可见分光光度法和紫外分光光度法
可见分光光度法和紫外分光光度法
二、物质的吸收光谱 吸收光谱：溶液对不同 波长的光的吸收程度不 同，以吸收程度（吸光 度）为纵坐标，以波长 为横坐标作图，所得曲 线，即为吸收光谱或称 吸收曲线。
最大吸收波长 ：吸收光 谱中，吸光度最大处的 波长为最大吸收波长， 用max表示。
三、透光率和吸光度
I0
Ia
It
I0 = I a + I t
解 设酶和AMP的浓度分别为y和z
为260nm
0.58 ═ 1.521041.00y+1.51041.00z
为280nm
0.46═2.961041.00y+2.41031.00z 解方程得：y ═1.410-5molL–1 z ═2.510-5 molL1
答： 酶的浓度为1.410-5molL–1
lg0.398 A (480nm ) 1.33103 L mol1 cm 1 cb 1.5010 4 mol L1 2.00cm
1 1.33103 L mol1 cm 1 a(480nm) ε (480nm) 5.30L g 1 cm 1 M 251g mol1
例 已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合 物用乙醇作溶剂配成浓度为0.150mmolL-1的溶液， 在 4 8 0 nm 波 长 处 用 2 . 0 0 cm 吸 收 池 测 得 透 光 率 为 39.8%，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数。
解 由Lambert-Beer定律可得：
A lg T ε cb cb
（二）标准对照法
用标准品配制一个已知浓度的标准溶液，在选 定的波长处用同样厚度的吸收池分别测定标准溶 液和未知溶液的吸光度，用计算公式求出未知溶 液的浓度。
As Ax cs c x cs c x Ax As
可见和紫外分光光度法
Ir
I0
It
c b
Ia
I0= Ia+ It
T It I0
T：透光率
Ambert-Beer’s law
A= kbc
b：液层厚度，即吸收池厚度，单位 cm
c：溶液浓度
当单位为mol/L时，k为摩尔吸光系数，单位为：
L·mol-1·cm-1
E 当单位为g/ml时，k为比吸光系数，用 1% 表示，单
朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法定量测定 的理论基础
吸光度具有加和性：
总吸光度等于吸收介质内各吸光物质吸光度的总 和 A=A1+A2+A3+···=κ1bc1+κ2bc2+κ3bc3+ ···
第二节 可见－紫外分光光度法
一、可见及紫外分光光度计
光源
吸 收 单色器 池 检测器 信号显示系统
样品
性分析的依据。
③λmax几乎不随物质的浓度而变
④λmax附近，A最大，并与浓度c呈正
比关系 ——定量分析依据。
⑤ 远离λmax的光,物质几乎不吸收光 （A→0）,这些光的A与物质的c无
直接关系——不作定量分析依据。
三、吸光度和透光率（ absorbance and transmittance ）
可见和紫外分光光度法
第一节 分光光度法基本原理－吸收光谱和 朗伯－比尔定律
第二节 可见－紫外分光光度法
第一节 分光光度法基本原理－吸收 光谱和朗伯－比尔定律
分光光度法：利用物质的吸收光谱和光的吸收定律
对物质进行定性或定量的方法。
一、紫外光谱的产生
分子中外层电子跃迁产生紫外光谱
光与电磁波
可见-紫外分光光度法：研究物质在可见、紫
02-紫外可见分光光度法全
例：Cd2+浓度为140 umol ·L-1 ，双 硫腙法显色测定波长为520nm，液
层厚度2cm，吸光度为0.22，求 和
透光率T。
解： (1) A = b c
0.22 = 2 140 10-6
= 785.7 L ·mol-1 ·cm-1
(2) A =－lgT = 0.22 lgT = －0.22 T = 10－0.22 = 0.60 = 60%
（ε=200-2000L /（mol*cm ），如苯环。
（4） 210-250 nm有强吸收峰，表明可能含有2个共轭双键 ；在260nm,300 nm,330 nm有强吸收峰，说明是3个或3个以 上双键的共轭体系。
（5)若吸收峰延伸至可见光区，则可能是长链共轭或稠环 化合物
习题P46第21,22题
第三节 紫外可见分光光度法的定量分析 P9
照射分子，由于分子、原子或离子的能级是量子化的，不
连续的，只有光子的能量(h)与被照射物质粒子的基态和
激发态能量之差(E)相等时，才能被吸收。
△ E = h （ h为普朗克常数）
不同物质的基态和激发态的能量差不同，选择吸收光
子的能量也不同，即吸收的波长不同。
2、光的种类 P7
➢具有单一波长的光叫单色光，比如红，蓝光等。 ➢由不同波长的光组成的光叫复色光。比如日光等 ➢如两种适当颜色的单色光按适当的强度比例混合 能得到白光，则这两种颜色的光叫做互补色光。
A = K·b ·c
c：物质的量浓度(mol ·L-1) K:吸光系数。
b：为液层厚度(cm)
应用的条件：
入射光必须是单色光； 吸收发生在稀的均匀的介质中； 吸收过程中，吸收物质互相不发生作用。
3、吸光系数（K）
紫外分光光度法和可见光分光光度法的异同
紫外分光光度法和可见光分光光度法的异同紫外分光光度法和可见光分光光度法，听起来是不是有点拗口？别担心，咱们慢慢聊。
紫外分光光度法，顾名思义，它主要工作在紫外线区域。
这种方法能让我们“偷窥”到一些肉眼看不见的东西。
比如，想知道水里有没有杂质？紫外分光光度法可以精准地告诉你，不信你试试！而可见光分光光度法呢，主要是用来分析那些能被我们眼睛看到的颜色，像红色、蓝色、绿色这些。
你知道的，水里的红色染料和蓝色染料，都是这玩意儿的“主场”。
紫外光和可见光，都是光谱的一部分，但它们的工作原理和应用却大相径庭。
再说说它们的检测对象，紫外分光光度法常常用来检测一些化合物的浓度，特别是那些在紫外区域有吸收特性的物质。
你可以想象一下，就像侦探在找线索，它能帮助科学家找到隐藏的化学成分。
而可见光分光光度法则更像是舞台上的演员，光彩夺目，专门用来分析那些在可见光区域的物质。
有些化合物在紫外光下可能“失踪”，但在可见光下却能光芒四射。
想想看，这就像是有些人在人群中显得特别突出，格外吸引眼球。
说到应用，紫外分光光度法在医学、环境监测和制药等领域都大显身手。
想要检测血液中的某种药物浓度，紫外分光光度法绝对是个好帮手。
可见光分光光度法则常见于食品和饮料行业，检测饮料的色素含量，保证我们的饮品既好看又安全。
谁会喜欢喝那种颜色怪异的饮料呢？食品中的色素含量与我们的生活息息相关，健康可不能掉以轻心。
这两种方法在仪器上也有点差异。
紫外分光光度计一般比较复杂，光源主要是氘灯，波长范围广，适合各种检测需求。
而可见光分光光度计呢，通常简单很多，光源用的是氙灯或者白炽灯，操作起来轻松愉快，适合日常使用。
就好比，一个是驾校里的赛车，一个是街边的小电动车，各有各的优缺点。
不过，别以为这两者就没有交集。
实际上，很多时候，紫外分光光度法和可见光分光光度法可以相辅相成。
比如，在某些复杂样品的分析中，先用紫外法进行初步筛选，再用可见法进一步确认。
就像侦探小说中，先通过蛛丝马迹找到嫌疑人，再通过细节锁定真相，逻辑清晰，层层推进。
紫外-可见分光光度法(6)
A
0.6
0.5
max=510 nm
0.4
0.3
0.2
0.1
0
400
450
500
550
600
波长（nm）
邻二氮菲亚铁溶液 吸收曲线
吸光度最大时， 对应的波长为 最大吸收波长 （λmax）
3.双波长分光光度计
用两不同波长的单色光交替通过 吸收池，得到不同波长处吸光度 的差值进行测定,无需参比池。
§4.3 分析条件的选择
仪器条件 的选择
测狭吸 量缝光 波宽度 长度的
范 围
分析条件的选择
显色条件选择
溶
显 的色 要剂 求反
应
的 选 择
显 色 条 件
剂 参 比 溶 液
参比溶液 试样平 剂品行 参参操 比比作 溶溶参 液液比
氙灯
氢灯
钨灯
2．单色器：
其作用是将光源发射的复合光分解 成单色光，并可从中选出任一波长单 色光的光学系统。包括狭缝、色散元 件和透镜系统。
色散元件：是将复合光分解成单
色光，有棱镜或光栅两种。
光栅示意图
一、基本构造
3.吸收池
玻璃比色皿——仅适用于可见光区 石英比色皿——用于紫外和可见光区
要求
仪器分析模式设定显示窗拉杆样品室0t100t波长设定仪器分析紫外分光光度计与可见分光光度计的差异名称名称可见分光光度计可见分光光度计紫外分光光度计紫外分光光度计波长范围波长范围光源光源吸收池吸收池材料材料仪器分析名称名称可见分光光度法可见分光光度法紫外分光光度法紫外分光光度法波长范围波长范围可见光可见光400400760nm760nm紫外光紫外光200200400nm400nm光源光源卤钨灯卤钨灯氙灯氙灯吸收池吸收池材料材料玻璃玻璃石英石英石英石英紫外分光光度法与可见分光光度法的差异仪器分析双波长分光光度双波长分光光度单波长单光束分光光度单波长单光束分光光度单波长双光束分光光度单波长双光束分光光度一束光分为一束光分为强度相等的强度相等的两束分别两束分别通过通过样品池样品池用两不同波长的单色光交替通过用两不同波长的单色光交替通过吸收池得到不同波长处吸光度吸收池得到不同波长处吸光度的差值进行测定的差值进行测定无需参比池
分光光度法.
3、溶液酸度
a 酸度过大---酸效应 Mn+ + n HL MLn ＋ nH+ 酸度过小—水解效应 Mn+ + nOHM(OH)n b
C显色剂
提高测量灵敏度和准确度方法
（二）、选择合适测定条件 3、溶液酸度
磺基水杨酸离子Sal2-与Fe3+形成配合物 pH 配合物 颜色
cb
=1.33×103L.mol.cm-1 = 0.150×10-3×2.00 1.33×103 =5.30L.g-1.cm-1 a= /M= 251
-lg0.398
练习：P286/5
例：某有色溶液在1.00cm吸收池中，测得其 透光率T=60%，若改用2cm的吸收池时，其 T为？
解： A = k b = - lgT b=1.00 时 A1= -lg0.6 b=2.00 时 A2 ＝2A1 ＝ -2lg0.6 = -lg0.36 T=0. 36
= aM
(a) ,溶液对入射光吸收 。 >103,可进行分光光度分析
分光光度法基本原理
一、Lambert-Beer 定律
例：浓度为0.150mmol.L-1某化合物 (Mr=251) 溶液，在480nm波长处用2.00cm吸收池测得 透光率为39.8%, 求、a.
解： =
A
cb
=
-lgT
例：P284/13-3
解：已知 a(361)=20.7L.g-1.cm-1 b=1.00cm A=0.618 样=0.030g.L-1
测 A/ab 0.618/20.71.00 = = 质量分数= 样 样 0.030
= 0.997
本章要求
近紫外区的波长范围
近紫外区的波长范围泊岸记与你一起，见证青春！今天，从这章开始来给大家讲解《仪器分析》的知识点然后后期如果有时间我会尽力安排一个语音课的录入方便大家学习纯用爱发电，希望得到大家的支持！！多多宣传，多多转发在这个时间段，能带给大家一些帮助我就很开心了！紫外-可见分光光度法分光光度法一、定义二、分类1、可见分光光度法（400—800nm，可见光区）用此吸收光谱进行定性、定量及结构解析的方法称为可见分光光度法。
2、紫外分光光度法（200—400nm，近紫外区）3、红外分光光度法（0.76—500μm，中红外区）三、紫外—可见分光光度法的特点四物质对光的选择性吸收一、UV-Vis光谱的产生分子受电磁波辐射、吸收能量后其能量变化：DE=DE振+DE转+DE电子则分子内运动涉及三种跃迁能级，所需能量大小顺序：DE电子>DE振>DE转UV-Vis光谱是讨论分子中价电子在不同的分子轨道之间跃迁的能级关系UV-Vis光谱是电子光谱、分子光谱、吸收光谱、带状光谱二、UV-Vis光谱的电子跃迁类型1、分子中价电子的类型参与成键的s、s*；p、p*电子未参与成键而仍处于原子轨道中的n电子2、UV-Vis光谱的电子跃迁类型电子能级间隔越小，跃迁时吸收光子的能量越小，波长越长，波数越小，频率越低1）σ→σ*的跃迁发生在含有单键的饱和有机化合物，处于σ成键轨道上的电子吸收适当的能量后，可以将σ电子激发到σ*反键轨道上，从而产生σ→σ*的跃迁。
分子中σ键比较牢固，跃迁需要能量较高，吸收峰的波长一般都小于200nm，处于远紫外区。
在200～400nm范围内没有吸收。
饱和烃化合物的σ→σ*跃迁出现在远紫外区2）π→π*跃迁对应化合物：含有不饱和基团有机化合物C=C、C=N、C=O、CºC等特征：p→p*跃迁吸光系数值大（e>104，强吸收）所需激发能量比σ→σ*要低孤立的π→π*吸收峰的波长在200nm附近，分子中若含有共轭双键，使π→π*跃迁所需能量降低，共轭系统越长，越向长波方向移动，且吸收增强。
第四章紫外-可见分光光度法
（三）有机化合物的紫外、可见光谱
1. 饱和烃及其取代衍生物 σ→σ*、n→σ* 2. 不饱和烃及共轭烯烃 σ→σ*、π→π* 3. 羰基化合物 n→σ*、π→π*和n→π* 4. 苯及其衍生物 E1带、 E2带、 B带 5. 稠环和杂环
当l以cm，c以mol/L为单位时，k称为摩尔吸 光系数，用ε表示，它比a更为常用，ε的单位 为L mol-1 cm-1，即： A = ε c l
当l以cm，c以百分浓度g/100mL为单位时，k 称为比吸光系数，用A1cm1%表示 ε = 0.1 M A1cm1%
用比吸光系数的表示方法特别适用于摩尔质 量未知的化合物。
（二）配位场跃迁
1. f-f跃迁
镧系和铜系元素的离子对紫外和可见光的吸收是 基于内层f电子跃迁而产生的，其吸收光谱是由一些狭 窄的特征吸收峰组成，且这些吸收峰不易受金属离子 所处的配位环境的影响。
2. d-d跃迁
过渡金属离子的d轨道在受到配位体场的作用时 产生分裂。d电子在能级不同的d轨道间跃迁，吸收紫 外或可见光产生吸收光谱。这种光谱的吸收带比较 宽，吸收峰强烈地受配位环境的影响。
光。
3. 吸收池
功能：盛放分析试样（一般是液体）
4. 检测器 功能：检测光信号，测量单色光透过溶
液后光强度变化的一种装置。 5. 信号显示系统
6. 紫外一可见分光光度计的类型
(1) 单波长单光束分光光度计
缺点：测量结果受电源波动的影响较大， 误差较大。
(2) 单波长双光束分光光度计
一个环外双键
5nm
同环二烯 39nm 一个β烷基 12nm 三个γ+烷基 54nm
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及其增敏规律有了更深刻的认识。
（3）多元显色体系。
这类方法中，增效试剂以阳离子表面活性剂用得最多。
但多数情况下是在二元体系中加入不同的表面活性剂。
（4）动力学光度法。
近年来，该方法的研究文献快速增长。
金属离子催化氧化染料褪色仍然为主要研究内容。
（5）导数分光光度法。
导数分光光度法具有提高狭窄谱带吸收强度的特点，可克服通常的显色反应对某些组分难以进行测定的困难。
不少研究工作者将其与别的测定方法相结合以充分发挥其作用。
（6）双波长分光光度法。
该领域可供研究的课题很多。
利用常规显色反应双波长测定，能明显提高方法的灵敏度和选择性。
利用双波长对性质相近的元素进行测定，效果十分令人满意。
双波长结合多波长线性回归法测多种共存组分，体现出明显的优越性。
双波长标准加入法应用研究也有新的突破。
（7）萃取分光光度法。
经典的萃取分光光度法仍有较高的实用价值，此外诸如茜素配合剂-La(Ⅲ)二甲苯胺法测氟、邻苯二甲胺法测硒等颇具新颖的萃取分光光度法的出现，丰富和充实了萃取光度法的内容。
（8）流动注射分光光度法。
该法因在分析领域的广泛应用而获得迅速发展。
它与其它多种分析技术相结合使过去许多难以进行定量分析的化学反应中间体或不稳定产物的测定成为现实，拓宽了光度分析的应用范围。
二、紫外-可见分光光度计的类型及发展趋势
1918年，美国国家标准局制成了第一台紫外可见分光光度计。
此后经不断改进，出现了自动记录、自动打印、数字显示、微机控制等各种类型的仪器，灵敏度和准确度不断提高，应用范围也不断扩大。
紫外-可见光分光光度计可分为单波长和双波长分光光度计两类。
单波长分光光度计又分为单光束和双光束分光光度计（附：双光束分光光度计的工作原理动画）。
分光光度计的发展趋势可以从下列两个方面来看：(1)分光光度计的组件(如单色器、检测器、显示或记录系统、光源等)的改善与发展(2)分光光度计的结构(如单波长，双波长快速扫描、微处理机控制等)的发展。
现分述如下。
(一)从分光光度计的组件看发展
1．全息光栅正在迅速取代机刻光栅。
早期的分光光度计几乎都采用各种棱镜作为色散元件，随着光栅制造技术，尤其是复制光栅的不断提高，成本不断降低，近几年来绝大多数分光光度计都改用光栅。
最近，随着全息光栅技术的发展与商品化，全息闪耀光栅正在迅速取代一般的闪耀光栅。
2．电视式显示和电子计算机绘图初露锋芒。
近年来随着微型计算机技术的迅速发展与价格日益便宜，因此和其他类型的分析仪器一样，分光光度计亦已经配用电视式显示和计算机绘图装置。
3．检测器的改进。
目前科学工作者正在研究和应用各种可在全波长同时记录的检测器，如：硅光二极管阵列、光敏硅片、电荷耦合器件以及在不同波长处2种或3种检测器的联用。
(二)从分光光度计的构型看发展
1．电子计算机控制的分光光度计日见增多。
随着电子计算机技术的迅速发展，微处理机控制的分光光度计正方兴末艾，它不仅促使分光光度计进一步自动化，而且可大大改善仪器的性能，例如使分光光度计具有获得多级导数的能力，具有光谱累积和平均的特性从而大大提高信噪比的能力。
2．双波长分光光度计迅速发展。
3．快速扫描分光光度计陆续问世。
三、化学家小传
（一）光谱仪发明者－本生和基尔霍夫
本生（Robert Wilhelm Bunsen，1811～1899年），德国化学家和物理学家。
他17岁大学毕业，19岁获得博士学位。
1830～1833年期间在欧洲一些国家的著名实验室和工厂里工作，1838～1851年任马尔堡大学化学教授，1852～1889年任海德堡大学教授，创建了一个著名的化学学派。
基尔霍夫（Gustav Rober Kirehhoff，1824～1887年），德国物理学家。
早年就读于柯尼斯堡大学。
1847年毕业后至柏林大学任教。
1854年经本生推荐任海德堡大学教授。
1875年到柏林大学任物理学教授。
本生在科学上的杰出贡献，是和基尔霍夫共同开辟出光谱分析领域。
1859年，他和基尔霍夫合作设计了世界上第一台光谱仪，并利用这台仪器系统地研究各物质产生的光谱，创建了光谱分析法。
1860年他们用这种方法在狄克海姆矿泉水中发现了新元素铯，1861年又用此仪器发现了新元素铷。
从此光谱分析不仅成为化学家手中的重要检测手段，同时也是物理学家、天文学家开展科学研究的重要武器。
本生还研制出了本生灯、本生光度计、量热器以及本生电池等。
除上面提到的与本生的共同发明、创造外，基尔霍夫在电学理论上也做出了杰出贡献。
1845年，他提出了计算稳恒电路网络中电流、电压、电阻关系的基尔霍夫电路定律。
另外基尔霍夫研究了太阳光谱的夫琅和费线，在研究过程中得出了关于热辐射的基尔霍夫定律。
1862年他又进一步提出了绝对黑体的概念。
他的工作为以后量子论的出现奠定了基础。
（二）伍德沃德与“伍氏规则”
伍德沃德，R.B.(Woodward，Robert Burns. 1917～1979年)。
伍德沃德从童年时代就对化学非常有兴趣，常在家中的地下室里进行化学实验。
16岁时进入麻省理工学院读书，三年后获学士学位，一年后又得到博士学位，年仅20岁。
伍德沃德是当代公认为最杰出的有机化学家之一。
他一生发表了200余篇论文，获得了多个名誉博士学位，都是世界上许多著名大学授予的。
他还接受过24次各国最高的奖状和奖金。
伍德沃德以合成复杂天然有机化合物闻名于世，达到了当代有机合成的顶峰。
他的化学知识是百科全书式的，对细节过目不忘。
他的过人之处在于能博览群书，而又融会贯通，将别人琐碎的研究成果整合成完整的知识来解决具体问题。
他的工作业绩大致可分为三类：一是提倡仪器方法的使用；二是重要理论及方法的创建；三是复杂天然有机化合物结构的测定及合成。
在提倡仪器方法的使用上，伍德沃德不仅是对某几项工作做出成果，而是强调这个方法的重要，并预见到它将在整个化学领域起到非常重要的作用。
例如，紫外光谱已有很久的历史，但直到20世纪40年代，才逐渐在有机化学领域中得到普遍使用。
伍德沃德是这一方法的积极倡仪者和开拓者，他预见到仪器分析法将发挥无可比拟的威力。
在研究萜类天然产物的结构时，他通过观察烷基和羰基取代在共轭体系中紫外吸收变化的规则，得到了一系列经验规律，对紫外吸收的应用做出了重要贡献，发现了众所周知的“伍氏规则”。
至今人们还在利用这一规则推测共轭二烯烃、多烯烃及共轭烯酮类化合物的最大吸收波长。