免疫细胞化学和免疫荧光

免疫细胞化学和免疫荧光

一般步骤：

1. 将盖玻片表面用PEI（聚亚乙基亚胺）或者poly-L-赖氨酸室温处理1h。

2. 盖玻片用无菌水清洗3次，每次5分钟。

3. 盖玻片完全干燥后置于UV紫外下杀菌4h。

4. 将细胞培养于处理的盖玻片上，或者准备细胞离心涂片。

5. 用PBS简单清洗。

6. 洗脱液我们推荐使用含0.1%Tween20的PBS溶液。

固定

细胞可以使用以下两个方法之一固定：

1. 用置于-20°冷冻的100%的甲醇室温处理孵育细胞5分钟。

2. 使用4%的多聚甲醛.PBS固定液（PH:7.40）室温固定10分钟。

细胞用预冷的PBS清洗3次。

抗原修复（可选步骤）

在细胞受到热抗原修复后，一些抗体会更有效。一抗使用时可以查看产品说明书看是否需要抗原修复这一步骤。

1. 预热抗原修复液（100 mM Tris, 5% (w/v) urea, pH 9.5)）至95°C：可以将盛有抗原修

复液的染色缸放于95°C的水浴锅中。

2. 使用一副宽头的镊子，将盖玻片小心的置于盛有抗原修复液的染色缸中，使细胞面朝上。

3. 95°C加热盖玻片10分钟。

4. 将盖玻片从抗原修复液中取出，细胞面朝上置于盛有PBS的6孔板中。

5. 用PBS清洗细胞3次，每次5分钟。

透化（Permeabilization）

若目标蛋白位于细胞内，那么通透细胞就显得尤其的重要。

丙醇固定的样品不需要通透。

1. 将样品置于含0.1-0.25% Triton X-100或者100 μM Digitonin or 0.5% Saponin的PBS

溶液中10分钟。Triton X-100是目前广泛使用的能够提高抗体的渗透能力的去垢剂。

然而，这并不适用于位于膜上的抗原，因为它会损坏膜。

对于每一种感兴趣的蛋白都要选择合适的Triton X-100的浓度。

2. 用PBS清洗细胞3次，每次5分钟。

封闭和免疫染色

1. 用含1%BSA的PBST、含2

2.52mg/ml甘氨酸的PBST（PBS+ 0.1% Tween 20）封闭细胞30分钟，阻断非特异性结合的抗体。也可以选择1%明胶或者10%的血清（血清为生产二抗时的免疫物种的血清）封闭，具体可以查看相关抗体说明书中的推荐的封闭方法。

2. 一抗孵育：用含1%BSA的PBST稀释抗体，孵育时置于湿润的环境中室温处理1h或者4°C过夜。

3. 去除一抗溶液，用PBS清洗3次，每次5分钟。

4. 二抗孵育：用含1%BSA的PBST稀释二抗，室温避光1h。

5. 去除二抗溶液，用PBS避光清洗3次，每次5分钟。

多重免疫染色（可选步骤）

为了检测在同一样品中两种或两种以上不同抗原的分布情况，可以使用多重免疫荧光染色的方法。多重免疫荧光染色的方法可以通过同时染色（两种抗体混合）或者依次分别染色来实现（一个染色后染另一个）。

首先要确保你有不同物种的一抗和相对应的二抗。例如，兔抗对应抗原A，鼠抗对应抗原B。或者，你可以使用直接偶联不同荧光素的一抗。

●同时孵育：

1. 用含1%BSA的PBST封闭细胞30分钟，阻断非特异性结合的抗体。也可以选择1%明胶或者10%的血清（血清为生产二抗时的免疫物种的血清）封闭。

2. 一抗孵育：将两种一抗（如两种目标抗原都是人类蛋白，兔源一抗对应人的抗原-1，鼠源一抗对应人的抗原-2）混合于含1%BSA的PBST中，孵育时置于湿润的环境中室温处理1h或者4°C过夜。

3. 去除混合的一抗溶液，用PBS清洗3次，每次5分钟。

4. 二抗孵育：将两种来源于不同物种且带不同荧光素的二抗（例如：Texas-红偶联的对应兔源的一抗，FITC偶联的对应鼠源的一抗）混合于含1%BSA的PBST中，室温避光1h。

5. 去除混合的二抗溶液，用PBS避光清洗3次，每次5分钟。

●分步孵育：

1. 第一次封闭：细胞用封闭液室温处理30分钟，阻断非特异性结合的抗体。封闭液可用

10%的血清（血清为生产二抗时的免疫物种的血清），或者1%的明胶，也可用1%的BSA。

2. 第一种一抗孵育：用含1%BSA或者含1%的血清的PBST稀释抗体，孵育时置于湿润

的环境中室温处理1h或者4°C过夜。抗体孵育的条件取决于抗体的浓度和抗原在细胞中的位置。

3. 去除第一种一抗溶液，用PBS清洗3次，每次5分钟。

4. 第一种二抗孵育：用含1%BSA的PBST稀释二抗（用荧光素-1标记的），室温避光1h。

5. 去除第一种二抗溶液，用PBS避光清洗3次，每次5分钟。

6. 第二次封闭：细胞用封闭液室温处理30分钟，阻断非特异结合的抗体。封闭液可用10%

的血清（血清为生产二抗时的免疫物种的血清），或者1%的明胶，也可用1%的BSA。

7. 第二种一抗孵育：用含1%BSA或者含1%的血清的PBST稀释抗体，孵育时置于湿润

的环境中室温避光处理1h或者4°C过夜。抗体孵育的条件取决于抗体的浓度和抗原的位置。

8. 去除第二种一抗溶液，用PBS避光清洗3次，每次5分钟。

9. 第二种二抗孵育：用含1%BSA的PBST稀释二抗（用荧光素-2标记的），室温避光1h。

10. 去除第二种二抗溶液，用PBS避光清洗3次，每次5分钟。

如果需要检测两种以上的抗原，其余的抗原均可继续使用1-5步骤来进行。

对比染色

1. 染核：用含0.1-1ug/ml的Hoechst或者DAPI处理细胞1分钟。

2. 用PBS清洗。

封片

1. 滴加一滴封片用的介质于盖玻片上。

2. 玻片用指甲油封口，以防止干燥和盖玻片在显微镜下的移动。

3. 储存：-20°C或者4°C避光保存。