冬虫夏草菌丝体液体培养基的优化

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天津师范大学学报(自然科学版)第28卷2008年总目次

类四阶发展方程的混合有限体积格式
… … … … … … …… … …… … …… … … … …
…
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…
一
谱负Ｌｖ过程的三者联合密度函数与Ｇｅｂｒｈｕ折现罚金函数 … …… … …… … ｅｙｒｅ－Ｓｉ关于正整数ｎ的ｋ次幂部分数列的加权均值
ＺＣＺＢ纳米多层膜的结构和机械性能研究ｒ／ｒ２
宋文华，孙
… … … … … …
婷，高敏苓，星龙，王国峰（８金２）
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田
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基于ＸＬ的异构数据源间数据交换的实现 … … … … … … … … … … … …… … …… … Ｍ
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崔雁松，张乃栋，徐
亮，益平（０林７）
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张
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桦，孙济州，董
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晨，薛彦兵（３７）
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马广慧，邵秀丽，李耀芳（６７）
第２期・
… … … ・・
Ｓｌ杀线虫代谢产物３ｒ８菌ＯＬ罐发酵放大条件的优化 … … … … … … … … … … … … 一

冬虫夏草的培养及菌种鉴定

冬虫夏草的培养及菌种鉴定作者：帖卫芳贾俊忠张叶刘瑞娟来源：《河南农业·科技版》2018年第02期摘要：冬虫夏草是我国的传统中药材，分布广泛，种类繁多。

本文对采自新疆的野生虫体进行分离培养，并进行菌种的纯化、染色分析及鉴定，结果表明分离到的真菌是冬虫夏草（Cordyceps scarabaeicola）。

并经过染色分析确定其形态学特点，为下一步虫草试验分析与基因修饰奠定良好的基础。

关键词：冬虫夏草；分离培养；18SrDNA；菌丝冬虫夏草（Cordyceps sinensis）属于子囊菌纲（Ascomycetes）肉座菌目（Hypocreales）麦角菌科（Clavicipitaceae）虫草属（Cordyceps）真菌。

野生虫草生长于海拔较高的寒冷区域，主要分布于我国云贵高原。

冬虫夏草性甘味温，药用价值极高，在保肺益肾、止咳化痰、止血、抗癌等方面效果良好[1-2]。

一、试验材料（一）真菌材料试验材料是冬虫夏草的虫体部分，试验中所用的虫草菌丝分离自该虫体部分。

DNA提取试剂盒购自美国OMEGA公司的Fungal DNA Mini Kit，引物的合成与测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

（二）培养基改良CYM培养基[3-4]，1 L培养基含麦芽糖10 g、葡萄糖15 g、酵母粉2 g、蛋白胨2g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KH2PO4.6 g和维生素B1 0.3 g，pH值自然，固体培养基含0.8%～1.0%琼脂。

二、试验方法（一）虫草真菌的分离及纯化1.虫草菌丝的分离首先将虫体清洗干净，在超净工作台内吹干水分，选取中间部分用解剖刀切成1.0～1.5 cm的小段。

然后进行表面消毒，用75%酒精没过虫段浸泡3～5 min，0.1%升汞浸泡15 min，间隔2～3 min摇晃几次，去掉两端各约0.1 cm的部分，用消毒解剖刀纵切后接种于真菌培养平板上培养，待真菌长出后用无菌的接种针挑取顶端少量菌丝转接于真菌培养基上进行继代培养。

冬虫夏草液体发酵产胞外多糖的研究

严格，寄主的选择性强，对目前还不能实现人工栽培，因此用深层液体发酵冬虫夏草菌丝体从中提取
体，者合并，００／ｉ离心１ｍｉ。二４０ｒｍｎ５ｎ取上清液，在旋转蒸发仪上浓缩至３ｍ，用三倍体积的９发展前景。
１材料与方法
１１供试菌种：．冬虫夏草ｌ，号由本所保藏。
１．养基２培
斜面培养基（ＤＡ养基）马铃薯汁２％、Ｐ培：０琼脂２、葡萄糖５、Ｓ４ＨＯ．５、％％ＭｇＯ．２００％７
ＶｌＯ％，Ｂ．ｌ初始ｐ６５０Ｈ．。
１菌种活化．３
将保藏菌种冬虫夏草ｌ接种于ＰＡ面，号Ｄ斜２ ℃培养１ｄＯ４左右，ＰＡ斜面菌种接种于种子培将Ｄ养基中，２１０／ｎ２ ℃、２转ｍｉ旋转式摇床培养７。ｄ
Ｋ．
Ｋ２
１．７３４
１３４．２
１．９３０
１３３．
１．８３４
１７３３．
以５％的接种量转接于实验规定的发酵培养基ｌＯｌ置于旋转式摇床，２￣／ｉ，０Ｏｍ中，１０ｍｎ２ ℃培养７。ｄ
１胞外粗多糖含量测定．５
维普资讯
发酵科技通讯
第３卷６
冬虫夏草液体发酵产胞外多糖的研究
全卫丰汪洁杜妹莲刘广建
（江苏省微生物研究所有限责任公司无锡２４６）１０３

虫草素

虫草素培养条件优化试验虫草素(Codycepin)又名虫草菌素、蛹虫草菌素。

虫草素的生物活性及其药理作用: 增强人体免疫功能及抗癌作用、抗菌抗病毒作用、促进新陈代谢。

提取和纯化虫草素的活性物质大都来自于蛹虫草,目前从蛹虫草人工培养液及菌丝体中都分离出了虫草素。

国内也有化学合成的方法，但其中有除不尽的杂质。

李楠等对冬虫夏草及蛹虫草中的虫草素含量作了比较, 发现蛹虫草及冬虫夏草都含有虫草素, 前者含量是后者的2倍。

1材料与方法1.1.1试剂培养基配方：白砂糖15g/L 花生仁5 g/L 干酵母10 g/L 磷酸二氢钾1 g/L 硫酸镁0.5 g/L消泡剂0.2 g/L供试菌株：蛹虫草Cordyceps militaris 菌株M1，由浙江经贸职业技术学院提供。

1.1.2主要仪器：高效液相色谱仪：大连伊利特分析仪器有限公司；全温振荡培养箱：上海智诚分析仪器制造有限公司1.2.1 试验方法：按基础培养基配方，初始pH 为7.0，培养温度为26℃，转速为180r/min，培养时间为8d，以10g/L 蛋白胨为氮源，以葡萄糖、蔗糖、D-果糖、乳糖、麦芽糖、淀粉和纤维素为碳源，碳原子含量为600mmol/L，进行不同碳源对菌丝产虫草素影响试验；用选出的碳源，设置其浓度为5、10、15、20、25、30、35、40g/L 进行不同浓度碳源对菌丝产虫草素影响试验；用选出的碳源及浓度，以蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、NaNO3、尿素、NH4NO3、NH4Cl 为氮源。

氮原子含量为40mmol/L，。

进行不同氮源对菌丝产虫草素影响试验；用选出的氮源，设置其浓度为2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5g/L进行不同浓度氮源对菌丝产虫草素影响试验。

按基础培养基配方，以上述试验选出的适宜碳氮源及浓度，培养温度为26℃，转速为180r/min，培养时间为8d，设置培养液的初始pH 为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0 进行不同初始pH 值对菌丝产虫草素影响试验；用选出的pH，转速为180r/min，培养时间为8d，设置培养温度为16、20、24、28、32℃进行不同培养温度对菌丝产虫草素影响试验；用选出的pH 和养温度，培养时间为8d，设置摇床转速为105、130、155、180、205r/min 进行不同转速对菌丝产虫草素影响试验；用选出的初始pH、培养温度、摇床转速，设置培养时间为4、5、6、7、8、9、10、11d 进行培养时间对菌丝产虫草素的影响试验。

冬虫夏草菌丝液体培养碳氮源最佳组合的研究

维普资讯
２００２年
赵桂云ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ等：冬虫夏草凿丝液体培养碳氮源最佳组合的研究碳氮组合。
第４期
１１菌种来源：牡丹江林业科学研究所提供。．
１２．方法
表１培养基的配方及配置方法（位：ｇ）单
．
Ｌｏ田ｃｐｌｅｑｌｓｈｐａ・ｏｔｅｏｔｏｎｌｄｓｇｘｅｉｎｓｓｏｉｇ；ｔＳｔｅｂｓｃｍｂｎｔｅｔａｈｒ ’ ｅｓｓｌｌｓｑｓｙｈｅＦｒｍｈｒｈｇｏａｅｉｎｅｐｒｍｅｔｈｗｎＩｈｅｔｏ ’ ｉａｌｎｈｔｔｅｅ
．
．
Ｋｙｗｄｅｏｒｓ：ｏｄｃｐｓｓｎｎｉｓｈｐｈｅｌｉｃｌｒ；ａｂｎｎｉｏｅｏｒｅｃｒｙｅｉｅｓｓ’ ｙａ；ｉｄｕｔｅｃｒｏ．ｔｇｎｓｕｃｑｕｕｒ
冬虫夏草菌［阳弦咿ｓｎｎｉＢｅｋ）Ｓｃ】麦ＣＤｉｅｓｓ（ｒ、ａｅ属
本试验共设４因素，每因素设置３个水平，选用了Ｆ交实验设计Ｌ４）表，设计出４因素３水平的９。（个实验配方。每个配方重复５次。实验设计及配制方法
。
左右，已濒临灭绝。为了缓解虫草短缺的矛盾，很多学者对虫草的人工栽培都做了大量的工作。到目前为止，草子实体的虫人工栽培虽有成功，重复性极差，要达到规模化和产但

冬虫夏草液体发酵生产多糖和菌丝体的研究

１材料与方法
１．１材料与试剂冬虫夏草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓｓｉｎｅｎｓｉｓ）取自日本筑波大学生命
科学研究科生物资源工学研究室。高温α－淀粉酶（２００００Ｕ／ｍｌ）和糖化酶（１０ × １０４Ｕ／ｍｌ）
宜兴市生物工程公司；木瓜蛋白酶（０．５～２Ｕ／ｍｇ，固体）Ｓｉｇｍａ公司。１．２仪器与设备
２．５
菌丝体产量（ｇ／Ｌ）
２．０
１．５
１．０
０．５
Fig.1
０
０．５
１
３
５
７
接种量（％）
图１接种量对菌丝体产量的影响
Effects of different inoculation quantities on yield of
Cordyceps sinensis mycelium
由图１可以看出，随着接种量的增加，菌丝体产量呈上升趋势，但是当接种量增长到５％时，菌丝体产量基本接近７％时的产量，且呈现平缓的趋势，这是由于开始菌丝体生长旺盛，代谢主要流向菌丝体生长，当生长到一定程度，培养基被完全利用，开始产生抑制菌丝体生长现象。
试剂
１
葡萄糖标准溶液（１０００μｇ／ｍｌ）１
蒸馏水加入量（ｍｌ）
９
葡萄糖最终浓度（μｇ／ｍｌ）１００
２
３
２
４
８
６
２００
４００
４
５
６
８
４
２
６００
８００
绘制标准曲线：另取６只试管，前５支分别加入上述不同梯度葡萄糖溶液１ｍｌ，第６管加入蒸馏水１ｍｌ。然后各管再加入３，５－二硝基水杨酸（ＤＮＳ）显色试剂１ｍｌ，沸水浴加热５ｍｉｎ，取出冷却后再加入蒸馏水８ｍｌ，摇匀，以第６管作为空白，分光光度计５４０ｎｍ处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。

虫草液体发酵的非营养条件优化与免疫功能

冬虫夏草[Cordyceps sinensis(Berk.) Sacc.]又名
虫草，为麦角菌科真菌寄生在虫草蝙蝠蛾幼虫上
收稿日期：2011-08-08 基金项目：企业横向合作课题(SSYH1004)。作者简介：罗建光(1968—)，男，博士，讲师，研究方向为食品生物技术。
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食品科技
2012年第 37卷第 3期 FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
LUO Jian-guang
(Jiangsu Food Science College, Jiangsu Engineering Research & Development Center for Food Processing, Huai’ an 223003)
Abstract: Optimization of no-nutritional conditions for the production of mycelia from Cordyceps sinensis in submerged culture using central composite design and the immuno-modulation activity of HWE were carried out. As results, the optimal culture conditions were determined as following: 22.64 ℃ temperature, 6.18 pH and 7.36 d cultural time. A yield of 21.73 g/L for mycelial biomass was observed in verification experiment. Furthermore, HWE from mycelia of Cordyceps sinensis was found to have direct immunomodulation activity on splenocyte proliferative response and enhancing ability of devouring neutral red in mouse peritoneal macrophage in a dose-dependent manner in vitro. The hot-water extract of Cordyceps sinensis fermentative mycelia possesses notable immunomodulation activities and has the potential to be used as a functional food. Key words: Cordyceps sinensis; submerged culture; central composite design; immunomodulation

中国被毛孢菌摇瓶发酵菌丝体培养基的正交优化实验

中国被毛孢菌摇瓶发酵菌丝体培养基的正交优化实验优化中华被毛孢的液体培养条件。

其方法是通过18srDNA及系统进化树对中华被毛孢进行鉴定分析，然后以中华被毛孢菌丝体生物量为指标,采用单因素试验和正交试瞪研究菌丝体液深层发酵的培养条件。

然而结果是单因素试验表明,最佳的氮源为蛋白陈，其次为牛肉膏;最佳碳源为葡萄糖,其次为蔗糖和麦芽糖。

正交设计试验表明，菌株的液体发酵的最佳配方:浓度1%葡萄糖+浓度0.5%蛋白胨+浓度0.1%酵母粉+浓度0.01%维生素B, +浓度0.05% KH,PO, +浓度0.05% MgSO;在该浓度培养下，菌丝体生物量可达到20.8g/L。

其次结论该方法优化了中华被毛孢的液体培养条件,为中华被毛孢的的开发利用提供依据。

珍贵药材冬虫夏草( Cordyceps sinensis) 的药用价值已引物。

以提取的基因组起广泛关注,但冬虫夏草的人工培育难度极大,野生资源稀DNA为模板,以上述设计引物为扩增引物，克隆真菌的缺。

为利用冬虫夏草的药用价值,对冬虫夏草真菌进行发酵18srDNA序列，测序,将测序的结果在NCBI上进行BLAST利用，是当前冬虫夏草开发的重要途径之一。

比对,选取部分同源序列和中华被毛孢的18S rDNA序列利智等的研究表明,中国被毛孢( Hisuella sinensis)是冬虫夏草用clustaLx软件包进行序列同源进化比对,将得到的结果运的真菌无性型" 0。

笔者先通过18srDNA及系统进化树对用MEGA4. 0软件采用邻位相连( Neighbor - joining)算法构所引进的冬虫夏草无性型进行分子鉴定,再研究菌丝体的液建系统进化树8]。

体培养工艺，以期为冬虫夏草的开发利用奠定基础。

接种方法与接种条件。

将不同培养基灭菌(121 C,1材料与方法30 min)冷却后,取4 ~5瓶生长良好的液体种子,用纱布过滤发酵液,得到菌丝体,将菌丝体转人玻璃匀浆器中研磨。

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文章编号:167121114(2008)0120008204冬虫夏草菌丝体液体培养基的优化收稿日期:2007208227基金项目:天津市科学技术委员会资助项目(06ZHCXNC05900)第一作者:赵　润(1983—),男,硕士研究生.通讯作者:郭成金(1952—),男,副教授,主要从事蕈菌生物学的研究与开发.赵　润,郭成金(天津师范大学化学与生命科学学院,天津300387)摘　要:采用正交分析方法对冬虫夏草菌丝体的液体培养基配方进行了优化,结果表明,冬虫夏草生长最适液体培养基配方为:葡萄糖1.25%,蔗糖1.25%,蛋白胨0.02%,酵母粉0.0625%,KH 2PO 40.025%,MgSO 4・7H 2O0.0125%,VB 10.0025%,p H 自然;培养温度24℃,周期192h ,其菌丝体生物量产率为19.5g/L ,是前人菌丝体生物量产率的1.2～1.5倍.关键词:正交分析;冬虫夏草;菌丝体;液体培养基;优化;生物量中图分类号:Q932335 文献标识码:AOptimizing on liquid culture media of Cor dyce ps sinensis myceliaZ HA O Run ,GUO Chengjin(College of Chemist ry and Life Science ,Tianjin Normal University ,Tianjin 300387,China )Abstract :The liquid culture media of Cordyce ps sinensis mycelia was optimized by means of orthogonal analysis.The results showed that the optimal medium for the mycelia was 1.25%glucose ,1.25%sucrose ,0.02%peptone ,0.0625%yeast powder ,0.025%KH 2PO 4,0.0125%MgSO 4・7H 2O ,0.0025%VB 1and p H natural.In the cultural condition of 24℃and 192h ,the mycelia biomass reached to 19.5g/L ,which was as 1.2～1.5times as the amount with the previous way.K ey w ords :orthogonal analysis ;Cord yce ps sinensis ;mycelia ;liquid culture media ;optimize ;biomass 冬虫夏草属于真菌界(K ingdom Fungi )、子囊菌门(Ascomycota )、核菌纲(Pyrenomycetes )、麦角菌目(Clavicipitales )、麦角菌科(Clavicipitaceae )、虫草属[Cor d yceps (Fr.)Link.],英文名为Chinese Caterpillar Fungus [122].内含25%～32%粗蛋白及8.4%脂肪,富含缬氨酸、羟基缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸等18种氨基酸和虫草酸(C 7H 12O 6)、四羟基环己酸以及虫草菌素(Cordycepin )等成分,虫草菌素具有一定的抗生作用和抑制细胞分裂的作用[1].现代医学认为,冬虫夏草含有可能提高人体免疫力、抗疲劳、耐缺氧、抗衰老、抗肿瘤等的虫草素、虫草酸、核苷类、甾醇类,以及人体必需的氨基酸、有益微量元素、维生素、虫草多糖、SOD 等多种营养物质和有益的活性物质.临床研究表明,虫草具有多方面功效:如能显著提高人体免疫系统能力,治疗呼吸系统疾病;抗缺氧、抗疲劳,以提高运动能力;能调节心、脑血管;具有补肾壮阳、抗肿瘤、抗衰老、抗菌、抗病毒、消炎的作用以及美容护肤的效果等[2].目前,通过液态深层培养可以实现菌丝体的快速生产,同时通过优化生产条件,以提高其生物活性物质的含量,便于提取目的组分[3].此外,还可通过连续性地大规模工业化生产,消除某些难以控制的环境因子,缩短生产周期,降低生产成本,为深加工提供广泛的应用领域.因此,深层发酵培养冬虫夏草具有重要的实践和理论意义.本研究在已有工作的基础上,进一步优化了冬虫夏草菌丝体液体培养基,以期为今后工业化生产以及理论研究奠定更坚实的基础.Vol.28No.1J an.2008第28卷　第1期2008年1月天津师范大学学报(自然科学版)Journal of Tianjin Normal University (Natural Science Edition )1　材料与方法1.1　实验材料供试菌种:冬虫夏草(Cord yce ps si nensis (Berk.)Sacc.)C.S,由天津师范大学生物系蕈菌研究开发室提供.1.2　主要试剂马铃薯,棉籽壳,葡萄糖,蔗糖,蛋白胨,酵母粉, MgSO4・7H2O,KH2PO4,VB1,琼脂等均为分析纯.1.3　仪器设备YXQ G02手提式压力蒸汽消毒器,山东新华医疗器械厂;SW2C J22FD双人单面净化工作台,苏州净化设备有限公司;WDP型微生物多用培养箱,广东省医疗器械厂;TDZ52WS多管架自动平衡离心机,湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司;BS224S电子分析天平,北京赛多利斯仪器有限公司;THZ2D台式恒温振荡器,江苏太仓市试验设备厂;GZX29140ME电热恒温干燥箱,天津争光真空仪器厂.1.4　培养基1.4.1　斜面培养基配方PDA加富培养基:将去皮、除芽眼的马铃薯200g煮汁后加入新鲜无霉变的棉籽壳200g,葡萄糖20.0g,KH2PO43.0g,MgSO4・7H2O1.5g,琼脂20.0g(提前浸泡2h,除杂),VB14.0mg,定容至1L,p H自然.分装于18mm×180mm的硬质试管110～130支中,塞好棉塞,管口用牛皮纸包好, 7支1捆,常规高压灭菌,>45℃时,趁热将试管取出摆放于斜面上,24h和48h后查无菌,备用.1.4.2　初选培养基配方葡萄糖3%,蔗糖3%,蛋白胨0.1%,酵母粉0.25%,KH2PO40.1%,MgSO4・7H2O0.05%,VB1 0.01%,每100mL培养瓶中装液50mL,p H自然,并放入10粒直径为3mm的玻璃珠.常规高压灭菌. 1.4.3　复选培养基配方葡萄糖0.75%,蔗糖0.75%,蛋白胨0.025%,酵母粉0.0625%,KH2PO40.025%,MgSO4・7H2O 0.0125%,VB10.0025%,每100mL培养瓶中装液50mL,p H自然,并放入10粒直径为3mm的玻璃珠.常规高压灭菌.1.5　技术路线查阅相关文献,得到已有文献的主要配方[429] (表1)→通过分析,筛选出一种相对较优配方→将培养基各成分的用量分别作1.0,1/2,1/4,1/8处理,选出较适培养基→再用正交方法进行培养基内部质量比的调整,分析数据图表→得到最适培养基配方→进一步验证试验. 表1　冬虫夏草菌丝体液体培养基的主要配方g/L成分培养基序号12345678910葡萄糖30.020.020.020.020.030.020.020.020.0 KH2PO40.5 1.0 1.0 1.0 3.0 3.0 1.0 4.0 1.0 1.0 MgSO4・7H2O 1.00.50.50.5 1.5 1.50.50.20.5 1.0 VB10.10.10.10.10.10.10.10.10.10.1蛋白胨 2.0 4.010.0 1.010.0蔗糖20.020.030.0NaCl 1.00.2N H4NO3 1.0(N H4)2SO4 1.0 2.0鲜马铃薯汁80.0200.0200.0150.0玉米淀粉 5.0棉籽壳10.0酵母粉 2.5 5.0 1.0麦麸(煮汁)10.0CaCO3 3.0玉米渣 5.0黄豆粉 1.0ZnSO4 1.01.6　实验方法1.6.1　菌种的提纯复壮制备斜面培养基的同时准备4个平板培养基,用报纸包好,进行常规高压灭菌备用(步骤同上).待试管中菌丝体长满斜面后,在无菌条件下,挑取菌丝尖端部分,将大小约0.5cm2的母种块转接至平板培养基的中心位置,进行提纯复壮,选菌丝体长势健壮的备用.・9・第28卷　第1期　赵　润,等:冬虫夏草菌丝体液体培养基的优化1.6.2　菌丝的液体培养按表1中的配方在无菌条件下,挑取菌丝体尖端部分,接于培养基液面上,其菌种大小约0.5cm 2,每瓶5块,每个处理重复3次.静置48h 后放入摇床中培养,培养温度24℃,摇床转速80～90r/min 恒定.待144h 后取出,以3000r/min 离心20min ,去除上清液,再用无菌蒸馏水洗涤3次,置于60℃烘箱中烘干24h 至恒重,称重.取平均值加以比较,从而筛选出一种相对较优配方.1.6.3　比较实验用筛选出的配方,将培养基中药品的用量分别作1.0,1/2,1/4,1/8处理,每个处理重复3次;同时,将4个处理分别进行摇床旋转培养(摇床转速80～90r/min )和间断静置培养(每隔12h 间断手摇1次)加以比较,以菌丝体生物量干重作为衡量指标,从而得出最适培养方式(方法同上).1.6.4　正交分析实验根据上述实验结果,筛选出较适培养基配方,按L 9(34)正交方法设计4因素3水平实验(表2),共9个处理,具体数据见表3[10]. 表2　正交实验因素和水平g/L水平因素A B C D 12.5 2.50.200　0.40027.57.50.025　0.625312.512.50.450　1.025A 为葡萄糖,B 为蔗糖,C 为蛋白胨,D 为酵母粉(下同). 表3　4因素3水平L 9(34)正交设计g/L所在列因素ABCD实验12.5 2.50.200　0.400实验2 2.57.50.250　0.625实验3 2.512.50.450　1.025实验47.5 2.50.250　1.025实验57.57.50.450　0.400实验67.512.50.200　0.625实验712.5 2.50.450　0.625实验812.57.50.200　1.025实验912.512.50.250　0.4002　结果与分析2.1　初选实验结果一般来说,对蕈菌菌丝体而言,培养基主要由碳氮源并加少量无机盐和水溶性维生素组成,而碳氮源的种类与质量比对其生物量起着决定性的作用.由表4可见,配方7培养的冬虫夏草菌丝体的生物量最高,为13.67g/L ,表明此培养基的碳氮源种类与质量较为适宜. 表4　各配方生物量比较g/L 实验号123平均值18.448.128.228.262 3.82 4.20 3.76 3.933 4.02 4.12 4.12 4.0948.088.307.968.115 6.18 5.64 6.32 6.05613.0613.1213.1213.10713.4813.7813.7413.67811.0811.3211.3811.269 5.20 5.28 5.16 5.21109.729.669.609.662.2　实验结果比较由表5可见,间断静置培养的效果显著高于摇床旋转培养,其生物量更高.另外,配方7中1/8处理所得到的生物量相对较低,说明培养基提供给菌丝体的营养不够充足.而1.0,1/2处理的浓度质量比过高,使细胞外环境水势过低,不仅阻碍菌丝细胞对养分的吸收,而且导致部分营养物质残留,造成不必要的浪费;也容易造成假生物量即55.37g/L 和59.83g/L 的结果;同时加大了培养体系中菌丝体的分离难度,使得菌丝球内部供氧不足,有碍菌丝体细胞的生长与分裂.实验证明,1/4处理的养分供给适当,菌丝片断分布均匀且颜色亮白,液体培养基清澈透明,可获得较高的菌丝体生物量(图1).表5　不同培养方式的菌丝体生物量g/L 培养方式及成分浓度　123平均值1.0×摇床55.9454.6055.5855.371/2×摇床24.3824.1624.0024.181/4×摇床12.7012.1011.9012.231/8×摇床 5.30 5.50 5.64 5.481.0×静置59.9659.2460.2859.831/2×静置30.2429.3430.5830.051/4×静置14.9415.014.7214.891/8×静置7.207.567.087.28图1　摇床(左)与静置(右)培养比较2.3　正交实验结果极差越大,反映在该因素的水平变动时,生物量的变化越大,也就是说该因素对生物量的影响越大[10].对表3进行直观分析的结果见表6.根据表6对4个不同因素的极差值(R )进行比较,按照极差・01・天津师范大学学报(自然科学版) 2008年1月大小排列出各因素对生物量影响的主次顺序是B> A>D>C,即蔗糖是影响菌丝体生物量的主要因素,葡萄糖次之.表中K1,K2,K3之间的差异是4个因素取3个不同水平所引起的,K值较大的因素水平是较好的培养条件[11].根据水平之间K值大小可得到最佳培养基配方组合为A3B3C1D2,即葡萄糖1.25%,蔗糖1.25%,蛋白胨0.02%,酵母粉0.0625%.由表6中各因素水平的均值绘制冬虫夏草碳氮源筛选的效应曲线图(图2),结果表明,在上述各因素质量配比条件下,其菌丝生物量最大,为19.5g/L. 表6　碳、氮源筛选的直观分析g/L 所在列因素A B C D实验结果实验111114.040实验212228.927实验3133313.667实验421239.573实验5223113.153实验6231219.500实验7313212.753实验8321317.567实验9332114.940K18.888.7913.7010.71K214.0813.2211.1513.73K315.0916.0413.1913.60R6.217.252.553.02　K为均值,R为极差.　图2　碳氮源筛选的效果曲线图3　结论生物在其生长发育过程中,始终贯穿着呼吸作用.蕈菌是一类大型高等好氧真菌,在它一生中,均伴随着氧的参与[2].试验中,在培养瓶内放置若干玻璃珠,可促使气体交换,菌丝细胞可获得更多的氧气,促进其生长发育;而且在摇晃过程中,通过菌丝与玻璃珠之间的碰撞可产生大量菌丝片段,使蕈菌菌丝前端分裂的特点得以充分发挥.细胞吸水的主要方式是渗透吸水,细胞的渗透吸水取决于水势,细胞与细胞、细胞内与细胞外溶液之间的水分移动方向与速度决定于两者的水势差,水分从水势高处流向水势低处,差值越大,移动越快,反之则越慢.在菌丝体生长阶段,所需要的水分主要来源于培养基,培养基成分的浓度质量比过高,会使细胞内部失水,造成生理干旱,导致菌丝生长速度缓慢.因此,在研究过程中,将培养基中各营养成分的含量降低,最终获得平衡营养,以达优化液体培养基之目的.此方法也大大降低了实验成本,为今后进一步扩大再生产提供了基础依据;同时,也为开展原生质体的制备、DNA的提纯以及分子水平上的深入研究提供了便利.本研究采用正交方法L9(34)设计4因素3水平实验,以培养冬虫夏草菌丝体的生物量为衡量指标,得到了冬虫夏草菌丝体最适液体培养基配方为:葡萄糖1.25%,蔗糖1.25%,蛋白胨0.02%,酵母粉0.0625%, KH2PO40.025%,MgSO4・7H2O0.0125%,VB1 0.0025%;最适液体发酵条件为:培养温度24℃, p H自然,采用静置培养,间断性手摇(每隔12h 1次),培养时间192h,其菌丝体生物量平均为19.5g/L,是已有研究结果的1.2～1.5倍[9].参考文献:[1]　董洪新,吕作舟.冬虫夏草的研究概况[J].中国食用菌,2002(2):527.[2]　郭成金.蕈菌生物学[M].天津:天津科学技术出版社,2005:54255,2272230,2982299.[3]　Wang Zhaolong,Wang Xiaoxia,Chen Weiying.Inhibitory effectof Cordyceps sinensis and Cord yceps militaris on human glo2 merularmesangial cell proliferation induced by native LDL[J].Cell Biochemical Fungus,2000,18(2):93297.[4]　张建辉.冬虫夏草蛹虫草姬松茸的液体培养条件及其富锌硒的研究[D].沈阳:东北农业大学,2003.[5]　张伟.冬虫夏草液体培养基的筛选和液体发酵技术研究[J].中国医学生物技术应用杂志,2004(1):42246.[6]　王化河,李明奇.人工冬虫夏草发酵培养基的优化研究[J].数理医药学杂志,2005,18(3):2512252.[7]　尹萍,涂艳丽,尹辉,等.北虫草液体发酵培养基优化研究[J].江西农业学报,2006,18(4):102210.[8]　赵桂云,李风云,雷景敏,等.冬虫夏草菌丝液体培养碳氮源最佳组合的研究[J].中国林副特产,2002(4):20221.[9]　武忠伟,郭爱莲,张海滨.数理统计法优化冬虫夏草发酵培养基的研究[J].食品科学,2004,12(25):1082111.[10]　李春喜,姜丽娜,邵云,等.生物统计学[M].3版.北京:北京科学出版社,2005:1772184.[11]　高玉荣,卢艳明.灵芝菌丝液体深层发酵培养基的研究[J].中国酿造,2006(1):18220.(责任编校南凤仙)・11・第28卷　第1期　赵　润,等:冬虫夏草菌丝体液体培养基的优化。