞和影响环境卫生。

4．公用仪器及药品用完后立即返还原处，破损仪器应填写破损报告单，注明原因。对于精密贵重仪器每次使用后应登记使用者姓名并记录仪器设备的使用情况。节约用水、用电、药用试剂。严格药品用量。

5．保持实验室的整洁，学生采取轮流值日，每次实验完毕，值日生负责整理公用仪器，将实验台、地面打扫干净，倒清废物桶，检查水、电和门窗是否关闭。值日生把当天的情况报告老师后才准予离开实验室。

综合实验一大肠杆菌质粒DNA的小量

提取及核酸电泳

一、实验目的

1.了解质粒在基因工程中的作用。

2.学习碱裂解法小量制备质粒DNA的方法，掌握质粒DNA提取纯化的实验原理。

3.掌握核酸电泳的原理。

4.学习利用琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段。

二、实验原理

质粒是游离于染色体之外的能够独立复制的DNA分子。大部分质粒呈环状结构，目前亦发现少部分线状质粒。天然质粒DNA的长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒主要存在于细菌、酵母和一些植物细胞中，有时一个细胞里面可以同时存在一种乃至于数种的质粒。质粒的拷贝数在细胞里从一个到几千个不等，可分为拷贝数少的严谨性质粒和拷贝数多的松弛型质粒。质粒携带的基因可以赋予细胞新的生理代谢能力，例如使一些细菌中产生抗药性。经过修饰后的质粒是基因工程最常用的载体工具，可承载目的基因进入宿主细胞。

本实验采用碱裂解法分离纯化质粒DNA分子，即利用共价闭合环状质粒DNA与线性细菌染色体DNA片段之间存在拓扑结构差异对其进行分离。破壁释放DNA后，在强碱性（pH 12.0-12.5）下线性DNA的两条链会完全变性分离，而闭合环状DNA由于其双螺旋主链骨架的彼此缠绕，互补的两条链虽然变性但仍结合在一起。当处于低温和中性pH条件下时，共价闭合环状的质粒DNA能迅速而准确地复性，但互补链彼此分离的线性染色体DNA分子的复性作用就不会那么迅速和准确，往往会聚集成网状结构，与变性的蛋白质及RNA一起被沉淀下来。离心分离后的上清液经过乙醇沉淀就可得到高纯度质粒DNA。

带电荷物质在电场中的趋向运动称为电泳。在基因工程研究中，核酸电泳技术已被广泛用于DNA片段的分离纯化和序列分析等诸多方面。核酸电泳通常在琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶中进行，琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的集团，不引起DNA变性，又不吸附被分离的物质，因此它是一种很好的凝胶剂。浓度不同的琼脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子筛网孔大小不一的凝胶，用于分离不同分子量的核酸片段。

DNA分子在碱性环境的电泳缓冲液中带有负电荷，因此在外加电场作用下会向正极迁移。由于不同DNA分子的分子量、所带电荷和分子构型的差异，在

电场中其迁移速率就会出现不同，另外琼脂糖凝胶的浓度、电压大小、缓冲液pH和电泳时的温度等也影响迁移率。从而使DNA分子在凝胶中出现不同的区带。电泳后，凝胶中的DNA分子用核酸染色剂染色后在紫外灯照射下即可观察到条带。此外，从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带用于此后的克隆操作。

三、实验仪器、材料与试剂

（一）实验器材与设备

恒温震荡摇床、台式离心机、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、微波炉、制冰机、冰箱、天平、涡旋混合器、微量移液器（1000μl，200μl，10μl）、吸头（1000μl，200μl，10μl）、1.5ml离心管、三角瓶、烧杯、容量瓶、无菌吸水纸。

（二）实验材料与试剂

1.含质粒的大肠杆菌。

待测DNA样品（质粒DNA）、DNA分子量标记

2.其它试剂：LB液体培养基、Amp溶液或其他抗生素（100mg/ml）、质粒提取试剂盒或（溶液I、溶液II、溶液III）、无水乙醇、70%乙醇，琼脂糖（核酸电泳用），电泳缓冲液（TAE），核酸电泳上样缓冲液（6×），标准分子量的DNA等。

溶液I：50mmol/L葡萄糖、25mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、10mmol/L EDTA (pH8.0)。

配置方法：1mol/L Tris-HCl (pH 8.0) 12.5ml，0.5mol/L EDTA (pH 8.0) 10ml，葡萄糖4.5g，加ddH2O至500ml。高压灭菌15min，4℃保存备用。

溶液II：0.2mol/L NaOH、1% SDS。

配置方法：2mol/L NaOH 1ml，10% SDS 1ml，加ddH2O至10ml，使用前临时配置。

溶液III：乙酸钾（KAc）缓冲液（pH 4.8）。

配置方法：5mol/L KAc 60ml，冰乙酸11.5ml，加ddH2O至100ml。4℃保存备用。

电泳缓冲液（TAE）：40mmol/L Tris-乙酸、1mmol/L EDTA。

配置方法：贮存液（5×）：取24.2g Tris溶于适量ddH2O，加入5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA（pH 8.0），用ddH2O定容至1000ml，4℃保存。使用时稀释。

上样缓冲液（6×）：0.25％(w/v) 溴粉蓝，50％(w/v) 蔗糖水溶液。

配置方法：取0.025g溴酚蓝溶于10ml 40%蔗糖溶液。4℃保存。使用时稀释。

四、实验方法和步骤

（一）质粒的提取（小量试剂盒提取）

1)将5ml含有抗生素的LB液体培养基加入到三角瓶（离心管）中，接入含有

质粒的大肠杆菌，37℃震荡培养过夜。

2)取1.5ml培养液到1.5ml离心管中，12000g离心1min，弃去上清液。将离心

管倒置于吸水纸上1min，使细菌沉淀干燥。

3)加入250μl溶液I（先加入RNaseA），盖紧管盖，涡旋振荡打散菌体沉淀，

使之悬浮于溶液中。

4)加入250μl溶液II，盖紧管盖，快速温和地（以免污染细菌基因组DNA）颠

倒5次（勿震荡），作用时间不要超过5min，以免质粒受到破坏。

5)加入350μl溶液III，盖紧管盖，缓慢颠倒离心管6-8次使之混匀，此时会出

现白色絮状沉淀。

6)12000g离心10min，小心吸取上清液转移到新的1.5ml离心管中，尽量不要

吸出沉淀。溶液III加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。

7)将上一步所得上清液加入吸附柱中，室温放置2min，12000g离心1min，倒

掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

8)向吸附柱中加入700ul漂洗液（使用前请检查是否已加入无水乙醇），12000g

离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

9)向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000g离心1min，倒掉收集管中的废液，将

吸附柱重新放回收集管中。

10)12000g离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是

将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液的乙醇会影响后续的实验。11)将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃

水浴预热的洗脱液，室温放置2min，12000g离心1min。

12)为了增加质粒的回收率，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱中，室温放置

2min，12000g离心1min。

（二）核酸电泳

1)制胶：（以制备1.5% 12cm×6cm小胶为例）称取0.45g琼脂糖置于三角瓶

中，加入30ml电泳缓冲液（1×TAE），摇匀后放入微波炉中加热至琼脂糖完全融化。待凝胶液冷却至60~70℃时，加入10ul GoldViewⅠ核酸染料，摇动混匀后小心倒入装配好的胶槽（提前插入梳子，梳子距底部1mm）中，使胶液缓慢展开，直到整个胶槽表面形成均匀胶层（胶厚3~5mm）。室温下静置直至凝胶完全凝固（白色透明），垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳

槽中，添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止。

2)加样：在离心管中混合DNA样品2-3ul和1ul上样缓冲液。用微量移液器分

别将样品加入胶板的加样孔内。DNA分子量标记加样量参看说明书。每加完一个样品应更换一个加样头，以防污染。加样时勿碰坏加样孔周围的凝胶面（加样前要先记下加样的顺序）。

3)电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳。电压一般5V/cm（100-150V恒压

电泳），样品由负极向正极方向移动。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1-2cm 处时停止电泳。

4)观察：戴手套小心将电泳后的凝胶取出，放置于透射紫外光下254nm观察，

DNA条带会显示出绿色荧光，对照分子量标记判断DNA样品的分子量大小，拍照保存实验结果。

五、注意事项

1)提取质粒时加入溶液III后复性时间不宜过久，以免基因组DNA分子断裂的

小分子DNA片段也被复性留在上清中。

2)为避免细菌染色体DNA过多的断裂成小片段，裂解细胞后应尽量在温和条

件下操作，避免剧烈震荡DNA，以减少对裸露DNA分子的机械剪切作用。

3)为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电压不宜过高（通常不高于

5V/cm）。

六、思考题

1)质粒DNA与细菌染色体DNA分离的主要依据是什么？

2)溶液I、II、III的作用分别是什么？

3)琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？

附注

DNA分子量标记不同浓度琼脂糖可分辨的线性DNA大小范围

DNA Marker-D

综合实验二鸡肝中过氧化氢酶的

提取、分离与检测

一、实验目的

1.学习和掌握从动物细胞中提取蛋白质的方法及其原理。

2.学习和掌握用分光光度计测定过氧化氢酶活的原理及方法。

3.学习和掌握离子交换层析法的基本原理和层析分析蛋白质的实验操作方法。

4.学习和掌握SDS－凝胶电泳的原理和操作方法，学会利用SDS－凝胶电泳来鉴定蛋白质的纯度和测定蛋白质的相对分子量。

二、实验原理

过氧化氢酶（Catalase，CAT）是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。过氧化氢酶是在1811年被过氧化氢（H2O2）的发现者泰纳尔（Louis Jacques Thénard）首次发现。1900年，Oscar Loew将这种能够降解过氧化氢的酶命名为“catalase”，即过氧化氢酶，几乎所有的生物机体都存在过氧化氢酶。其普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。CAT在不同的组织中其活性水平高低不同。过氧化氢在肝脏中分解速度比在脑或心脏等器官快，就是因为肝中的CAT含量水平高。1937年，詹姆斯·B·萨姆纳将来自牛肝中的过氧化氢酶结晶，并在次年获得了该酶的分子量。1969年，牛的过氧化氢酶的氨基酸序列得以解出。而后，1981年，其三维结构得以解析。

它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。CAT作用于过氧化氢的机理实质上是H2O2的歧化，必须有两个H2O2先后与CAT相遇且碰撞在活性中心上，才能发生反应。H2O2浓度越高，分解速度越快。

过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。在纺织工业中，过氧化氢酶被用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含过氧化物的。它还被用在隐形眼镜的清洁上：眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡后，使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。过氧化氢酶在美容业中的使用：一些面部护理中加入了该酶和过氧化氢，目的是增加表皮上层的细胞氧量。

本实验以动物肝为材料，学习从动物细胞中提取酶的方法和技术。首先从肝

中提取可溶性的蛋白质，并测定其蛋白质的含量和过氧化氢酶的活力；然后采用硫酸铵分级盐析及透析，并测定过氧化氢酶活力；最后采用SDS-凝胶电泳鉴定过氧化氢酶的纯度和测定其分子量。

三、主要仪器、材料和试剂

主要仪器：紫外分光光度计、冷冻离心机、电泳仪、垂直电泳槽等。

材料及试剂：新鲜鸡肝

一、水浸提法提取过氧化氢酶

样品提取缓冲液：称取Tris 0.606g，KCl 0.746g，甘油20.00g，加双蒸水到总体积100ml，用HCl调pH至7.1。

实验步骤

1.肝脏研磨液的制取取新鲜的肝脏(如猪肝、鸡肝、兔肝等)去掉其中非肝细胞部分(如大血管、胆、脂肪等)，用刀切成小块，冷冻至4℃以下，放在研钵中研磨成糊状，制成肝脏研磨液。

2.水浸提法提取过氧化氢酶按研磨液与水的体积比为1:5计算，加入相应体积的样品提取缓冲液浸提，浸提温度为25℃，浸提时间为5 h左右。4℃下以10000r/min离心20 min，得上清液备用。

3.将上清液分为3份：一份用于测总蛋白含量及过氧化氢酶活性：一份保存冰箱中用于最后SDS-PAGE电泳；另取一份用于盐析、透析等。

二、过氧化氢酶粗酶液的分级盐析及透析

先测量提取液的总体积，根据附录Ⅰ后的硫酸铵饱和度的常用表计算需加的硫酸铵的量（一般用0℃的表）。

实验步骤

1.将硫酸铵研磨成粉末加入粗酶液中，使达40%饱和度（使大部分杂蛋白沉淀），在电磁搅拌器上边搅拌边加入，然后置冰箱放置1～2h。

注意：加硫酸铵时要缓慢，以避免造成局部浓度过高。

2.12000 r/min冷冻离心20min。收集上清液S1（取部分上清液测总蛋白及酶活力）。上清液中再加入硫酸铵使达80%饱和度，放置1h左右，12000r/min冷冻离心20min，收集上清液S2（取部分上清液测总蛋白及酶活力）。

3.将第二次离心的沉淀复溶于1/20原始体积的缓冲液中，装入透析袋中，用大量的此缓冲液在冰箱中进行透析过夜（4℃），其间更换缓冲溶液约3-4次，

直至无白色沉淀析出为止（用BaCl2溶液检查）。透析完毕后，将提取液保存于冰箱中备用，取部分提取液测总蛋白及酶活力，也留部分进行SDS电泳。

注：透析袋一般采用赛璐璐和赛璐璐酚等材料做成，使用前需处理，以消除附着的重金属、蛋白水解酶和核酸酶。处理时，将透析袋放入0.5mol/l的EDTA溶液中煮半个小时，弃去溶液，换上水，再煮几次，贮存在含0.01%的NaN3水中（4℃）。使用时，只能用镊子或戴手套操作。

三、考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量

考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）染色法是1976年由Bradford建立的一种测定蛋白质含量的方法。该方法试剂配制简单，操作简便快捷，反应灵敏（灵敏度比Lowry法高4倍）。是一种常用的快速测定微量蛋白质的方法。

1.实验原理

考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。以牛血清白蛋白(BSA)为标准品配制浓度梯度标准液，用考马斯亮蓝G-250法进行吸光值的测定，作标准曲线。然后依据标准曲线推算样品中蛋白质含量。

2.实验材料

（1）实验器材：

可见分光光度计，玻璃比色皿，试管与试管架，烧杯，容量瓶等

（2）试剂

①牛血清白蛋白标准溶液称取100mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸馏水中即为1mg／ml的原液，使用时，蛋白质溶液稀释到0.1mg／ml。

②称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml 95％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。此溶液在常温下可放置一个月。

③待测浓度蛋白：分离纯化过程中所留的样品。

3.实验方法

①蛋白标准曲线的制作

取7支干净的试管，按表1取样。将各试管中溶液混合均匀，放置5min后，