Resveratrol对人外周血T细胞活化的影响及机制研究

Resveratrol对人外周血T细胞活化的影响及机制研究摘要】目的本研究旨在探讨Resveratrol对人T 淋巴细胞活化的影响及其分子机制。

方法在体外使用Resveratrol处理人外周血T 细胞，并给予抗人CD3和抗CD28抗体活化，观察其对T细胞增殖、细胞因子分泌及细胞凋亡的影响。

同时进一步通过免疫印迹和免疫共沉淀的方法探讨Resveratrol对T细胞活化影响的分子机制。

结果我们现有的实验提示Resveratrol可以明显抑制人外周血T 淋巴细胞的增殖，且能抑制IL-2、IL-4、IL-5、IFNγ等细胞因子的分泌；但并不影响T细胞的凋亡。

进一步研究表明Resveratrol通过提高Sirt1的表达和增强其对C-jun的脱乙酰化来发挥作用。

结论此研究提示resveratrol可能在T细胞引起的炎症如自身免疫性疾病治疗中发挥重要作用。

【关键词】 Resveratrol T 细胞活化脱乙酰化 C-jun Sirt1【中图分类号】R392 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）02-0152-03The Roles and Molecular Mechanisms of Resveratrol on Human T cell ActivationXIA Fei, ZOU Ting, ZHANG Jin-ping(Institutes of Biology and Medical Sciences, Soochow University, Suzhou, 215123 Jiangsu Province, China)【Abstract】 Object: We aim to explore the function and molecular mechanismsof resveratrol on human T cell activation. Method: The PBMC were obtained from health people, and purified by Ficoll-hypaque, the T cell were activated by anti-CD3and anti-CD28 antibodies, the proliferation was evaluated by CFSE cell division assay and Brdu cell proliferation assay. The levels of cytokines in activated T cells culture supernatant were measured by ELISA. The expression of Sirt1 and alteration of acetylation of C-Jun were evaluated by western-blot. Result:We found that Resveratrol significantly inhibited the activation and cytokines production of T cell in hunman PBMC. The expression of Sirt1 was up-regulated and acetylation of C-Jun was decreased in resveratrol-treated T cells. Conclusion: Resveratrol inhibited the T cell activation by up-regulating the expression of Sirt1 and enhancing the deacetylase activity of Sirt1 on C-Jun in T cells.【Key Words】 Resveratrol Sirt1 T cell activation deacetylase C-JunResveratrol是一种天然的多酚化合物，富含在桑椹、花生、葡萄等植物中[1, 2]。

自从人们发现饮用红葡萄酒的人能抵抗冠心病以来，Resveratrol得到了科学家的广泛关注[3]。

很多文献报道Resveratrol在炎症、氧化、癌症以及衰老中发挥重要作用[4-8]。

Subhash C.Gautam和同事体外实验研究发现Resveratrol能抑制ConA、IL-2以及异体抗原对脾脏细胞的增殖[9]。

五年后，Agrewala等人研究发现，Resveratrol 可以抑制T细胞、B细胞、巨噬细胞等增殖、抗体产生、和淋巴因子的产生，且主要依赖于下调CD28、CD80表达，上调CTLA4的表达[10]。

但Chul-Woo kim等研究发现Resveratrol抑制CD4+CD25+Treg细胞分泌TGFβ,增强CD8+T细胞分泌IFNγ，从而引起免疫激活[11]。

由此可见对于Resveratrol对T细胞的作用及作用机制还存在着争论。

在人的T细胞中的作用还未见报道。

事实上，Resveratrol在其它细胞中靶蛋白也一直是人们争论的焦点。

很早之前就有报道认为Sirt1是Resveratrol的直接靶蛋白，至少是Resveratrol的下游信号分子[12,13]。

我们之前的研究表明Sirt1能维持外周T细胞的免疫耐受，敲除Sirt1后能引起T细胞活化的增强和自发的自身免疫性疾病[14]。

本研究中我们使用Resveratrol在体外研究其对人T细胞活化的影响及机制进行研究。

发现Resveratrol可以抑制人的CD4+细胞的活化，且抑制人的CD4+T细胞的细胞因子如IL-2、IFNγ、IL-4、IL-5等的产生。

进一步研究发现Resveratrol处理的T细胞其Sirt1表达增强，且其对C-Jun的脱乙酰化活性增强。

由此可见Resveratrol能通过增强Sirt1的表达和增强其脱乙酰化活性而抑制C-Jun在T细胞活化中的作用，从而抑制人的CD4+T细胞的活化。

1 材料和方法1.1 外周人血和主要试剂健康人外周血由苏州市中心血站提供的经体检检查为各项指标正常的献血人员的外周血细胞成分血。

Resveratrol购于Sigma 公司（R5010）。

CD4+T细胞磁珠分选试剂盒购于德国Miltenyi公司。

CFSE细胞增殖试剂盒购于Molecular Probes 公司。

BrdU细胞增殖试剂盒购于Roche 公司。

细胞因子检测试剂盒购自eBiosciences。

Anti-human CD3抗体（OKT3）、anti-human CD28抗体（CD28.2）和Anti-Acetylated lysine抗体（15G10）购自Biolegend公司。

Anti-Sirt1抗体（D739）、anti-C-Jun抗体（60A8）购自Cell signaling公司。

Ficoll-hypaque淋巴细胞分离液购自Sigma公司。

1.2 方法1.2.1 人外周血CD4+T细胞的分离和纯化将新鲜采集的外周血，去除血浆后用三倍体积的无菌PBS稀释，小心加到三分子一体积的Ficoll-hypaque上，2500rpm室温离心15分钟。

离心结束后取淋巴细胞层，用PBS洗两次。

按照Miltenyi公司纯化人CD4+T细胞的说明书操作步骤，分离纯化人CD4+T细胞。

将分离的淋巴细胞与biotin标记的抗体在冰上孵育15分钟后，用PBS洗涤后再和streptavidin标记的microbeads共孵育15分钟，PBS洗涤后分选。

用FACS检测其纯度（大于95%），用作以后的实验。

1.2.2 CFSE标记将纯化好的CD4+T细胞，用PBS稀释到适当浓度后，加入预先用DMSO溶解的CFSE（0.05μM），37℃孵育15分钟后，加入一毫升的纯胎牛血清，继续37℃孵育30分钟，用PBS清洗两次。

调整T细胞浓度至5×106/ml，用作T细胞活化。

1.2.3 T淋巴细胞的活化和检测将纯化好的细胞（部分用CFSE标记），加入到预先用抗人的CD3抗体（5μg/ml）包被的96孔板中，细胞浓度用含10%FCS的RPMI1640培养基调整到5×106/ml。

并同时加入抗人CD28抗体（2.5μg/ml）。

部分孔中加入不同浓度的Resveratrol（0～50μM）。

活化48小时后收集培养上清，用作检测上清中细胞因子浓度。

培养72小时后加入Brdu，继续培养24小时后，收集细胞，一部分细胞进行固定，并用抗Brdu抗体检测，评价T细胞增殖。

一部分CFSE标记的细胞，用FACS检测其细胞分裂情况。

1.2.4 细胞因子检测根据eBiosciences细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IFNg试剂盒说明书，用双夹心法检测上清中各种细胞因子的浓度。

1.2.5 细胞凋亡的检测收集活化及用Resveratrol处理培养48小时后的细胞，用PBS洗涤后，用annexinV染色15分钟、加入400μl AnnexinV染色液直接用流式细胞仪检测。

1.2.6 免疫共沉淀和Western-blot 收集纯化的人CD4+T细胞、用抗CD3、CD28抗体活化48小时的CD4+T细胞以及resveratrol处理48小时的人的CD4+T细胞。

用RIPA细胞裂解液裂解细胞，加入上样缓冲液。

部分细胞裂解液中加入抗C-Jun 的抗体孵育1小时后，洗涤，加入ProteinA微球，在4℃旋转过夜，离心洗涤，加入上样缓冲液。

混匀后煮沸10分钟。

上样，经SDS-page电泳、转膜、抗体杂交、ECL显像，观察Resveratrol处理后Sirt1表达，C-Jun的乙酰化状态改变等。

2 结果2.1 Resveratrol抑制人CD4+T细胞活化用抗人CD3、CD28抗体活化纯化的人CD4+T细胞时，我们发现经Resveratrol处理的T细胞，其CFSE荧光强度呈现显著的分裂减少，峰右移，说明T细胞分裂减少（图1A）。

Brdu增殖实验亦同样显示加入Resveratrol后，T细胞摄取的Brdu 减少（图1B），同样提示T细胞增殖减弱。

为探讨resveratrol是否影响了CD4+T细胞的凋亡，我们将纯化的CD4+T细胞用同样的方法进行活化，48小时后用AnnexinV检测，发现Resveratrol处理组和正常对照组凋亡百分比有显著差异（图2）。

总结以上结果，我们不难得出结论：Resveratrol抑制了人外周CD4+T细胞的增殖，同时影响CD4+T细胞的凋亡。

图1 Resveratrol抑制人外周CD4+T细胞增殖图2 Resveratrol促进了人外周CD4+T细胞凋亡2.2 Resveratrol抑制CD4+T细胞细胞因子产生为进一步观察Resveratrol是否抑制CD4+T细胞的细胞因子的产生，收集活化48小时的T细胞上清，经ELISA检测发现，Resveratrol处理组细胞上清中，不管是IL-2、IL-4、还是IFNγ均出现显著减少（图3）。