乳腺癌细胞培养
人乳腺癌细胞MDA-MB-231三维培养模型的构建
人乳腺癌细胞MDA-MB-231三维培养模型的构建彭雪梅;刘永文;张海燕【期刊名称】《山西大同大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(034)004【摘要】本研究旨在摸索一种体外构建人乳腺癌细胞MDA-MB-231三维(3D)培养的新方法,以期建立一种能够模拟体内肿瘤细胞真实形态的理想模型.利用该培养模型比较分析MDA-MB-231与正常乳腺上皮细胞MCF-10A 3D形态发生过程中极性形成的差异,主要是采用3D腺泡免疫荧光染色技术对顶部极性标记GM130和底部极性标记Laminin-5的定位进行比较研究,结果发现在3D培养10 d,MDA-MB-231形成了一种近似体内的球形结构,confocol层切MDA-MB-231球体的赤道轴发现,相对于MCF-10A形态发生形成的极性空腔腺泡,MDA-MB-231形成的是一种极性紊乱的实心球结构,其顶部极性标记GM130呈无规则分布、底部极性标记Laminin-5向球体中心内渗,这些结果与体内乳腺癌细胞去极性的特征相吻合,表明该3D培养模型可为深入阐明乳腺癌细胞MDA-MB-231恶化转移及抗癌药物作用机制等研究提供可靠的实验模型.【总页数】5页(P34-38)【作者】彭雪梅;刘永文;张海燕【作者单位】山西大同大学医学院,山西大同037009;山西大同大学化学与环境工程学院,山西大同037009;山西大同大学医学院,山西大同037009【正文语种】中文【中图分类】R73-35+1【相关文献】1.重组质粒pDNR-Dual-Rab25的构建及其在人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中的表达 [J], 吴非;张海添;陆云飞2.稳定表达HMGA2的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231构建 [J], 刘娇娇;张慧变;于林3.心房利钠肽对人乳腺癌细胞MDA-MB-231周期分布的影响 [J], 张弛;陆俊铭;周炳刚;曹相玫4.雷公藤红素对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的抑制作用研究 [J], 史晓娜;徐霞;谢闺娥5.抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸对人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移能力的影响 [J], 徐凯;金延玲;刘伟;罗晶;武雯程;李敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人乳腺癌细胞;MCF7贴壁培养
北京索莱宝科技有限公司
人乳腺癌细胞；MCF7贴壁培养
细胞名称：人乳腺癌细胞；MCF7
形态特性：上皮细胞
生长特性：贴壁生长
培养条件：高糖DMEM，10%FBS
传代方法：1:3传代
冻存条件：细胞冻存液
特征特性：MCF-7细胞保留了多个分化了的乳腺上皮的特性，包括：能通过胞质雌激素受体加工雌二醇并能形成圆形复合物（domes）。
该细胞含有Tx-4癌基因。
肿瘤坏死因子α（TNF alpha）可以抑制MCF-7细胞的生长。
抗雌激素处理细胞能调变IGFBP’S的分泌。
细胞处理方法：
1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超
净台中操作。
2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%
的CO2的温箱中继续培养。
细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。
3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞
完全脱壁后加培养基吹打混匀，分瓶培养。
注意：
我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。
第1页，共1页。
MAD-MB-231细胞培养
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
人乳腺癌MDA-MB-231细胞在含有10%太牛血清的RPMI-1640培养液中，于37℃
、5%CO2培养箱中常规培养，用含0.02%EDTA的胰酶消化传代。
实验分组如下：
对照组：细胞中加入含有0.1%DMSO培养液
实验组：细胞用不同浓度芹菜素（20、40、80、160µmol/L及半数IC5038.1µmol/L）处理。
1.2.2芹菜素对MDA-MB-231细胞增殖的影响
1.取处于对数期生长期的MDA-MB-231细胞常规消化，用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基配置成5.0×104个/mL细胞悬液。
2.每孔接种100℃µL细胞悬液，每浓度设6个平行样，在37、5%CO2培养箱中培养过夜。
3.吸出培养液，每孔加入含有0、20、4、80、160µmol/L的芹菜素RPMI 1640培养液200µL，在37、5%培养箱个、分别培养24h，48h、72h后加入MTT（5g L-1）20µL，继续培养4H 后吸出上清，每孔加入DMSO150微升，震荡溶解10分，待结晶完全溶解后，在酶联免疫测定仪上选择波长570nm处，以试剂对照组调零，测定各孔吸收值OD
4.细胞存活率=实验组OD/对照组OD×100%
生长抑制率=（1-实验组OD/对照组OD）×100%
IC50值用Logit法计算：
IgIC50=xm*I（p-pm-pn）/4)，设xm=ig最大剂量，I=IG(最大剂量/相邻剂量)，P：阳性反应率之和，pm：最大阳性反应率，pn:最小阳性反应率。
1.2.3光镜形态学观察
1.。
细胞侵袭转移实验报告
细胞侵袭转移实验报告细胞侵袭转移是癌症进展和转移的重要特征之一。
了解细胞的侵袭转移机制对于癌症预防和治疗具有重要意义。
本实验旨在研究细胞的侵袭转移能力，并探究其相关机制。
实验过程如下：1. 细胞培养与处理：选取一种具有侵袭能力的癌细胞株，如乳腺癌细胞MCF-7。
将细胞培养在含有适当营养和生长因子的培养基中，经过传代培养至适当细胞数目。
2. Transwell侵袭实验：将含有细胞的培养基加入到上游腔室中，下游腔室中加入含有化膜毛细孔的过滤膜，如Matrigel。
使细胞逐渐通过过滤膜向下游腔室侵袭。
培养一定时间后，取出过滤膜并使用染色剂染色，以观察和计数通过膜孔的细胞数量。
3. Western blot分析：用Western blot方法检测有关侵袭转移的分子标志物，如转录因子Snail和转录因子Slug、E-cadherin和N-cadherin等。
提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE电泳分离，转移至聚乙烯二醇膜上，用特异性抗体与目标蛋白结合。
通过免疫反应，使用化学发光显色剂检测目标蛋白的表达水平。
4. Real-time PCR分析：通过Real-time PCR技术检测相关基因的mRNA水平，包括Snail、Slug、E-cadherin和N-cadherin等。
提取总RNA，逆转录为cDNA 后，用特异性引物进行PCR扩增。
通过观察PCR曲线和计算Ct值，比较各样本基因表达水平的差异。
实验结果如下：1. Transwell侵袭实验表明MCF-7细胞具有较强的侵袭能力。
染色显示通过过滤膜的细胞数量较多。
2. Western blot结果显示Snail、Slug和N-cadherin的蛋白表达水平较高，而E-cadherin的蛋白表达水平较低。
这表明细胞侵袭转移相关的转录因子和黏附分子表达异常。
3. Real-time PCR结果进一步证实了上述结果，Snail、Slug和N-cadherin的mRNA水平较高，而E-cadherin的mRNA水平较低。
无血清培养富集乳腺癌干细胞的初步研究
（ １ ． 贵 阳医学院 检验学院 ， 贵州 贵阳 ５ ５ ０ ０ ０ ４； ２ ．Ｃ ａ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｍ ｅＭｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｒ ｏ ｕ ｅ ｎ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙｉ ｎ Ｆ ｒ ａ ｎ ｃ ｅ ， Ｒ ｏ ｕ ｅ ｎ Ｆ－７ ６ １ ８ ３ ， Ｆ ｒ ａ ｎ ｃ ｅ ５ ５ ０ ０ ０ ４； ５ ５ ０ ０ ０ ４） ３ ．Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｍ ｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｉ ｎ Ｆ ｒ ａ ｎ ｃ ｅ ， Ｐ ａ ｉ ｒ ｓ Ｆ一７ ５ ０ １ ０， Ｆ ｒ ａ ｎ ｌ ｅ ； ４ ． 贵阳医学院 组织工程与干细胞研究 中心 ，贵州 贵阳 ５ ．贵阳医学院 免疫学教研ｔ ｏ ｆ Ｂｒ ｅ ａ ｓ ｔ Ｃａ ｎｃ ｅ ｒ Ｓｔ ｅ ｍ Ｃｅ ｌ ｌ ｓ ｉ ｎ Ｓｅ ｒ ｕ ｍ． ｆ ｒ ｅ ｅ Ｍｅ ｄｉ ｕｍ
Ｌ Ｉ ＡＮ Ｆ ａ ｎ ｇ ，Ｇ Ｅ Ｚ ｈ ａ ｎ ｇ ｗｅ ｎ ，Ｌ Ｉ Ｈｏ ｎ ｇ ，Ｌ Ｕ Ｈｅ ，Ｌ Ｉ Ｕ Ｊ ｉ ｅ ｌ ｉ ｎ ，
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［ Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ： Ｔ ｏ ｅ ｘ ｐ ｌ ｏ ｒ ｅ ｔ ｈ ｅ ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ｆ ｏ ｒ ｇ ａ ｔ ｈ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ ｂ ｒ ｅ ａ ｓ ｔ ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｔ ｏ ｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎ ａ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ
MCF-7ADR培养1
1、MCF-7 是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可， 10－15％的小牛血清就能长得很好。
一般两到三天传一代。
传代也很常规。
吸出培养基，加入0.25％的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。
再加入2ml胰酶（25ml 培养瓶）静置消化2－5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。
我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。
因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。
需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。
2、MCF-7/ Adr 耐药细胞在培养时逐步加入至终浓度为8µmol/ L的阿霉素以维持抗药性, 实验前2周无药培养。
乳腺癌细胞株整理docx(一)2024
乳腺癌细胞株整理docx（一）引言概述：乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，其治疗涉及到研究和使用乳腺癌细胞株。
乳腺癌细胞株整理是为了系统化地研究乳腺癌的发生机制以及开发治疗方法的重要工作。
本文档将从以下五个大点出发，对乳腺癌细胞株整理进行详细阐述。
一、乳腺癌细胞株的来源和筛选方法1.常见的乳腺癌细胞株来源2.乳腺癌细胞株的特点和分类3.乳腺癌细胞株筛选方法的原则和步骤4.细胞株的基本鉴定和验证方法5.常用的乳腺癌细胞株库介绍二、乳腺癌细胞株的培养和传代方法1.培养基的选择和制备2.细胞的传代和细胞密度控制方法3.细胞培养的注意事项和问题解决方案4.细胞冻存和解冻方法5.乳腺癌细胞株的病毒污染检测和预防三、乳腺癌细胞株在药物筛选中的应用1.药物筛选的原理和方法2.乳腺癌细胞株的药物敏感性评估指标3.药物筛选实验的步骤和操作要点4.影响细胞药物反应的因素和解决方法5.常用的药物筛选平台和技术进展四、乳腺癌细胞株在基因表达和调控研究中的应用1.基因表达分析的原理和方法2.乳腺癌细胞株的转染和过表达方法3.基因沉默和干扰技术的应用4.表达谱分析和差异基因筛选方法5.研究乳腺癌细胞株基因调控网络的新进展五、乳腺癌细胞株在动物模型研究中的应用1.动物模型构建的原理和方法2.乳腺癌细胞株在裸鼠模型中的应用3.乳腺癌细胞株在转基因小鼠模型中的应用4.评估乳腺癌细胞株在动物模型中的肿瘤形成能力5.乳腺癌细胞株在治疗有效性评估中的作用总结：乳腺癌细胞株整理在乳腺癌研究和治疗中具有重要的意义。
通过筛选、培养和应用乳腺癌细胞株，可以深入研究乳腺癌的发生、发展机制，开展药物筛选和基因调控的研究，以及评估治疗方法的有效性。
随着技术的不断进步，乳腺癌细胞株整理将在乳腺癌领域发挥越来越重要的作用。
乳腺癌细胞培养上清液促进人脂肪间充质干细胞迁移和增殖的机制探讨
细胞与分子生物学乳腺癌细胞培养上清液促进人脂肪间充质干细胞迁移和增殖的机制探讨刘丹阳1，王璐璐2，何军2，姜杨2，李永涛2，张晓东2，李鹏辉2，沈雷2△摘要:目的探讨MDA-MB-231乳腺癌细胞培养上清液对人脂肪间充质干细胞（hAdMSC）迁移、增殖和凋亡的影响及分子机制。
方法将MDA-MB-231细胞上清液和不含胎牛血清的RPMI-1640培养基以1∶4的体积比混匀后培养的hAdMSC为MDA-MB-231上清液组。
向MDA-MB-231上清液组添加10µmol/L Reparixin（CXCR1/2抑制剂）为CXCR1/2抑制剂组；向MDA-MB-231上清液组添加10nmol/L GSK690693（Akt抑制剂）为Akt抑制剂组。
无任何刺激进行培养的hAdMSC为对照组。
细胞划痕实验检测各组hAdMSC的迁移能力，CCK-8实验检测各组hAdMSC增殖情况，Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞凋亡实验检测各组hAdMSC凋亡率，Western blot检测各组hAdMSC的mTOR/磷酸化mTOR（p-mTOR）和Akt/磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表达。
结果与对照组相比，MDA-MB-231上清液组hAdMSC的24h和48h细胞划痕闭合面积、细胞增殖水平以及p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量均增加，细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与MDA-MB-231上清液组相比，Akt抑制剂组和CXCR1/2抑制剂组hAdMSC的48h细胞划痕闭合面积、细胞增殖水平以及p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量均降低，细胞凋亡率均增加（P＜0.05）。
结论MDA-MB-231乳腺癌细胞培养上清液通过激活Akt-mTOR信号通路促进hAdMSC迁移和增殖，抑制hAdMSC凋亡，其中IL-8-CXCR1/2轴发挥关键作用。
关键词：乳腺肿瘤；细胞迁移；细胞增殖；肿瘤微环境；脂肪间充质干细胞中图分类号：R737.9文献标志码：A DOI：10.11958/20230255The mechanism of breast cancer cell culture supernatant promoting migration andproliferation of human adipose mesenchymal stem cellsLIU Danyang1,WANG Lulu2,HE Jun2,JIANG Yang2,LI Yongtao2,ZHANG Xiaodong2,LI Penghui2,SHEN Lei2△1Department of Histology and Embryology,2Medical Research Center,Qiqihar Medical College,Qiqihar161006,China△Corresponding Author E-mail:Abstract:Objective To explore the effect of MDA-MB-231breast cancer cell culture supernatant on migration, proliferation and apoptosis of human adipose mesenchymal stem cell(hAdMSC)and its molecular mechanism.Methods hAdMSC cultured from MDA-MB-231cell supernatant and RPMI-1640medium without fetal bovine serum were mixed at a volume ratio of1∶4to form the MDA-MB-231supernatant group.CXCR1/2inhibitor group was added with10µmol/L Reparixin(CXCR1/2inhibitor)to the MDA-MB-231supernatant group.The Akt inhibitor group was added with10nmol/L GSK690693(Akt inhibitor)to the MDA-MB-231supernatant group.hAdMSC cultured without any stimulation was used as the control group.The migration ability of hAdMSC in each group was detected by cell scratch assay.hAdMSC proliferation was detected by CCK-8assay.Annexin V-FITC/PI double labeled flow cytometry was used to detect hAdMSC apoptosis rate in each group.The protein expression levels of mTOR/phosphorylated mTOR(p-mTOR)and Akt/phosphorylated Akt(p-Akt)in hAdMSC of each group were detected by Western blot assay.Results Compared with the control group,the24h and48h scratch closure area,cell proliferation level and relative expression levels of p-Akt,p-mTOR protein of hAdMSC were increased in the MDA-MB-231supernatant group,and the apoptosis rate was decreased(P＜0.05).Compared with the MDA-MB-231supernatant group,the48h cell scratch closure area,cell proliferation level and relative expression levels of p-Akt,p-mTOR proteins of hAdMSC were decreased in the Akt inhibitor group and the CXCR1/2inhibitor group,and the apoptosis rate was increased(P＜0.05).Conclusion MDA-MB-231breast cancer cell culture supernatant promotes hAdMSC migration and proliferation and inhibits hAdMSC apoptosis by activating Akt-mTOR signaling pathway,in which IL-8-CXCR1/2axis plays a key role.Key words:breast neoplasms;cell migration;cell proliferation;tumor microenvironment;adipose derived mesenchymal stem cells基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目资助（2020-KYYWF-0010）；齐齐哈尔市科技计划联合引导项目（LHYD-2021002）作者单位：1齐齐哈尔医学院组织胚胎学教研室（邮编161006），2基础医学科研中心作者简介：刘丹阳（1982），女，讲师，主要从事肿瘤微环境与肿瘤生物学方面研究。
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MCF-7 就是一种很好养的人乳腺癌细胞,培养基用DMEM或RPMI1640均可, 10－15％的小牛血清就能长得很好。
一般两到三天传一代。
传代也很常规。
吸出培养基,加入0、25％的胰酶1ml,轻轻晃动培养瓶,使胰酶流遍瓶壁,以去除残余的培养基。
再加入2ml胰酶(25ml培养瓶)静置消化2－5min,待细胞缩起变圆,将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。
我一般都不用缓冲液冲洗,而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用,感觉效果还不错。
因为MCF-7消化较快,一般不放到培养箱中消化,以免消化太过。
需要注意的就是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起,一般都来不及抢救。
MDA-MB-231人乳腺癌细胞细胞中文名称人乳腺癌细胞细胞英文名称 MDA-MB-231物种人细胞形态特征上皮样细胞生长特性贴壁生长细胞特种特性 MDA-MB-231就是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。
该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体与WNT7B癌基因培养基 L15: Leibovitz Medium血清 10%FBS细胞传代方法 1:2~1:4传代;每周2~3次细胞传代情况 C5细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性说明培养基:DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10%培养条件:37℃ 5% CO2消化条件:0、25% (w/v) Trypsin-0、53mM EDTA溶液,消化5-10min传代的比例:1:2~1:4换液时间:2~3天换液一次冻存液比例:85%培养基,10%FBS, 5% (v/v) DMSO冻存密度:1-2 ×10 6/管,液氮保存MDA-MB-231 人乳腺癌细胞复苏方法:取出冻存管后,投入37 ℃水浴中,震荡解冻2 min,酒精消毒管壁外侧后,将其转入超净台中,将管内细胞转移至离心管中,加入5 ml 37 ℃预热的培养基,并清洗冻存管一次,将离心管离心(1000 rpm,5 min),弃去上清液,再加入2 ml培养基,转入培养瓶中培养。
产品名称:人正常乳腺细胞 Hs 578Bst规格:70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶特点:细胞代数为4-5代左右包装:内层无菌自封袋;专用防压泡沫盒;外层防压保温气泡袋;说明书细胞来源:ATCC、sciencell、ICLC货期:1-2周运输方式:快递运输售后:收到细胞后7天,如发现细胞有质量问题(如污染,死亡,快递运输等原因)时,应出具书面质量问题报告并及时传真或E-mail致销售人员,我们将尽快为您解决。
细胞培养常见问题分析细胞培养1、冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后,须立即放入37 ℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化,并注意水面不可超过冷冻管盖沿,否则易发生污染情形。
另冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全,预防冷冻管之爆裂。
2、细胞冷冻管解冻培养时,就是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外,绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞),在解冻之后,应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中,待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可,如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
3、可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。
每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基,若骤然使用与原先提供之培养条件不同之培养基,细胞大都无法立即适应,造成细胞无法存活。
4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。
血清就是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类与品质对于细胞的生长会产生极大的影响。
来自不同物种的血清,在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5、何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum)与FCS (fetal calf serum)就是相同的意思,两者都就是指胎牛血清, FCS 乃错误的使用字眼,请不要再使用。
CS (calf serum)则就是指小牛血清。
HS (horseserum)则就是指马血清。
6、培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统,而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。
当培养基中NaHCO3 含量为每公升3、7 g 时,细胞培养时应使用10 % CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1、5 g 时,则应使用5 % CO2 培养细胞。
7、何时须更换培养基？视细胞生长密度而定,或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按时更换培养基即可。
8、培养基中就是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外,一般正常培养状态下,培养基中不应添加任何抗生素。
9、附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0、05% trypsin-0、53mMEDTA、4 Na。
次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于–20 ℃,避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低,并可减少污染之机会。
10、悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中,稀释细胞浓度即可,若培养液太多时,可将培养角瓶口端稍微抬高,直到无法容纳为止。
分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶,加入新鲜培养基稀释至适当浓度,重复前述步骤即可。
11、欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞,其离心速率一般为300xg (约1,000rpm),5 - 10 分钟,过高之转速,将造成细胞死亡。
12、细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。
细胞数太少或稀释的太多亦就是造成细胞无法生长之一重要原因。
13、细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基就是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide)与90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。
注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能,故不可将DMSO 直接加入细胞液中,必须使用前先行配制完成。
14、DMSO 之等级与无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之DMSO 等级,必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),其本身即为无菌状况,次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于4°C,避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质,并可减少污染之机会。
若要过滤DMSO,则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。
15、冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃30~60 分钟→(-20 ℃30 分钟*) → -80 ℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃至–80 ℃以下,再放入液氮槽vapor phase长期储存。
*-20 ℃不可超过1 小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
15、细胞欲冷冻保存时,细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial,融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。
16、应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒与霉浆菌。
主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清与污染之细胞等。
严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源与培养基配制就是减低污染之方法。
17、如果细胞发生微生物污染时,应如何处理？加入相应抗生素。
直接灭菌后丢弃之。
18、支原体(mycoplasma)污染的细胞,就是否能以肉眼观察出异状？不能。
除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨之。
19、支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数,代谢及研究之任一数据。
故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。
20、CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？定期(至少每两周一次)以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
21、为何培养基保存于4 ℃冰箱中,颜色会偏暗红色,且pH值会越来越偏碱性？培养基保存于4 ℃冰箱中,培养基内之CO2 会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。
而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。
培养基偏碱之结果,将造成细胞生长停滞或死亡。
若培养基偏碱时,可以通入无菌过滤之CO2,以调整pH 值。
22、各种细胞培养用的dish,flask就是否均相同？不同厂牌的dish 或flask,其所coating 的polymer 不同,制造程序亦不同,虽对大部分细胞没有太大之影响,惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。
23、购买之细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形？购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？研究人员在细胞培养时出现存活率不佳,常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳。
血清使用错误或血清的品质不佳。
解冻过程错误。
冷冻细胞解冻后,加以洗涤细胞与离心。
悬浮细胞误认为死细胞。
培养温度使用错误。
细胞置于–80℃太久。
24、收到之冷冻管瓶身破裂,瓶盖有裂纹,或瓶盖脱落之原因？冷冻管瓶盖裂纹,或瓶身破裂,可能就是因为操作者夹取冷冻管时用力不当,造成冷冻管裂损,建议使用止血钳小心夹取。
另冷冻管瓶盖松动或松脱,乃因热胀冷缩之物理现象,冷冻管有可能因此而造成细胞污染,故冷冻管于放入与取出液氮桶时,均应立刻将冷冻管再一次扭紧。
25、如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。
在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。
总之,首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养就是一个好的开始,各种目的无血清培养首选AIM V(12005)培养基(SFM)。
26、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要不？它在溶液中不稳定不？L-谷氨酰胺在细胞培养时就是重要的。
脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成与核酸代谢。
L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但就是确切的降解率一直没有最终定论。
L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。
27、GlutaMAX-I就是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？GlutaMAX-I 二肽就是一个L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。