纯化水微生物限度检查分析方法确认方案
纯化水微生物限度检查分析方法确认方案
目录
1. 介绍 (4)
2. 目的 (4)
3. 适用范围 (4)
4. 职责 (4)
4.1验证小组职责 (4)
4.2工程部职责 (4)
4.3质量中心职责 (4)
4.4验证办公室职责 (4)
4.5质量管理负责人职责 (5)
5. 缩略语 (5)
6. 法规指南 (6)
6.1法规 (6)
6.2指南 (6)
7. 参考文件 (6)
8. 方法描述 (7)
8.1测定方法描述 (7)
8.2规程 (7)
8.3可接受标准 (7)
9. 验证设计 (8)
9.1验证不确定性控制措施 (8)
9.2潜在风险清单 (8)
9.3试验设计 (10)
10. 文件管理规范 (10)
11. 测试项目列表 (12)
12. 测试描述和可接受标准 (13)
12.1人员确认 (13)
12.2仪器/设备确认和校准确认 (13)
12.3文件确认 (14)
12.4培养基/试剂确认 (14)
12.5样品确认 (15)
12.6薄膜过滤法计数方法验证 (15)
13. 偏差处理 (16)
14. 变更控制 (16)
15. 验证报告 (17)
16. 附件清单 (17)
17. 支持性附件清单 (17)
18. 测试报告 (17)
1.介绍
微生物限度检查方法用于纯化水微生物限度测定，方法来源中国药典2010版，二部，附录Ⅺ J “微生物限度检查法”。
本方案的目的是建立文件记录证明纯化水微生物限度测定方法在本公司质量控制实验室的适用性和可重现性，方法能够提供一致、可信和准确的微生物限度检测数据。
2.目的
/038）进行方法确认。
对《纯化水微生物限度测定标准操作规程》（SOP/A0/QC
03
证明该方法适用于纯化水微生物限度检查，具有准确性和可靠性，可达到控制产品质量的目的。
3.适用范围
本验证方案适用于纯化水的微生物限度检查放行测定。
4.职责
4.1验证小组职责
?对照品/试剂/物料/样品确认
?方案的实施，数据的收集
?最终报告的编写
?偏差报告的编写
4.2工程部职责
?提供在方案执行中所需仪器的校准证书
?执行前审核本方案
?报告审核
4.3质量中心职责
?执行前审核本方案
?报告审核
4.4验证办公室职责
?执行前审核本方案
?报告审核
4.5质量管理负责人职责
?批准本方案
5.缩略语
在下面的表格中规定了本方案中使用的缩略语。
6.法规指南
为了编写本方案，参考了以下文件：
6.1法规
?中国GMP（2010年修订）中国食品药品监督管理局（CFDA）
?中国药典（ChP）二部 2010版
6.2指南
?GMP指南中国食品药品监督管理总局（CFDA）2010
7.参考文件
为编写本方案，参考了以下文件：
8.方法描述
8.1测定方法描述
8.1.1实验准备
8.1.1.1核对待检供试品信息是否正确。
8.1.1.2核对试验用培养基、试剂、耗材是否在有效期内。
8.1.1.3核对试验用培养基适用性检查是否合格。
8.2规程
8.2.1检验量：纯化水的检验量为1ml。
8.2.2供试液的制备：以原液为供试液。
8.2.3细菌、霉菌及酵母菌检查法
量取100ml无菌0.9%氯化钠溶液加到培养器中，然后取1ml纯化水加入培养器中，并减压抽滤直至抽干。然后将培养器倒臵于洁净工作台上，使滤膜裸露，浇注温度不超过45℃的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基培养。
阴性对照试验：取试验用的稀释液100ml，照上述薄膜过滤法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。
培养和计数：细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。
8.3可接受标准
纯化水每1ml中细菌、霉菌及酵母菌数总数不得过50CFU。
9.验证设计
9.1验证不确定性控制措施
如果没有其它要求，下列操作和条件应被控制在要求的限度内，以控制验证不确定性。
9.2潜在风险清单
在给定分析方法生命周期中，不可避免“方法环境”的变化从而影响方法性能，方法的所有关键参数应被明确并经验证。风险评估表达使用定性描述，如“高”“中”“低”。一个风险的判定依靠风险优先性来定义。
A.严重性(S)
对失效可能造成的影响进行描述（即使没有失效发生的大的可能性）？
o低（L）：预计会对产品质量无影响或很微小的影响（质量在标准之内）。
o中（M）：预期对产品质量具有较小的影响。（质量不符合标准要求）。
o高（H）：预期对产品质量具有显著的影响（质量不符合标准要求）。
B.可能性(P)
描述失效发生的可能性（依据失效来源的描述）。
o低（L）：产品生命周期内不可能发生。
o中（M）：产品生命周期内可能会发生。
o高（H）：产品生命周期内将会发生多次。
C.可检测性(D)
描述故障的可检测性。
o低（L）：不太可能由操作人员或设备控制系统查到。
o中（M）：可由操作人员很容易地查到或具有报警。
o高（H）：通过设备控制系统自动检测并报警，可能自动采取恢复措施。
将把严重性和可能性合在一起来评价风险级别。将采用如下方法来确定风险级别：
在此步将对风险级别进行评价。在进行评价之后，将风险级别和可检测性合并到一起来确定整体的风险优先性。
风险优先性的“高”以“H”表示，“中”以“M”表示，“低”以“L”表示。
通过如下方式对风险优先性进行评价：
潜在风险和控制如下：
方法的关键参数经确定并将在实验过程中进行控制，H 级因素将进行独立验证以保证方法的稳定；L 级因素将通过实验室控制措施降低风险，不再进行验证。
9.3试验设计
《纯化水微生物限度测定标准操作规程》（SOP/A0/QC 03/038）用于纯化水微生物限度测定，方法为中国药典2部附录Ⅺ J “微生物限度检查法”。
本公司拟将此方法用于纯化水的微生物限度测定的放行检验。经过方法评估，方法应进行确认以保证方法在本公司微生物实验室的适用性。
根据评估结果和方法使用目的，验证性能参数设臵薄膜过滤法计数方法验证。
10. 文件管理规范
记录用笔：
? 使用黑色签字笔记录。 签名：
? 被授权的人员才能签署文件。
? 应签全名，除非文件另有规定。 ? 签名应始终一致。 填写栏目：
? 所有栏目必须填写。
? 填写内容与上面栏目相同也应重新填写。
? 填写栏目内容，应按照实际测试情况，对测试结果使用对勾“√”填写，只能选择一种测试结果填写。
如下：
? 若有单个栏目不需要填入内容，则在空白处填写英文字母“不适用”的简写
“N/A”，表示无此项内容。
?若有多个栏目不需要填入内容，应用斜线划掉，斜线上方填写“N/A”，下方签名并注明日期。
如下：
更改错误：
?在错误处划线，填入正确的内容，签名并注明更改日期，确保原先信息仍清晰可识别。
如：2012年01月02日修改人签名和修改日期
2012年01月01日
记录日期：
?年用4位数表示，日和月用2位数表示
如：2012年09月01日
书面语及名称：
?使用规范的书面语及名称。
文件前后名称要一致。
11.测试项目列表
在下面的表格列出了本方案将要执行的测试。
12.测试描述和可接受标准
12.1人员确认
?目的
确认所有执行本方案的人员符合要求。
?程序
●列出所有执行本方案的人员（姓名、部门、职位）。
●在验证程序开始前，对所有参与测试的人员进行方案和相关技能培训，培训
应该有记录。
●执行方案人员本人在签名处使用黑色签字笔书写本人签名以及日期。
?可接受标准
●所有执行本方案人员本人使用黑色签字笔正确书写本人签名及日期。
●所有执行本方案的人员已经过方案和相关技能培训并已记录。
?测试报告
测试结果填写在测试报告1《人员确认》表内。
12.2仪器/设备确认和校准确认
?目的
保证使用的仪器/设备都已经过验证和校准，并有文件记录。
?程序
●列出所有实验使用的仪器/设备。
●在测试报告2《仪器/设备确认和校准确认》中对每一台测试所用的仪器应
标识出仪器名称、编号、型号、用途、校准证明、校准日期、下次校准日期；
每台设备应标识出设备名称、编号、型号、用途、验证文件编号、验证日期、
下次验证日期。
?可接受标准
●测试使用仪器仪表均经过确认和校准，且在有效期内。
●用于校准的计量标准应该能够追溯到中国国家计量基准或相当的国际标准。
●所有确认和校准有文件记录。
?测试报告
测试结果填写在测试报告2《仪器/设备确认和校准确认》表内，如有偏差记录在偏差报告中。
12.3文件确认
?目的
确认验证相关的SOP和验证方案已经完成审批。
?程序
●在测试报告3《文件确认》中记录验证所需要文件名称、文件编号、版本，
存放位臵和文件状态。
●检查本验证方案的批准状态。
?可接受标准
●文件放臵在相应操作现场适当的区域；
●文件已经过批准，并且是现行版本，以保证准确性。
●本验证方案已经批准。
?测试报告
测试结果填写在测试报告3《文件确认》表内，如有偏差记录在偏差报告中。
12.4培养基/试剂确认
?目的
确认使用的培养基和试剂的适用性。
?程序
●列出实验使用的培养基和试剂。
●检查培养基的来源/批号/有效期/保存条件，非官方对照品提供检验报告单。
●检查试剂来源/批号/有效期/保存条件。
?可接受标准
所有培养基/试剂均来自批准的供应商，存放在需要的条件下，均在有效期内。
?测试报告
测试结果填写在测试报告4《培养基/试剂确认》表内，如有偏差记录在偏差报告中。
12.5样品确认
?目的
确认验证所用样品的来源和适用性。
?程序
●检验使用样品生产信息或来源信息。
●检查样品的包装完整程度及状态。
?可接受标准
最终产品应为生产规模产品；验证前样品包装完整，样品外观符合规范。
?测试报告
测试结果填写在测试报告 5《样品确认》表内，如有偏差记录在偏差报告中。
12.6薄膜过滤法计数方法验证
?目的
检查验证用纯化水对薄膜过滤法计数方法检测无干扰。
?程序
●供试液的制备：取原液作为供试液。
●
●试验组：取稀释液100ml加入培养器中，然后取纯化水1ml加入培养器中，
并减压抽滤直至抽干，加入制备的50～100CFU的试验菌，过滤，将培养器倒臵于洁净工作台上，使滤膜裸露，浇注温度不超过45℃的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基培养。
●菌液组：取制备的50～100CFU的试验菌，倾注培养基，冷却后至合适的温
度培养。
●供试品对照组：取稀释液100ml加入培养器中，然后取纯化水1ml加入培养
器中，并减压抽滤直至抽干，浇注温度不超过45℃的营养琼脂培养基或玫
瑰红钠琼脂培养基培养。
●稀释液对照组：取稀释液100ml，过滤，加入制备的50～100CFU的试验菌，
过滤，将培养器倒臵于洁净工作台上，使滤膜裸露，浇注温度不超过45℃
的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基培养。
●上述三组试验平行做三次。
●试验组菌回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液组
平均菌落数。
●稀释液对照组的菌回收率=稀释液对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数。
?可接受标准
●稀释液对照组的菌回收率均应不低于70%。
●若试验组的菌回收率均不低于70%，则可按该供试液制备方法和菌落计数法
测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低
于70%，应建立新的方法，消除供试品的抑菌活性，并重新验证。
?测试报告
测试结果填写在测试报告6《薄膜过滤法计数方法验证》表内，如有偏差记录在
偏差报告中。
13.偏差处理
如验证执行过程中出现任何偏差，需按照《偏差处理标准管理规程》
（SMP/A0/QA
/022，版本：00）处理。对验证中出现每个偏差都要给予一个唯一的编00
号并记录在偏差报告里。在测试报告7《偏差清单》中汇总所有的偏差，并注明解决
日期。
如有需要可复印偏差报告。
14.变更控制
如确认中存在变更，需按照《变更控制标准管理规程》（SMP/A0/QA
/023，版本：
00
00）进行控制并提交报告，变更控制表将被收集。
15.验证报告
执行本方案并完成了纠正措施之后，将生成一份最终报告。将编写对所获得结果的总结，并根据这些结果得出结论。由负责验证的审核人及批准人做出正式的接受/拒绝验证结果的决定。
报告将包括签批页、测试结果总结、偏差处理、变更控制、验证结论和建议、测试记录、附件清单和支持性附录清单组成。
16.附件清单
在附件清单中记录所有附在本方案中的测试报告，注明附件编号、测试报告号、名称和页数。
17.支持性附件清单
在支持性附录清单中记录所有对测试报告数据进行支持的各类文件，如：培训记录、校准证书、各种图表等文件。应注明附录编号、名称和页数。
附录编号可遵循附录所属附件号码，即所属附件1的附录即为附录1。如附件中仅有一个附录，则以附录所属附件编号表示，例如：附录1，附录4。如一个附件中包含多个附录，可按顺序进行编号，例如：附录1-1，附录1-2。名称为此附录的名称。页数为此项附录所包含所有页数。
18.测试报告
按照本方案中的测试项目设臵，测试报告为：
测试报告1 人员确认
测试报告2
仪器/设备确认和校准确认
中国药典纯化水检验标准
纯化水 汉语拼音: Chunhuashui 英文名: Purified Water 性状: 本品为无色的澄清液体；无臭，无味。 检查: 酸碱度取本品10ml，加甲基红指示液2滴，不得显红色；另取10ml，加溴麝香草酚蓝指示液5滴，不得显蓝色。 氯化物、流酸盐与钙盐取本品，分置三支试管中，每管各50ml。第一管中加硝酸5滴与硝酸银试液1ml，第二管中加氯化钡试液2ml，第三管中加草酸铵试液2ml，均不得发生浑浊。 硝酸盐取本品5ml置试管中，于冰浴中冷却，加10%氯化钾溶液0.4ml与0.1%二苯胺硫酸溶液0.1ml，摇匀，缓缓滴加硫酸5ml，摇匀，将试管子50℃水浴中放置15分钟，溶液产生的蓝色与标准硝酸盐溶液［取硝酸钾 0.163g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，精密量取1ml，加水稀释成100ml，再精密量取10ml，加水稀释成100ml，摇匀，即得（每1ml相当于1pg NO3）0.3ml，加无硝酸盐的水4.7ml，用同一方法处理后的颜色比较，不得更深（0.000 006%）。 亚硝酸盐取本品10ml，置纳氏管中，加对氨基苯磺酰胺的稀盐酸溶液（1→100）lml与盐酸菜乙H肢溶液（0．l＋100）1ml，产生的粉红色，与标准亚硝酸盐溶液〔取亚硝酸钠0.750g（按干燥品计算），加水溶解，稀释至100ml，摇匀，精密量取1ml，加水稀释成100ml，摇匀，再精密量取1ml，加水稀释成50ml，摇匀，即得（每1ml相当于1μg NO2）]0.2ml，加无亚硝酸盐的水9.8ml，用同一方法处理后的颜色比较，不得更深（0.000 002%）。 氨取本品50ml，加碱性碘化汞钾试液2ml，放置15分钟；如显色，与氯化铵溶液（取氯化铵31.5mg，加无氨水适量使溶解并稀释成1000ml）1.5ml，加元氨水48ml与碱性碘化汞钾试液2ml制成的对照液比较，不得更深（0.000 03%）。 二氧化碳取本品25ml，置50ml具塞量筒中，加氢氧化钙试液25ml，密塞振摇，放置，小时内不得发生浑浊。 易氧化物取本品100ml，加稀硫酸10ml，煮沸后，加高锰酸钾滴定液（0.02mol/L）0.10ml，再煮沸10分钟，粉红色不得完全消失。
微生物限度检测方法验证操作规程(2015年版)
微生物限度检测方法验证操作规程 1 目的 确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。 2 依据 《中国药典》2015版。 3 范围 所有需进行微生物限度检测的产品。 4 责任 4.1验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。 4.2验证委员会负责验证/确认方案的审批，验证/确认结论的审核。 5 程序 5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完成后，填写《确认和验证方案审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后，方可按验证方案试验。 5.2 试验完成后及时编制验证报告，并填写《验证报告审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实施。 6 内容 6.1 概述 通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方案进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证 6.2.1 验证用菌株
铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104] 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003] 枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501] 黑曲霉[CMCC（F）98 003] 白色念珠菌[CMCC（F）98 001] 6.2.2 验证用菌液制备 6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养2～3天。取上述培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.3接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于20～25℃培养5～7天，加入含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的孢子悬液，备用。 6.2.3 供试液的制备 6.2.3.1 水溶性供试试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 6.2.3.2 水不溶性非油脂类供试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1﹪的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用一稀释液将
微生物限度检查法应用指导原则
微生物限度检查法应用指导原则 为更好应用微生物限度检查法（附录ⅪJ），特制定本指导原则。 微生物限度检查法可用于判断非规定灭菌制剂及原料、辅料是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料的微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。本指导原则将对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步的说明。 1.微生物限度检查过程中，如需要使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外，还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出（即无毒性），因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。 2.供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及细菌、霉菌及酵母菌计数方法应尽量选择微生物限度检查法中操作简便、快速的方法，且应避免损伤供试品中污染的微生物。对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。 3. 微生物限度检查法（附录ⅪJ）收载的离心沉淀法仅适用于制备细菌计数或控制菌（细菌）检查用的供试液，规定的500转/分钟、不超过3分钟只用于去除供试液中的沉淀物。采用该方法时，供试液中的样品颗粒大小、粘稠度及污染的微生物大小，转速等直接影响着样品中微生物的回收，易造成检验结果不能真实反映供试品的污染情况。因此，供试液制备时尽量避免使用该方法，更不宜采用高速离心沉降集菌。 4.对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适应性检查。由中国药品生物制品检定所研制及分发。 5. 进行验证试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验。此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，但最高稀释级供试液选择应根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则，如供试品应符合的微生物限度标准是1克细菌数不得过1000cfu，那么最高稀释级是1：10-3。
药品微生物限度检验方法标准操作规程
标准操作规程 目的：建立一个药品微生物限度检验标准操作规程。 范围：适用于本企业生产的所有品种，本企业所有洁净生产区域，QC微生物限度检查室，洁净工作室等。 责任者：QC主任、化验员。 规程： 本规程引至《中国药典》2000年版。 1. 概述：微生物限度检查系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。我公司QC设无菌操作室，用于微生物限度检查。无菌操作室的管理及使用制度见本文附录一。 2. 抽样：供试品应按批号随即抽样，一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍。抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应缺陷选用疑问的样品，但因机构损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需要再抽样检验。 3. 供试品的保存：供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。 4. 检查： . 使用设备：电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75％酒精棉球、紫外灯（365nm波长）。 . 检查的全过程应严格遵守无菌操作，严防再污染。使用设备、仪器、人员及无菌操作室常用的消毒、灭菌方法见本文附录二。除另有规定外，供试品制备成供试液后，均在均匀状态取样。制成供试液后，应该在60分钟内注皿操作完毕。 标准操作规程 . 培养：除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30－35℃，霉菌、酵母菌培养温
微生物限度检查办法验证方法
精心整理 微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 2.3. 4.0.22um 121营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL ）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG ）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min ，在3周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min ，在3周内使用。
4.4.2 试验菌的制备和稀释： 4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液： 4.4 4.4 4.4 4.4.2.2控制菌检查方法验证用菌液： 1ml 含菌10 3g单 45℃pH7.0 液。 3 4.4.4.2试验组： 4.4.4.2.1 平皿法：分1：20的供试液1ml和试验菌液（含菌50～100CFU）1ml，注入同一直径90mm的灭菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿。 4.4 4.4
4.4.4.4.1 平皿法：取1：20供试液1ml，注入直径90mm的灭菌平皿中，每种培养基平行制备2个平皿。 4.4 4.4.4.5稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心等特殊处理时，需增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 4.4 养48 培养72 稀释剂对照组回收率＝ 结果判定：在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的回收率应均不低于％。试 菌回收率低于70％，则应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法学验证。 4.4.4.11细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果：
001.纯化水微生物限度检查法操作规程
SOP/QC(09)001－01 纯化水微生物限度检查法操作规程 文件类别：标准操作规程 审批表 江西中兴汉方药业有限公司
1.目的 规范纯化水微生物检查的操作方法，确保药品检验的准确性。 2.适用范围 适用于纯化水的微生物检查。 3.责任人 QC：负责按此规程执行。 4.程序 4.1 概述 本规程是以营养琼脂培养基作为细菌培养基，采用平板表面涂布法测定纯化水菌落总数。其操作环境和全部过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染。 4.2 仪器与用具电热恒温培养箱（30～35℃）霉菌培养箱（23～28℃）超净工作台无菌双碟移液管0.45μm微孔滤膜过滤器抽滤泵 4.3 试药与试剂营养琼脂培养基玫瑰红钠培养基pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 4.4 纯化水的取样 4.4.1取样时，须先开启取样阀门，用工艺用水本身冲冼取样口，约冲水1升以上，而后以无菌具塞10ml试管取水，取水量约为试管高度的1/2～2/3。 4.4.2检测周期：见“工艺用水监测规程（SMP-ZL-016-）”规定。 4.4.3取样后的水样应立即检验。 4.5 检查方法量取9ml纯化水置盛有90ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的锥形瓶中混匀，作为供试液；量取供试液10 错误！未找到引用源。供试液置安装好的无菌抽滤装置，进行过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基平板及玫瑰红钠培养基平板上，盖好，倒置培养皿，分别将营养琼脂培养基平板及玫瑰红钠培养基平板置电热恒温培养箱（30～35℃）及霉菌培养箱（23～28℃）中培养。细菌培养3天后进行菌落计数，霉菌培养5天后进行菌落计数。计数结果即为每ml水中含细菌及霉菌的菌落数。 4.6 结果判定每1ml纯化水中的细菌数及霉菌数之和应不得过100个。 5 相关记录 6变更履历表
微生物限度检查方法验证方案
微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规性引用文件： 根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、 滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎 好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫 瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂 培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制 说明，用纯化水配制、分装后，在2小时，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭 菌15 min，在3周使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期的试剂，按照 相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、
2010版中国药典纯化水标准
纯化水質量要求 參照《中国药典》2010版二部标准p411页 【性状】本品为无色的澄清液体；无臭，无味。 【检查】酸碱度取本品10ml，加甲基红指示液2滴，不得显红色；另取10ml，加溴麝香草酚蓝指示液5滴，不得显蓝色。 【硝酸盐】取本品5ml置试管中，于冰浴中冷却，加10%氯化钾溶液0.4ml与0.1%二苯胺硫酸溶液0.1ml，摇匀，缓缓滴加硫酸5ml，摇匀，将试管于50℃水浴中放置15分钟，溶液产生的蓝色与标准硝酸盐溶液[取硝酸钾0.163g，加水溶解并稀释至100ml，摇匀，精密量取1ml，加水稀释成100ml，再精密量取10ml，加水稀释成100ml，摇匀，即得(每1ml相当于1μgNO3)]0.3ml,加无硝酸盐的水4.7ml,用同一方法处理后的颜色比较,不得更深(0.000006%)。 【亚硝酸盐】取本品10ml，置纳氏管中，加对氨基苯磺酰胺的稀盐酸溶液(1→100)1ml 与盐酸萘乙二胺溶液(0.1→100)1ml，产生的粉红色，与标准亚硝酸盐溶液[取亚硝酸钠 0.750g(按干燥品计算)，加水溶解，稀释至100ml，摇匀，精密量取1ml，加水稀释成100ml，摇匀，再精密量取1ml，加水稀释成50ml，摇匀，即得(每1ml相当于1μgNO2)]0.2ml，加无亚硝酸盐的水9.8ml，用同一方法处理后的颜色比较，不得更深(0.000002%)。 【氨】取本品50ml，加碱性碘化汞钾试液2ml，放置15分钟；如显色，与氯化铵溶液(取氯化铵31.5mg，加无氨水适量使溶解并稀释成1000ml)1.5ml，加无氨水48ml与碱性碘化汞钾试液2ml制成的对照液比较，不得更深(0.00003%)。 总有机碳不得过0.50mg/L (附录ⅧR) 。 【易氧化物】取本品100ml，加稀硫酸10ml，煮沸后，加高锰酸钾滴定液 (0.02mol/L)0.10ml，再煮沸10分钟，粉红色不得完全消失。 以上总有机碳和易氧化物两项可选做一项。 不挥发物取本品100ml，置105℃恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干，并在105℃干燥至恒重，遗留残渣不得过1mg。 【重金属】取本品100ml，加水19ml，蒸发至20ml，放冷，加醋酸盐缓冲液(pH3.5)2ml 与水适量使成25ml，加硫代乙酰胺试液2ml，摇匀，放置2分钟，与标准铅溶液1.0ml加水19ml用同一方法处理后的颜色比较，不得更深(0.00001%)。 【微生物限度】取本品，采用薄膜过滤法处理后，依法检查(附录ⅪJ)，细菌、霉菌和酵母菌总数每1ml不得过100个。 【另外要求】：電導率：<0.8US/CM；電阻率：>15MΩ.CM；NO指標: 合格。 2012-10-07
2010年版药典微生物限度检查法
附录Ⅺ J 微生物限度检查法 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。 微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。 供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。 除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃。 检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。 检验量 检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。 除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g用于阳性对照试验)。 检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。 一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。 供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。 除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。 1.液体供试品 取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1∶10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 2.固体、半固体或黏稠性供试品 取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1∶10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 3.需用特殊供试液制备方法的供试品 (1)非水溶性供试品 方法1取供试品5g(或5ml)，加至含溶化的(温度不超过45℃)5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1∶20的供试液。 方法2取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯(制法见附录ⅩⅢB 无菌检查法中供试品的无菌检查项下)和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1∶10的供试液。 (2)膜剂供试品 取供试品100cm2，剪碎，加100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(必要时可增加稀释液)，浸泡，振摇，作为1∶10的供试液。 (3)肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10g，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂)至100ml，置
微生物限度检查操作规程中国药典四部通则样本
—、范围：本标准规定了微生物限度的检查方法和操作要求；适用于检品 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、控制菌的检查。 二、 引用标准：《中国药典》( 通则1105-1106) 三、 目录1.微生物限度标准 2.设备.仪器及用具 3?消毒液、稀释剂.试液及培养基 4. 检查总则(通则1105:非无菌产品微生物限度检查：微生 物计数法，通则1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法) 5. 微生物计数法检查 6. 控制菌检查法 7. 实验技术 &附件 1. 微生物限度标准 非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准 *未做统一规定。 L1成品微生物限度标准
(1).” 一”为不得检出。 (2).目测霉变者以不合格论。 (3).”无”为标准依据或无相应规定。 1.2工艺用水微生物限度标准 1.3内包装材料微生物限度标准 说明：1?”一”为每100 cm2中不得检出。2.目测霉变者以不合格论。3.”无”为标准依据或无相应规定。 2.设施、仪器及用具
2.1、设施： 2丄1?微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台直及环境应定期进行监测。 2.12其它设备：高压蒸汽灭菌器；细菌培养箱（30?35?）;霉菌培养箱（25-280 ；电炉（或其它适宜的加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱（250~300匕）；电冰箱。生化试剂储存箱。 2.2仪器及器mi 2.2.1.菌落计数器；显微镜（1500X）;电子天平或药物天平（感量O.lg）; pH系列比色计。 222?玻璃器皿：锥形瓶（250?300ml,内装玻璃珠若干）.研钵（玻璃或陶瓷制,f 10?12cm）、培养皿（f 9cm）.量筒（100ml）.试管（18x 180mm）及塞、吸管（lml分度0.01, 10ml分度0.1）、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。 2.2.3新购的玻璃器皿的清洁：先用流水冲洗，浸泡于1%?2%盐酸（工业用）液中约2?6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗。用于化学分析的玻璃仪器，需用重洛酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2?3次，晾干备用。 2.3用过的玻璃器皿： 231未被病原微生物污染的器皿：可随时洗涤。用清水冲洗（或浸泡），除容量仪器外， 可用毛刷和肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净，晾干备 用。容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗 2~3 次。
微生物限度检查法验证方案模板
文件编号：SVP YF-0-01-00
验证文件
******微生物限度 检查法验证方案
********有限责任公司
1/11
验 证 文 件
目 录
1 2 3 4 5 6 7 8 9
适用范围 目的 概述 验证所需要的仪器设备及文件 可接受的限度范围标准 测试方法 异常情况处理 测试结果 结论
10 再验证周期 11 附表
2/11
验 证 文 件
1 适用范围 本验证方案适用于******微生物限度检查法的验证。 2 目的 建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方法的 完整性，保证检验结果的可靠性。 3 概述 3.1******处方中含有盐酸氨基葡萄糖以及常用辅料等成分，文献报道盐酸氨基葡 萄糖有抑菌活性。根据以上特点，按《中国药典》2010 年版附录Ⅺ J《微生物限度 检查法方法》的“供试品的制备”项下需用特殊方法制备供试液中（6）制备供试 液。“细菌，霉菌，酵母菌计数”项下检查法 2 薄膜过滤法进行细菌，霉菌及酵母 菌的计数方法验证，控制菌检查项下控制菌的检查法验证。 3.2 验证时间：************批平行三次试验。 4 验证所需要的仪器设备及文件 4.1 验证需用仪器设备 器具名称 电热恒温培养箱 多用生化培养箱 蒸汽灭菌器 规格型号 HG101-3 SP-80 ZDX-35B 检定日期 检定单位 有效期
4.2 验证所需要的文件及存放地方 资料名称 《HG101-3 电热恒温培养箱操作维护保养 SOP》 《SP-80 型生化培养箱操作维护保养 SOP》 《ZDX-35B 蒸汽灭菌器操作维护保养 SOP》 《微生物限度检查法 SOP》 5 可接受的限度范围标准 5.1******微生物限度检查质量标准 项目 细菌总数 霉菌、酵母菌 标准规定 ≤1000 个/g ≤100 个/g 存放地点
2015年版微生物限度检验操作规程
2015 版微生物限度检验操作规程 目的建立微生物限度检查操作规程，规范操作，保证结果的准确性。范围成品、辅料、内包装袋及纯化水的检验。 内容概述：本检验操作规程依据中国药典2015 年版四部《通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。 微生物计数法 一、计数方法 1．微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。 3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查供试品微生物计数中所使用的 培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。 4、菌种及菌液的制备试验用菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 袋)，并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验见表 1。 菌液制备按表 1 规定培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含％(ml/ml )聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含%(ml/ml )聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉抱子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8 C,可在24小时内使用。黑曲霉抱子悬液可保存在2-8 C,在验证过的贮存期内使用。 表 1 试验菌液的制备和使用 阴性对照为确认试验条件是否符合要求,应进行对照试验,阴性对照试验应无菌生长。培养基适用 性检查按照表1规定,接种不大于100cfu 的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板,置规定的条件下培养。每一试验菌株平行制备 2 管或 2 个平皿。同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在范围内,且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。被检 液体培养基管与对照培养基管比较,试验菌应生长良好。 5、计数方法适用性检查
微生物限度检查办法验证方法
微生物限度检查方法验证方案 1. 目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2. 范围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3. 规范性引用文件： 根据《中国药典》2010 年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4. 验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径 0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3 天内使用。 4.4.1.2 试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4- 甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在 2 小时内，放于湿热灭 菌器中，在121℃，灭菌15 min，在3 周内使用。 4.4.1.3 试验用稀释剂/ 缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法， 配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min，在3
2015年版中国药典微生物限度检查方法验证的方案.doc
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 7.1试验菌株 7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审
1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。 3.2验证方案的培训 验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。 3.3验证方案实施过程中的变更和偏差 验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。 3.4 验证工作小组成员表 4. 验证进度计划表 本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月。 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 5.1.主要检验仪器设备确认表
微生物限度检查标准操作规程
微生物限度检查标准操作规程 ? 1. 目的：建立微生物限度检查的基本操作，为微生物检查人员提供正确的操作规程。 ? 2. 依据：《中华人民共和国药典》2010年版二部。中华人民共和国卫生部《药品卫 生检验方法》 ? 3. 范围：本标准适用于QC化验室的微生物限度检查。 ? 4. 职责：QC微生物检验员对本标准的实施负责。 ? 5. 程序： ? 5.1. 定义：微生物限度检查法：微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、 辅料受微生物污染程度的方法。 ? 5.2. 实验用具： ?电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试 管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75%酒精棉球、紫外灯（365nm波长）。 ? 5.3. 培养基： ? 5.3.1. 营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、麦康凯琼脂培养 基、枸橼酸盐培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基、蛋白胨水培养基、4-甲基伞形酮 葡萄糖苷酸（MUG）培养基。 ? 5.3.2. 培养基的管理、配置应符合检定菌、培养基管理规程、培养基配置规程。 ? 5.4. 试液：甲基红试液、а-奈酚乙醇试液、40%氢氧化钾溶液、靛基质试液。 ? 5.5. 稀释剂：0.9%无菌氯化钠溶液、PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。 ? 5.6. 供试品溶液的制备：取供试品（供试品如为固体，置研钵中研磨成细粉）放入 试管中，加入适量的稀释剂制成1：10浓度的供试品溶液。 ? 5.7. 对照用菌液：控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验，对照菌株为大肠杆菌 [CMCC（B）44102]。 ? 5.8. 检查法： ?除另有规定外，细菌的培养温度为30-35℃，霉菌的培养温度为23-28℃，控制菌的 培养温度为35-37℃。 ? 5.8.1. 细菌、霉菌计数： ? 5.8.1.1. 平皿法 ?采用平皿法进行菌数测定时，应取适宜的连续2～3个稀释级的供试液。 ?取供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶 化的营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混 匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板。 ?阴性对照试验取试验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置 培养。每种计数用的培养基各制备2个平板，平均不得有菌生长。 ? 5.8.1.2. 培养和计数除另有规定外，细菌培养48小时，逐日点计菌落数，一般以 48小时的菌落数报告；霉菌、酵母菌培养72小时，逐日点计菌落数，一般以72小时的菌落数报告；必要时，可适当延长培养时间至5~7天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报 告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。 一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培
纯化水系统的微生物控制方法研究
纯化水系统的微生物控制方法研究 摘要：2010 版GMP 要求纯化水的制备、贮存和分配应当能够防止微生物的滋生。企业应结合纯化水系统特点及日常监测微生物限度，制定微生物控制方法及微生 物的警戒、纠偏限度，定期进行趋势分析，有效控制纯化水系统的微生物污染。 关键词：纯化水；微生物控制 【中图分类号】 R2 【文献标号】 A 【文章编号】 2095-7165（2015）17- 0400-01 1 法规对纯化水微生物的要求 《美国药典》要求纯化水系统应经常消毒并定期检查微生物，建议纯化水的 微生物限量为100CFU/ml；《欧洲药典》规定纯化水微生物限度为好氧菌总数不 高于100CFU/ml；《中国药典》规定纯化水微生物限度为细菌、霉菌、酵母菌总 数不超过100CFU/ml；可见，《中国药典》中纯化水微生物控制水平与《美国药典》、《欧洲药典》基本保持一致。同时，2010 版GMP 对制药用水系统的设计、安装及纯化水的制备、贮存和分配等也有了较明确的规定。 2 纯化水系统设计、安装过程中微生物控制方法 2.1 管道内表面光滑度 管道内表面越粗糙，越易给微生物的繁殖提供有利条件，容易形成生物膜， 导致水系统中微生物不合格。同时，表面越粗糙对设备的清洁会造成影响，故应 严格控制设备及管道表面的粗糙度。一般要求管路内表面光洁度Ra＜0.6um。 2.2 管道坡度 纯化水循环管线无坡度或坡度不够，管道中的残留水将会成为微生物繁殖的“温床”，导致微生物污染超标，故应按照工程上要求不低于0.5的坡度来进行水 平管网的设计安装。一般要求管道的设计坡度在0.5～2，以便排净全部凝结水。 2.3 回水流速 最常见的做法是稳定循环水回水流速大于1m/s，使整个循环系统保持湍流状态，使湍流区雷诺数大于2100，可有效防止循环管道内形成生物膜。目前，部分 企业在设计循环管线时，采用管线直径逐渐减小的方式，应充分考虑循环系统的 各个部位的流速均应符合要求。用水高峰期回水流速短时间内低于1m/s 可被接受，但不能长时间低于该水平。 2.4“3D”死角标准 3D 即从主管外壁到支管阀门密封垫的长度L≤3 倍支管直径D。从清洁及消毒 验证的角度能有效证明“3D 死角标准”的合理性，消毒验证表明“小于3D”时支路很快到达消毒温度，“大于3D”时，则在流速过低或过高时支路均达不到消毒温度。 2.5 空气呼吸器 应根据纯化水储罐体积合理配备一个或多个呼吸器，主要目的是减少来自空 气中的污染，空气呼吸器内一般安装疏水性聚四氟乙烯滤芯，孔径在0.1～0.2um，应定期对滤芯进行清洁、灭菌，并进行完整性检测，以确保符合使用要求。 2.6 保证正压 系统在设计时应充分考虑用水高峰的用量，限制单个用水点的最大用量，防 止取样点或使用点发生空气进入水系统，带来微生物污染的风险。 3、纯化水储存及循环系统消毒方法 3.1 巴氏消毒 纯化水系统的巴氏消毒分预处理段、反渗透膜及循环系统巴氏消毒三部分，
微生物限度方法学验证
微生物限度检查 方法学验证 一、检验方法 依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。 二、菌种、培养基及稀释液 表2培养基
表3对照用培养基 表4试剂 稀释液： （1）pH6.8缓冲液 取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。 （2）0.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。 （3）0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液 取聚山梨酯80 0.5ml，用0.9％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。 （4）靛基质试液
取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。 三、菌液的制备 1细菌、霉菌、酵母菌 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入 5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。 2控制菌 接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu 的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。 四、验证内容 1、计数方法验证 将制备好的菌悬液用0.9%无菌氯化钠溶液以每10倍体积分别稀释成一系列浓度菌悬液，利用血球计数板计数，确定具体菌悬液浓度，取接近于10cfu-100cfu的稀释浓度，选取各项试验项下的规定浓度进行实验。稀释及观察均应在阳性室内完成。 经过验证当原液稀释至10-6时，菌液浓度接近100cfu/ml。 2、适用性检查 2.1细菌、霉菌、酵母菌 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml(内含菌约50～100cfu)，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉1ml(内含菌约50～100cfu)，注入无菌平皿中（取用黑曲霉时应注意自身安全），立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72
微生物限度检验标准操作规程
1 目的 规范微生物限度检验操作，确保检验结果准确、可靠。 2 依据 《中国药典》2010版。 3 范围 本标准适用于微生物限度检验。 4 责任 中心化验室负责人：对本规程的实施负责。 中心化验室检验人员：严格按照本规程执行检验操作。 5 程序 5.1 执行标准：《中国药典》2010版。 5.2 抽样：照《取样标准操作规程》进行。 6 细菌、霉菌及酵母菌计数 计数方法包括平皿法和薄膜过滤法。检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。 6.1 设备、仪器及用具 6.1.1 设备 微生物限度检测室室、净化工作台、生化培养箱（30-350C）、生化培养箱（23-280C）、电热恒温水浴锅、烘箱、电冰箱、灭菌柜、紫外灯等。 6.1.2 仪器及器皿 显微镜、托盘天平、锥形瓶、研钵、培养皿、量筒、试管及塞、吸管、薄膜过滤器等。 6.1.3 用具 大、小橡皮乳头，洁净工作服、口罩、医用手套、接种环、酒精灯、酒精棉球、灭菌剪刀、灭菌镊子、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、薄膜过滤膜等。 6.2 试液 6.2.1 消毒液 A．0.1% 新洁尔灭溶液：供手消毒、擦拭操作台面用。
B．75%乙醇溶液 6.2.2 稀释液、试剂及配制 A．PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液：取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.3g、蛋白胨1.0g，加纯化水1000ml，微温溶解，滤清，分装，1210C灭菌15分钟。 B．聚山梨酯80 C．吐温80 D．单硬脂酸甘油酯 6.3 培养基 营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基 6.4 操作方法 6.4.1 试验前准备 6.4.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、试管、吸管（1ml、10ml）、量筒、稀释剂等移至传递窗内。每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。 6.4.1.2 开启微生物检测室紫外灯和空调净化系统，并使其工作不低于30min。 6.4.1.3 操作人员进入一更，用洗手液或肥皂洗手，烘干。进入二更，用0.1% 新洁尔灭溶液洗手，穿戴洁净无菌服、口罩、手套。 6.4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。 6.4.2 供试液的制备 供试液的制备若需用水浴加温时，温度不宜超过450C，时间不得超过30分钟。除另有规定外，常用的供试液制备方法如下： 6.4.2.1 液体供试品 取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1:10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 6.4.2.2 固体、半固体或粘稠性供试品 取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用适宜的方法，混匀，作为1:10的供试液。必要时加入适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品