分子生物讲义：第七章 分子生物学常用技术
分子生物学 第七章 蛋白质的生物合成
7.1 遗传密码 7.2 tRNA 7.3 氨酰-tRNA合成酶 7.4 核糖体 7.5 与蛋白质合成有关的因子 7.6 蛋白质合成的生物学机制 7.7 蛋白质转运机制
比DNA复制和转录更为复杂的过程
氨基酸活化与转运----这个过程是在氨基酸活化酶和镁 离子作用下把氨基酸激活成为活化氨基酸。 起始----核糖体与mRNA结合并与氨酰基tRNA生成起 始复合物。 延伸----由于核糖体沿mRNA5’端向3’端移动，开始了 从N端向C端的多肽合成，这是蛋白质合成过程中速度 最快的阶段。 终止以及肽链的释放，核糖体从mRNA上解离，准备 新一轮合成反应。
（3）校正tRNA 校正tRNA分为无义突变及错义突变校正。 无义突变:在蛋白质的结构基因中，一个核 苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码 子变成终止密码子（UAG、UGA、 UAA），使蛋白质合成提前终止，合成无 功能的或无意义的多肽。
错义突变是由于结构基因中某个核苷酸
的变化使一种氨基酸的密码变成另一种 氨基酸的密码。 错义突变的校正tRNA通过反密码子区的 改变把正确的氨基酸加到肽链上，合成 正常的蛋白质。（摆动原理现象）
结合的AA-tRNA分开。
7.1.3 遗传密码的特点
⑴连续性
⑵简并性与偏爱性
⑶通用性与专一性
（特殊性）
⑷终止密码
⑸密码子与反密码子
简并性： 由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象。 18种氨基酸都有一个以上的密码子 。
同义密码子。
只有精氨酸是个
例外，因为在真 核生物中CG双联
7.2 tRNA
7.2.1 tRNA的结构 由于链内的碱基互 补配对，tRNA呈现
分子生物学技术课件
蛋白质在离心场中的行为用沉降系数表示,沉 降系数与蛋白质的密度和形状相关 。
因为沉降系数S大体上与分子量成正比关系，故可 应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高 度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。
蛋白质的分子量和沉降系数
基因工程的基本原理! 生命的起源？
基因组、转录组、蛋白质组、代谢组之间的关系
基因组学是基础、 转录组学是信息、 蛋白质组学是功能、 代谢组学是结果。
整合也是创新
• 方法的结合 • 形态与机能研究的结合 • 中西医的结合
21世纪分子医学发展的主要领域
• 分子诊断 • 基因治疗 • 生物工程药物
第一讲
++ +
+
+
+ ++
带正电荷的蛋白质
碱
酸
不稳定的蛋白质颗粒
－－
－
－
－
－－ －
带负电荷的蛋白质
溶液中蛋白质的聚沉
•免疫沉淀法（immunoprecipitation）
将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特 异抗体。
利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原 抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得 抗原蛋白。
测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法
• 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺 序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨 基酸顺序的结果。
氨基酸和肽的末端测定法
化学法
二硝基氟苯法（DNP法）
肼解法
二甲基氨基萘磺酰氯法（Dansyl-氯法）还原成氨基醇法
溶解法
分子生物学常用技术及其应用
一、基因工程的基本概念
DNA重组：不同来源的DNA分子可以通 过末端共价连接而形成重新组合的DNA 分子的过程。
基因工程：将基因进行克隆，并利用克 隆的基因表达、制备特定的蛋白或多肽 产物，或定向改造细胞乃至生物个体的 特性所用的方法及相关的工作。
二、工具酶
限制性核酸内切酶 其它工具酶
第二节
重组DNA技术-基因工程
重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最 重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。
重组DNA技术（Recombinant DNA Technique） 是人类根据需要选择目的基因（DNA片段） 在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞 或生物体内，以达到改良和创造新的物种和 治疗人类疾病的目的。
人类和哺乳动物的基因组很大， 甚至许多单个基因也相当大（如： DMD gene 2300kb） ，克隆分析 就需要更大的基因载体。如近年 来构建的一些载体：BAC，PI， YAC等。
1、细菌人工染色体（bacterial
artificial chromosome,BAC）
优点：能携带大片段DNA， 约300kb。
（一）
构建基因 组Dcific library）
单个染色体 → 细胞克隆
（流式C仪）
体重组，导入宿主 细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。 如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异 的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆。 （expression cloning）.
目的基 因表达
（一）真核细胞的基因在原核细胞
（细菌）中表达
原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，RNA剪 接因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆 菌为宿主。 真核多肽的表达要求： 1）适当的cDNA（完整的编码序列）； 2）适当的表达载体，提供特定多肽信息； 3）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。 产物特征： 1）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定； 2）活性受限或无活性。
医学分子生物学 7 分子生物学常用技术
5′
3′
*********G —OH
*********C T T A A — P
3′
5′
5′
3′
P A A T T C*********
OH— G*********
3′ 5′
EcoR I: dATP+ [α-32P]-dTTP
19
根据反应原理确定同位素反应底物名称
• DNA的切口平移标记法 • 随机引物标记法 • DNA的3′末端标记
• 极高的特异性
缺点 半寿期短, 故要随用随标 放射性污染
9
1. DNA探针放射性标记方法
(1) 切口平移标记法 (2) 随机引物标记法 (3) PCR标记法 (4) 5′-末端标记 (5) 3′-末端标记
10
(1) DNA的切口平移标记法
5′
3 ′ 双链DNA
3′
5′
DNase I，Mg2+
② 反应产物的长度与加入的寡核苷酸引物的量呈反比。
当需要较长片段探针，可适当减少随机引物的加入量。
③ 所得到的标记产物为新合成的DNA单链。当采用单链
DNA片段或RNA作为模板时，必须注意得到的标记探针并 不是其本身.
④ 反应条件要控制在pH值6.6，抑制Klenow DNA聚合酶
的3′－5′外切酶的活性。
第七章 分子生物学常用技术
1
第一节 核酸分子杂交
2
*核酸分子杂交：
具有一定互补序列的不同来源的核苷酸单 链在一定条件下按照碱基配对的原则形成
杂交双链的过程。
实质: 核酸分子的变性与复性过程
变性：将双链DNA分子解聚成为单链的过程 复性：使单链聚合成双链的过程，又称为退火. 特点：高度特异性和灵敏性 杂交的双方: （靶,target） --待测序列
分子生物学基本技术
分子生物学基本技术包括核酸的纯化，体外合成、分子杂交、基因克隆、基因表达研究技术等第一节DNA的体外合成一、DNA的化学合成（无要求）一亚磷酸三酯法DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸。
目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的，大多数DNA合成仪是以固相亚磷酸三酯法为基础设计制造的合成的原理：核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。
每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。
合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。
（末端核苷酸的3’-OH与固相载体成共价键，5’-OH被二甲氧基三苯甲基（DMT）保护，下一个核苷酸的5’-OH亦被DMT保护3’-OH上的磷酸基上氨基亚磷酸化合物活化碱基上的氨基用苯甲酸保护。
每延伸一个核苷酸需四步化学反应（1）脱DMT游离出5’-OH。
⑵缩合（偶联反应）：新生成的5’-OH与下一个核苷活化的3’单体缩合成亚磷酸三酯使链增长（3）盖帽（封端反应）：有少量（小于0.5%）未缩合的5’-OH要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。
（4）氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷（磷酸三酯）。
上述步骤循环一次，核苷酸链向5’方向延伸一个核苷酸二、聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）是一种体外特定核酸序列扩增技术。
一）PCR的基本原理双链DNA热变性成两条单链，降温使反应体系中的两个引物分别与两条DNA单链两侧的序列特异性复性，在合适的条件下，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，利用反应体系中的4种dNTP合成其互补链（延伸），在适宜的条件下,这种变性一复性一延伸的循环重复1次DNA的量可以增加1倍，30次循环后，DNA的量增加230倍。
分子生物学常用技术-PPT课件
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链
分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一
起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定
的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形
成杂化双链(heteroduplex) 。
目录
三、DNA自动测序
采用荧光替代放射性核素标记是实现 DNA 序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四 种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反
应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，
通过四种激光激发不同大小 DNA 片段上的荧光 分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集 荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。
SuperSignal® 底物与二抗HRP反应发光
5 3
SuperSignal®
4
HRP标记二抗与一抗－蛋白复 合物结合
一抗与蛋白结合 (小鼠单抗 或兔多抗)
1
电泳分离，转膜，固定蛋白于膜上
2
漂洗和封闭
目录
其他
斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array)
——目的基因的受体动物
目录
目录
二、核转移技术
核转移技术
即动物整体克隆技术，将动物体细胞
核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，
使之发育成个体，即克隆(clone)。
目录
三、基因剔除技术
基因剔除技术
也称基因靶向(gene targeting)灭活， 有目的去除动物体内某种基因的技术。
分子生物学常用技术
分子生物学常用技术一．琼脂糖凝胶电泳琼脂糖是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取的。
当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的。
经过化学修饰的低熔点（LMP）的琼脂糖，在结构上比较脆弱，因此在较低的温度下便会熔化，可用于DNA片段的制备电泳。
凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关（见表）。
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2～50kb之间；而要分辨较小分子量的DNA片段，则要用聚丙烯酞胺凝胶，其分辨范围为1个碱基对到1000个碱基对之间。
凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小。
浓度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越强，反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱，例如，20％的聚丙烯酰胺凝胶的分辨力可达1～6 bpDNA小片段，而要分离1000bp的DNA片段，则要用3％的聚丙烯酚胺的凝胶。
再如，2％的琼脂糖凝胶可分辨小到300bp的双链DNA分子，而对于较大片段的DNA，则要用低浓度（0.3％～1.0％）的琼脂糖凝胶。
琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小范围(bp)0.3％琼脂糖 50 000 ～1 0000.7％琼脂糖 20 000 ～1 0001.4％琼脂糖 6000 ～ 3004.0%聚丙烯酰胺 1 000 ～ 10010.0%聚丙烯酰胺 500 ～ 2520.0%聚丙烯酰胺 50 ～ 1凝胶电泳既是一种分析的手段，也可以用来制备和纯化特定的DNA片段。
有两种不同类型的琼脂糖凝胶，一种是常熔点的，另一种是低熔点的，而后者的价格却相当昂贵。
它们都是琼脂的衍生物，具有很高的聚合强度和很低的电内渗，因此都是良好的电泳支持介质。
LMP琼脂糖是一种熔点为62～65℃的琼脂衍生物，它一旦熔解，便可在37℃下持续保持液体状态达数小时之久，而在25℃下也可持续保持液体状态的10分钟， LMP琼脂糖可以不经电洗脱或破碎凝胶，即可用来回收ＤＮＡ分子。
分子生物学常用技术共35张-2024鲜版
•分子生物学概述•基因克隆技术•核酸测序技术•蛋白质组学技术•基因表达调控研究技术•细胞信号传导途径研究技术•生物信息学在分子生物学中应用contents目录01分子生物学概述分子生物学定义与发展分子生物学定义发展历程包括基因的结构、功能、表达调控以及基因组的结构、功能与进化等。
基因与基因组研究DNA 复制、转录与翻译蛋白质组学基因表达调控研究DNA 的复制、转录和翻译过程及其调控机制，揭示遗传信息在细胞内的传递和表达规律。
研究细胞内所有蛋白质的表达、功能及其相互作用，揭示蛋白质在生命活动中的作用机制和调控规律。
研究基因表达的时空特异性及其调控机制，包括转录因子、表观遗传学修饰等。
分子生物学研究内容分子生物学与生物技术关系生物技术定义生物技术是以生命科学为基础，利用生物（或生物组织、细胞及其他组成部分）的特性和功能，设计、构建具有预期性能的新物质或新品系，以及与工程原理和技术相结合进行社会生产或为社会服务的一种综合性技术。
分子生物学对生物技术的影响分子生物学的发展为生物技术提供了重要的理论基础和技术支持，推动了基因工程、细胞工程、发酵工程等生物技术的飞速发展。
同时，生物技术的发展也反过来促进了分子生物学的深入研究，为揭示生命现象的本质和规律提供了有力手段。
02基因克隆技术步骤目的基因的获取载体的选择与构建030201重组DNA分子的构建将目的基因与载体连接，形成重组DNA分子。
重组DNA分子的转化将重组DNA分子导入受体细胞，如细菌、酵母或哺乳动物细胞等。
转化细胞的筛选与鉴定通过选择性培养基或PCR等方法筛选含有重组DNA分子的细胞，并进行鉴定。
0102载体选择构建策略添加启动子和终止子添加选择性标记优化载体结构030405载体选择与构建策略重组DNA转化与筛选方法转化方法筛选方法03核酸测序技术1. DNA模板制备2. 引物设计3. 测序反应4. 产物纯化015. 变性凝胶电泳026. 放射自显影031 2 3NGS技术原理NGS技术特点NGS技术应用第二代测序技术（NGS）简介第三代测序技术（TGS）展望TGS技术原理TGS技术特点TGS 技术应用前景04蛋白质组学技术蛋白质组学概念及研究内容蛋白质组学概念研究内容层析法利用不同物质在固定相和流动相之间分配系数的差异进行分离，如凝胶层析、离子交换层析等。
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琼制糖凝胶电泳常用的DNA分子量标准
噬菌体λDNA限制性酶切片作标准（kb）
Hind III
EcoR I
BgL IIα
Ava Iα
23.7
（3）高筛分琼脂糖：一般琼脂糖的孔径 较大，对1000bp以下的分子分离效果较 差。新近生产的高筛分琼脂糖具有高分 辨率及高强度等优点，能区分相差4个碱 基的DNA片段，除可用于RCR产物的分析 外，还能用于基因分型、四核苷酸重复 序列分析等。
2．凝胶浓度的选择 琼脂糖一般用于分 离200~50000bp的DNA片段。凝胶浓度 不同，分辨DNA大小的范围不同。根据 需要分离的核酸分子的大小选择合适的 凝胶浓度，即可达到理想的分离效果。
21.8
22.8
15.9
9.46
7.52
13.6
8.8
6.57
5.93
9.8
6.1
4.26
5.54
2.3
4.6
2.26
4.80
0.46
1.8
1.98
3.41
1.61
0.58
1.55
质粒pBR322限制性酶切片作标准（bp）
Taq I
Mbo I
Alu I
Hinf I
1444
1374
910
1631
1307
分子生物学常用技术
第一节 凝胶电泳
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳 （electrophoresis）。
电泳技术主要用于分离各种有机物（如氨基酸、 多肽、蛋白质、酶、脂类、核苷、核苷酸、核 酸等）和无机盐，也可用于分析某种物质的纯 度及分子量的测定等。
电泳技术在分子生物学领域应用非常广泛，特 别是以琼脂糖和聚丙烯酰胺为支持介质的凝胶 电泳，以操作简便、快速、灵敏、分离范围广 等优点成为分离、纯化、分析和鉴定核酸的主 要手段。
665
659
517
475
341
655
506
368
341
521
396
315
317
403
344
312
272
281
298
141
258
257
221
207
236
220
105
136
154
91
100
75
4．琼脂糖凝胶电泳缓冲液
缓冲液有用于双链DNA电泳，pH为8.0的Tris-乙酸 （TAE）、Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）缓冲 液，和用于变性单链DNA的碱性电泳缓冲液（pH8.0， 含50mmol/L NaOH，1mmol/L EDTA）。
6．电泳条件 DNA琼脂糖凝胶电泳通常采 用 1~2V/cm 凝 胶 （ 低 压 电 泳 ） 、 8~10V/cm （ 中 压 电 泳 ） 或 几 十 伏 以 上 /cm（高压电泳）的电压降进行恒压电泳。 电泳时间可根据指示剂的迁移位置确定。 电泳温度以15~25℃为宜。
7．DNA电泳染色
DNA电泳采用荧光染料溴乙锭（EB）染 色。溴乙锭能与DNA结合，嵌入配对碱 基之间，在紫外光照射下，DNA区带发 出红色荧光，根据荧光可以确定DNA在 凝胶中的位置。使用时将溴乙锭直接加 入凝胶液中，使其终浓度为0.5μg/ml， 或于电泳完毕后，将电泳凝胶浸入含 0.5μg/ml溴乙锭的溶液中，染色30~45 分钟后，即可在紫外灯下观察、拍照。
凝胶浓度（%，w/v） 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
表17-1 不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围
线状双链DAN片段的分离范围（kb） 60 ~ 5 20 ~ 1 10 ~ 0.8 7 ~ 0.5 6 ~ 0.4 3 ~ 0.2 2 ~ 0.1
3．DNA分子量标准
通常采用已确定核苷酸序列的噬菌体或质粒 DNA，经限制性核酸内切酶完全水解，然后用 所获得的特定大小的酶切片段作为DNA凝胶电 泳的分子量标准（DNA marker）。
和构象的核酸分子由于所受到来自电场的驱动
力和来自凝胶分子筛网孔的阻力差异，具有不 同的迁移率。
（二）操作要点
1．琼脂糖的选择 琼脂糖是一种从海洋植物琼脂中提取出来的
长链状多聚物。一般琼脂糖在溶液中加热到 80~900C熔化，形成清亮、透明的液体，浇在 模具上冷却后固化形成凝胶，是一种理想的电 泳支持物 .不同的琼脂糖产品在纯度、熔解温 度以及成胶后的机械强度等特性上有较大差异。 使用者可以根据研究需要选择不同类型的产品.
一、琼脂糖凝胶电泳
（一）原理 核酸分子是两性解离分子。在
pH3.5时，碱基上的氨基基团解离，而三个磷 酸基团中只有一个磷酸解离，整个核酸分子带 正电荷；在pH 8.0~8.3时，碱基几乎不解离， 磷酸全部解离，核酸分子带负电荷。若将由 pH8.0电泳缓冲液制成的凝胶置于电场中，核 酸分子由于带负电荷会向正极泳动将凝胶板全部浸入电泳 缓冲液中，以“潜水电泳”的方式进行。
为了不使样品在电泳槽缓冲液中上漂并指示电 泳的距离，常在制备好的DNA样品中加入含有 蔗糖或甘油以及指示剂（溴酚蓝、二甲苯青等） 的上样缓冲液。
样品中含盐量不能太高，否则电泳中会出现区 带消失、前沿不齐等现象。样品中DNA含量以 每条区带的DNA不少于0.1μg为宜。DNA浓度 亦不能过高，否则会使电泳区带变宽，泳动距 离异常。样品的用量由加样孔的体积决定，通 常为10~50μl。
TAE的缓冲能力较差，长时间电泳后会使其缓冲容量消 失，使阳极变为碱性，阴极变为酸性，故需及时更换 缓冲液。TBE和TPE的缓冲能力较强，可重复使用数次。
碱性缓冲液不能直接用于熔化凝胶，因为NaOH加入热 琼脂糖溶液后会引起多糖水解。制胶时应先用蒸馏水 溶解琼脂糖，在倒胶前再加入碱性缓冲液。
（1）低熔点琼脂糖：这类琼脂糖由于在糖 链上引入羟乙基，熔点降低，熔化温度
700C，低于双链DNA的变性温度，故利 于DNA的回收，但这种凝胶的分辨率及 机械强度较差.
（2）高纯或超纯琼脂糖：一般琼脂糖中 常含有其他多糖、盐及蛋白质等杂质， 这 些 杂 质 往 往 会 对 DNA 、 RNA 片 段 的 酶 切、标记或进一步克隆有干扰。另外， 高纯度琼脂糖凝胶强度较高，不易破碎.