使用CRISPR-CAS系统构建可遗传的基因敲除小鼠和大鼠

使用CRISPR-CAS系统构建可遗传的基因敲除小鼠和大鼠致编辑：CRISPR-CAS系统已经成为一种细胞和模式生物中有效的基因编辑技术。

我们使用CRISPR-CAS系统，通过同时注入两种单导向RNA靶向Uhrf2,同时带入Cas9 mRNA来诱导小鼠的DNA片段缺失。

此外，我们通过一种单一的显微注射方法得到了敲除Mc3R和Mc4R两种基因的大鼠。

在小鼠和大鼠中均观察到较高的种系转移效率（突变可遗传）。

成簇有序间隔短回文重复关联蛋白系统（CRISPR-CAS系统）是一种在细菌和古细菌中演变的针对病毒和质粒入侵的基于RNA的后天免疫系统。

【Bamboo注：该系统由一段Cas基因（双链DNA核酸酶）加一段特异序列组成，Cas作用为结合导向RNA,切割目的基因，导向RNA为CRISPR序列转录而成，有二级结构】根据作用机制不同，CRISPR-CAS系统目前有三种类型。

在第二类型（下文称该系统）中，CRISPR序列转录RNA（crRNA）和反式激活RNA(TraceRNA)结合后有能力引导Cas9核酸内切酶到特定的序列，从而导致目标DNA双链缺失。

【Bamboo注：机理：摄取了病毒DNA后，CRISPR 序列在转录产物tracrRNA,表达产物CAS蛋白，RNA酶共同作用下产生导向RNA,导向RNA含有病毒DNA序列，可遗传给下一代，再遇到病毒DNA时将其剪切】之前的研究表明在哺乳动物中有多种基因工程使用RNA介导的Cas9核酸酶系统。

最近，使用该系统进行高效基因编辑已经在斑马鱼、小鼠和细菌中实现。

几个小组也证明通过该系统介导的在细胞和斑马鱼中基因靶向效率与ZFNs（锌指核酸酶）和TALENs（转录活化因子效应核酸酶）【Bamboo注：另外两种常见DNA编辑方式】相似或较高。

虽然已经有报道在单个小鼠胚胎中可使用该系统打乱多个基因，但是在动物体中尚未见该系统介导的突变种系转移。

此外，长的特异的基因组DNA片段能否被该系统敲除也是未知的。

CRISPR-CAS系统基因打靶在其他哺乳动物模型，例如实验室大鼠的效用，还需要确定。

在这里，俺们报告俺们使用该系统在小鼠和大鼠中实现了高效的，可遗传的基因敲除。

图1使用该系统产生基因突变鼠。

(a)该系统构建：Spacer-核酸引导序列；DR-分隔核酸引导序列的小重复片段；NLS-核酸定位信号序列。

(b) F0代大鼠注射导向RNA后突变体的检测：Mc4r靶向前后（-，+）分别使用T7E1酶切Mc4r F0代大鼠尾基因组PCR产物。

箭头为突变带，M是Marker.(c) Mc3r和Mc4r基因的序列。

红框为核苷酸替换。

右侧显示碱基对序列改变。

通过DNA测序分析六组克隆扩增的PCR产物序列。

各基因型在六组克隆的发生率列在右侧。

为了测试该系统在小鼠中的活动，初始试验选用了细胞中基因组Th位点已经被有效靶向的小鼠。

首先，我们向FVB小鼠品系雄性原核（受精卵核物质融合前）中注入不同浓度的线性DNA(针对特定CrDNA和tracrRNA的人工编码Cas9核酸内切酶基因)（图1a），在子鼠中检测Th位点基因突变情况。

同ZFNs（锌指核酸酶）和TALENs （转录活化因子效应核酸酶）相似，该系统诱导的双链DNA缺失主要被NHEJ(非同源性末端结合修复机制)修复。

通过高浓度（2.5ng/μl）DNA注射,仅有1/11（9%）的子鼠产生Th位点突变，低浓度则只有野生型子鼠（表1和附图1）。

这说明该系统使用线性DNA突变率比较低。

为了提高效率，于是我们注射体外合成的RNA。

首先，我们通过体外转录Cas9片段构建了Cas9表达载体,在包含靶向的人工编码序列载体里隐藏了SP6启动子序列。

我们还建立了一个融合crRNA和tracrRNA的表达载体,使用T7启动子驱动在tracrRNA3‘端衍生合成含有20个靶向特异核苷酸序列的sgRNA（定制合成RNA）（图1a）。

同TALENs同样浓度（25ng/μl）的Cas9 mRNA，还有Th靶向sgRNA（定制合成RNA）（12.5ng/μl）被显微注射到单细胞阶段的C57BL / 6小鼠胚胎的细胞质中。

经过T7E1酶切和DNA测序，90%（8/9）注射后的子鼠Th位点有突变（附图1）。

试验组6最长的缺失有70bp。

在Rheb基因位点插入或缺失突变的试验小鼠也可以通过这个策略高效率得到（表1和附图2）。

CRISPR-CAS系统的一个最重要的优点是，Cas9蛋白可以通过单个gRNAs引导修改多个基因组靶标。

为了在小鼠体内测试这个，我们针对Uhrf2中横跨86bp的两个相邻位点设计并插入了两种sgRNA（定制合成RNA）和Cas9 mRNA到胚胎里，12组F0代小鼠中有11组Uhrf2位点有突变，有6组在同样的等位基因上有7种不同的突变（附图3）。

6组中有3组在两个位点有大量缺失（附图3）。

这些大的突变可能是由于两个位点DNA同时切除，随后又被末端连接。

通过ZFNs和TALENs在试验中所产生的突变可被有效地遗传到下一代，但据我们所知，CRISPR -CAS系统的种系遗传效率在动物中尚未见报道。

为了研究这个问题，我们通过T7E1酶切或DNA测序检测Th试验组和野生型小鼠幼崽或胎儿的基因型。

虽然在DNA注射后鼠尾部DNA的检测中只有两个突变体，但是10组F1代小鼠胎儿中有6组个发现有5种不同的突变（附图4）。

这些数据意味着试验组的突变源自于Cas9在胚胎中切除DNA的延误。

这也表明从试验组6组鼠尾PCR产物的DNA测序中有可能发现不了所有的突变。

通过基因注射产生的另两个试验组突变也被传给下一代（附图4 ）。

这些数据表明，CRISPR -CAS系统是有用的遗传工具，产生可遗传的突变小鼠效率很高。

实验室老鼠是模拟疾病的重要工具，是毒理学和药理学的优秀模型。

之前的研究已经通过ZFNs和TALENs成功产生基因敲除小鼠，我们尝试使用该系统产生基因敲除小鼠。

针对大鼠黑素皮质素受体3（MC3R）和黑皮素4受体（MC4R）我们合成了两种sgRNA（定制合成RNA）。

Cas9 mRNA和两种sgRNA的混合物分别被注射进1细胞期的Sprague-Dawley大鼠胚胎，然后将其转移到假孕雌性。

提取子鼠基因组DNA进行PCR 扩增。

T7EI酶切及DNA测序数据表明，无论是MC3R和MC4R基因位点都是由CRISPR -CAS系统修改得到（图1b ， c）。

然而，这两个Cas9为基础的核酸酶活性有很大的不同。

通过T7EI酶切及DNA测序数据，15个F0幼鼠中13个幼崽被确定为MC4R基因突变鼠的试验组（图1b）。

不需酶切就很容易用PCR检测含有大量缺失的试验组。

通过T7E1酶切无法鉴定MC3R基因突变试验组，但通过测序得知一只大鼠有MC4R基因突变，也有一个单核苷酸缺失的MC3R基因突变（图1c）。

我们研究了MC4R试验组体重，食物摄取，胰岛素水平和瘦素mRNA水平，发现该突变体与已被用作肥胖动物模型的N -乙基-N-亚硝基脲（ENU ）诱导MC4R突变鼠表现出相似的表现型（附图5）。

这些数据表明，CRISPR -CAS系统可以产生基因敲除鼠，并且，该效率取决于靶标基因。

另外，单次注射能够诱导大鼠的至少两个不同基因的混乱。

为了确定Cas9介导的基因突变大鼠种系遗传能力，我们通过MC4R突变鼠试验组12与野生型鼠（杂交？）确定鼠胎儿的MC4R序列。

经鉴定6组胎儿中的3组含有两个不同的突变（附图6），这表明Cas9介导的基因突变大鼠具有高效率的种系遗传。

基因组编辑另一个重要的问题是体内特异性。

以往的研究表明有两个错配如何影响Cas9介导的DNA敲除的规则。

其一在PAM的5‘端的单碱基到12个bp的错配，完全取消了Cas9介导的DNA缺失。

另一种是如果要高效清除，gRNA和PAM近端的靶标向DNA之间需要至少13个bp的匹配，并且该序列以外的不匹配是允许的。

我们通过分析这两类小鼠基因组中潜在的脱靶位点研究了该系统对靶标的特异性。

因为分析所有潜在的脱靶位点比较难，我们选定少于四个错配的两个部位或与相邻的PAM匹配大于11个bp（附图7）的，通过测序观察到在12个试验组的潜在脱靶位点没有突变（附图7）。

在细胞和斑马鱼中， CRISPR - CAS系统介导的基因混乱同TALENs有类似的效果。

但是我们的研究，同之前的研究一致表明该系统比ZFNs和TALENs更牛掰，至少在小鼠中。

我们之前的研究发现TALENs产生的小鼠效率为13%到67%，而该系统诱导效率通常大于70%。

我们还注意到，CRISPR-CAS系统（表1）的毒性（指注射后立即生存能力）比TALENs有一点点大。

CRISPR-CAS系统的种系遗传效率与TALENs相似。

我们也发现与TALENs相比，某些靶标不能由CRISPR-CAS敲除，原因不明（未示出数据），但是潜在的靶标应该比TALENS更多。

虽然靶标比TALENS和ZFNs的短，但我们的研究中使用CRISPR-CAS系统没有脱靶突变事件表明它是一个可靠的动物基因编辑技术。

Fu最近出版的一篇文章也更全面的研究了各基因编辑系统的优劣。

在这项研究中，我们使用CRISPR-CAS系统成功地产生了不同遗传背景特异基因敲除小鼠，在Sprague-Dawley大鼠中进行了特异基因敲除。

在哺乳动物的有机体功能基因研究方面，高效率的基因组修饰活性和种系遗传效率的RNA引导的CRISPR-CAS 系统是很有用的基因工具。