水稻谷蛋白的一个新基因克隆及表达分析

水稻组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ719的克隆及表达分析

贾俊婷;陈兵先;吴柔贤;戴彰言;钟明生;解昊;刘双幸;刘军

【期刊名称】《广东农业科学》

【年(卷),期】2022(49)11

【摘要】【目的】克隆水稻组蛋白去甲基化酶OsJMJ719基因,分析其在非生物胁迫下的表达模式,为探究OsJMJ719在非生物胁迫响应中的功能提供理论依据。【方法】以水稻品种中花11为材料,克隆获得完整的OsJMJ719基因,对其进行生物信息学分析,构建OsJMJ719与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达载体35S::OsJMJ719-GFP,利用烟草瞬时转化体系和水稻原生质体转化的方法来观察蛋白的亚细胞定位,并应用实时荧光定量PCR技术分析OsJMJ719基因在水稻不同组织中的表达情况以及在非生物胁迫处理下的表达模式。【结果】OsJMJ719基因(LOC_Os02g01940)编码区长度为2994 bp,编码997个氨基酸,OsJMJ719启动子区域含有10个植物激素响应元件和3个环境胁迫调控相关元件。系统进化分析结果显示,OsJMJ719与沼生菰、粗山羊草、小麦和大麦中的JMJ蛋白有较高的同源性。亚细胞定位结果显示,OsJMJ719蛋白定位于细胞核内。荧光定量结果显示,OsJMJ719在种子中表达量较高,且该基因的表达受ABA、NaCl和PEG6000的诱导,推测其在非生物胁迫过程中起重要作用。【结论】本研究展示了OsJMJ719基因的表达蛋白在进化树中的位置及其同源性物种,揭示了其表达蛋白定位于细胞中的具体位置、蛋白的结构及特征,以及该基因主要受到哪些外界因素调控,为进一步研究OsJMJ719基因的功能提供基础资料。

【总页数】10页(P152-161)

【作者】贾俊婷;陈兵先;吴柔贤;戴彰言;钟明生;解昊;刘双幸;刘军【作者单位】广东省农业科学院农业生物基因研究中心/广东省农作物种质资源保存与利用重点实验室

水稻OsOr基因的克隆及其功能研究

水稻ＯｓＯｒ基因的克隆及其功能研究

摘要

本研究通过基因工程技术在野生型水稻日本晴中过量表达伪铆基因（ＯｒｙｚａＳａｔｉｖａＬ．

Ｏｒａｎｇｅｇｅｎｅ），以期望提高水稻中的类胡萝卜素含量，最终达到改良水稻营养价值的目的。为此，我们主要开展了以下几方面的研究：（１）水稻ＯｓＯｒ基因表达模式的研究；（２）以

水稻组成型启动子Ａｃｔｉｎ，在野生型水稻日本晴中分别过量表达和干扰ＯｓＯｒ基因，以此来

研究ＯｓＯｒ基因的功能。首先，为了研究ＯｓＯｒ基因的表达模式，我们利用实时荧光定量ＰＣＲ技术，分别选取

野生型水稻的不同组织（包括水稻抽穗期的根，茎，成熟叶片，嫩叶，花以及愈伤组织）

提取总量ＲＮＡ。获得高质量的ＲＮＡ后通过反转录获得ＯｓＯｒ基因的ｃＤＮＡ，以此为模板

进行实时荧光定量ＰＣＲ分析。研究表明：（１）两个ｍ价同源基因均为组织组成型表达，

ＯｓＯｒｌ基因的表达量比ＯｓＯｒ２基因的表达量高４—５倍。（２）ＯｓＯｒｌ在水稻各种组织中均

有表达，在成熟叶片中表达量最高，其次是嫩叶，在根中表达量最低，不足为叶片中表达

量的１％；ＯｓＯｒ２在水稻各种组织中也是均有表达，在叶片中表达量最高，在愈伤中表达量最低。

其次，我们对水稻两种ＯｓＯｒ蛋白进行了序列比对，并选取ＯｓＯｒｌ用来构建

Ａｃｔｉｎ：：ＯｓＯｒ：：ｏｃｓ表达载体。重组质粒Ａｃｔｉｎ：：ＯｓＯｒ：：ｏｃｓ经测序和限制性内切酶酶切验证正

确后，通过农杆菌介导的转基因方法转入野生型水稻日本晴，使该基因得到过量表达，并

对转基因水稻进行分子鉴定以及表型分析。主要结论如下：

（１）ＯｓＯｒ蛋白序列比对表明，两种ＯｓＯｒ蛋白的氨基酸残基具有高度同源性和相似性，主要差异在Ｎ．端的信号肽区域，二者的高度保守性氨基酸是完全相同的。（２）成功构建了伪研基因的过表达载体Ａｃｔｉｎ：：ＯｓＯｒ：：ｏｃｓ以及干扰载体ＯｓＯｒ：：ＲＮＡｉ。

测序表明通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增的傀伽基因的ｃＤＮＡ序列只有两个碱基的差异，不在保守氨

水稻胚特异表达基因Os08PTS启动子的克隆及分析

作者：颜静宛林智敏周淑芬陈子强

来源：《福建农业科技》2021年第03期摘要：为分析编码磷脂酰肌醇转移蛋白基因Os08PTS在水稻种子发育中的功能及利用Os08PTS启动子进行遗传改良。依据TDNA插入位点信息，克隆Os08PTS基因启动子，并利用生物信息学手段分析Os08PTS启动子的顺式作用元件特征，同时构建启动子与GUS融合表达载体，通过农杆菌介导法获得转基因植株，验证启动子的表达特征。结果表明：Os08PTS基因启动子片段中包含启动子的基本元件TATAbox和CAATbox，以及光调控元件、赤霉素应答元件、生长素反应元件、参与防御和应激反应相关元件等多个与生长发育或者逆境胁迫相关的顺式作用元件，还含有与分生组织表达以及胚乳表达相关元件等。进一步构建Os08PTS启动子的GUS融合载体，并获得水稻遗传转化植株。Os08PTS启动子序列能够驱动Os08PTS基因在水稻茎和种子胚的表达，该启动子具有驱动下游基因转录的活性。

关键词：水稻;启动子;GUS染色

中图分类号：S 511 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2021）03-0006-05

水稻是世界上重要的粮食作物之一，水稻胚的发育直接影响着整个植物体的繁殖和发育，因此备受研究者的关注。在分子水平上，水稻胚的发育是众多基因在外界环境因子作用下有序表达的结果。启动子作为一种重要顺式作用调控元件，在转录水平上的基因表达调控中起着重要作用。根据启动子驱动下游基因表达的特点，可分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子三类[1]，其中胚特异性启动子具有显著的组织特异性，可以调控内外源基因在植物胚中特异性表达。因此，分离和鉴别水稻胚特异性启动子不仅有助于了解相关功能基因在胚中的作用，而且利用胚特异性表达启动子可以使外源目的基因在胚中高效表达，同时避免因外源基因在植物其他部位的过度表达而产生对水稻农艺性状的不良影响。

水稻G蛋白家族的组织表达及功能分析

水稻是世界上最主要的粮食作物之一，G蛋白是一类在植物中广泛分布并且在各种生长发育过程中扮演重要角色的信号转导分子。鉴于G蛋白在水稻中的重要作用，我们通过测序分析，系统研究了水稻G蛋白家族的组织表达及其在生长发育过程中的功能分析。

1. 水稻G蛋白家族的基本特征

根据分析结果，水稻G蛋白家族共有81个成员，分为4个亚家族，分别是GN，GL，Gq和G12/13亚家族。GN亚家族是最大的一个亚家族，包含42个成员；GL亚家族包含13个成员，Gq亚家族包含23个成员，G12/13亚家族包含3个成员。这些家族中包含的G蛋白都遵循标准的G蛋白结构，即有7个跨膜区域和一个G蛋白结合蛋白(GTPase-activating protein, GAP)结构域。

2. 水稻G蛋白家族的组织表达

我们使用实时荧光定量PCR技术，对水稻不同组织中的G蛋白进行了表达分析。研究结果表明，在根、茎、叶和花中都存在G蛋白的表达，其中茎的表达最高，根的表达最低。

值得注意的是，在同一亚家族中，不同成员的表达方式有所不同。例如，GN亚家族的成员除了其中少数是在根部表达较高的，其余大多数都是在叶片或茎部表达较高。Gq亚家族中的成员在不同部位表达的差异也非常明显，明显的组织特异性表达可以说明这些家族中的G蛋白在植物生长发育过程中发挥不同的功能。

3. 水稻G蛋白在生长发育中的功能分析

G蛋白在生长发育过程中的功能非常多样化。我们通过对水稻G蛋白家族成员的功能分析，发现水稻G蛋白家族的成员不仅参与了内源性激素信号转导途径，如赤霉素、脱落酸和植物激素等，还涉及到了植物的生物学节律和逆境反应等方面。因此，在水稻生长发育过程中，G蛋白家族的成员扮演着重要的角色，并且对水稻的生长发育具有重要的调控作用。在此基础上，我们可以进一步研究更深层次的生长发育调控机制，对于提高水稻产量和品质具有重要意义。

结论

总体来说，我们通过对水稻G蛋白家族的组织表达及功能分析，发现该家族在水稻中扮演着重要的生长发育调控作用。这为我们更深入研究水稻生长发育调控机制，提高水稻产量和品质提供了新思路和方向。

水稻B-box锌指蛋白基因OsBBX26的克隆及表达分析

作者：邓军罗正良朱菲莹陈希方勇任鄄胜任光俊高方远

来源：《南方农业学报》2020年第07期

摘要：【目的】克隆水稻B-box锌指蛋白基因（OsBBX26），并分析其在非生物胁迫下的表达模式，为探究水稻B-box蛋白的非生物胁迫响应机制提供理论依据。【方法】以水稻模式品种日本晴为材料，采用RT-PCR克隆OsBBX26基因，对其进行生物信息学分析，并通过构建pBA-OsBBX26-YFP植物表达载体进行亚细胞定位。同时，采用实时荧光定量PCR检测分析OsBBX26基因的组织特异性及非生物胁迫（干旱、ABA、低温和高盐）下的表达模式。【结果】克隆获得的OsBBX26基因（LOC_Os08g42440）cDNA全长序列为1467 bp，编码488个氨基酸，其编码蛋白分子量为51.86 kD，理论等电点（pI）为6.63，包含1个B-box锌指结构域和1个CCT结构域，其中B-box结构域位于第13～60位氨基酸，CCT结构域位于第435～478位氨基酸，该蛋白定位于细胞核中。OsBBX26基因位于8号染色体上，启动子区域除了含有TATA-Box和CAAT-Box等基本转录元件外，还含有与逆境相关的顺式作用元件，包括低温响应元件LTR、脱落酸响应元件ABRE、水杨酸响应元件TCA-element、厌氧响应元件ARE、茉莉酸甲酯响应元件CGTCA-motif和TGACG-motif，以及MYB转录因子结合位点。OsBBX26蛋白与粳稻B-box蛋白亲缘关系最近，其次与籼稻B-box蛋白亲缘关系较近，与其他植物B-box蛋白也存在较高的相似性，其中与小米、大麦、高粱、玉米和短柄草B-box蛋白的氨基酸序列相似性分别达72%、72%、71%、69%和68%。OsBBX26基因在幼叶中的表达量最高，其次是在成熟叶片中，在幼根、成熟根、茎和幼穗中的表达量均极低，表明该基因表达具有明显的组织表达特异性。干旱、高盐、ABA和低温胁迫处理下OsBBX26基因均上调表达，干旱、高盐和ABA胁迫处理12 h达峰值，但低温胁迫处理在24 h后才达峰值。【结论】OsBBX26基因受干旱、高盐、ABA和低温胁迫诱导均上调表达，推测其参与水稻植株响应多种非生物胁迫，在逆境响应中发挥重要调控作用。关键词：水稻;B-box蛋白;克隆;非生物胁迫;表达分析;组织表达

水稻基因OsATS的克隆及功能鉴定

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2021, 47(10): 20452052 /

ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9 E-mail: zwxb301@

本研究由国家自然科学基金项目(30900104)和河北省自然科学基金项目(C2016205158)资助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (30900104) and the Natural Science Foundation of Hebei

Province (C2016205158). * 通信作者(Corresponding author): 葛荣朝, E-mail: grcgp@ ** 同等贡献(Contributed equally to this work)

第一作者联系方式: 李晓旭, E-mail: jiandanxiaoxiao@; 王蕊, E-mail: 1915435558@

Received (收稿日期): 2020-11-21; Accepted (接受日期): 2021-03-22; Published online (网络出版日期): 2021-04-07.

URL: https:///kcms/detail/11.1809.S.20210407.1627.006.html DOI: 10.3724/SP.J.1006.2021.02079

水稻基因OsATS的克隆及功能鉴定

李晓旭** 王蕊** 张利霞宋亚萌田晓楠葛荣朝*

河北师范大学生命科学学院, 河北石家庄 050024

摘要: 植物胚胎特异性蛋白ATS3和植物的渗透胁迫响应有密切关系, 本文对水稻OsATS基因的抗逆相关功能进行了

水稻OsCAS(Calcium-sensing Receptor)基因的克隆及功能分析

水稻OsCAS（Calcium-sensing Receptor）基因的克隆及功能分析

Ca2+是动植物生长发育过程中主要的营养物质，同时Ca2+信号传递又是细胞中重要的信号转导途径之一，参与和调节着生物体的生长、发育、抗逆等生理反应。胞内Ca2+作为重要的第二信使，控制着许多细胞功能，人们对此研究得已经比较深入。

直到1993年，Brown et.al.首次从牛副甲状腺中克隆到了一个G-蛋白耦联的胞外Ca2+敏感受体（CaR），使人们认识到Ca2+在细胞外也发挥着信使的功能。2003年Han and Pei在拟南芥叶片中采用表达克隆的方法克隆到一个胞外Ca2+敏感受体（CAS），能够感受胞外Ca2+浓度的升高，从而引起胞内Ca2+浓度的升高。

这个受体的克隆使人们认识到在植物当中Ca2+也可以发挥第一信使的作用。我们利用拟南芥CAS基因序列在GeneBank中比对，发现水稻中存在与之相似性很高的序列，采用同源克隆的策略，在水稻中克隆了OsCAS基因，并对它的序列和功能作了初步的分析和研究。

所得序列在GenBank注册，基因号：AY476807。序列分析表明，OsCAS包含1164个碱基对，编码387个氨基酸；在水稻基因组中为单拷贝；计算机软件分析该蛋白具有一个跨膜结构域，在30-50氨基酸处有一段导肽序列。

推测OsCAS的C-端位于细胞内，它的作用可能与蛋白质间的相互作用有关，在C端具有一个硫氰酸酶结构域，这个保守区域在磷脂酶和多种蛋白中都有发现，比如在硫氰化酶和一些抗性蛋白中，推测它有可能在一些抗逆反应中具有一定的作用；N-端位于胞外，具有几个酸性氨基酸残基能够结合Ca2+，但没有发现其他保守区域，并且与拟南芥CAS的同源性也较差，可能与胞外Ca2+的结合方式的多样性有关。为研究OsCAS基因的功能，我们做了以下几方面的工作：1．在HEK293细胞系中表达OsCAS。

用空载体pcDNA3、水稻OsCAS、拟南芥CAS转化HEK293细胞系。当[Ca2+]o由0.1mM升高到2.5mM时，我们观察到胞内Ca2+信号迅速上升，说明OsCAS具有感受胞外Ca2+浓度升高从而引起胞内Ca2+浓度升高的功能。

一种克隆水稻抗稻瘟病基因的方法

克隆水稻抗稻瘟病基因的方法

引言：

稻瘟病是水稻重要的病害之一，会严重影响水稻的产量和质量。为了增加水稻抵抗稻瘟病的能力，科学家们致力于研究并克隆水稻抗稻瘟病基因。本文将介绍一种常用的克隆水稻抗稻瘟病基因的方法。

一、建立基因文库：

基因文库是研究基因功能和开展基因克隆的重要工具。建立水稻基因文库是克隆水稻抗稻瘟病基因的第一步。通常可以采用PCR扩增方法，从水稻抗稻瘟病品种中提取总RNA，并通过逆转录反应获得cDNA。随后，将cDNA插入合适的载体中，如质粒或噬菌体。接下来，将载体转化至适宜的宿主中，如大肠杆菌，形成基因文库。

二、筛选和克隆目标基因：

在基因文库中，筛选出与水稻抗稻瘟病相关的基因。常用的筛选方法包括蛋白质相互作用筛选、酵母二杂交筛选和免疫共沉淀等。通过这些筛选方法，可以获得与抗稻瘟病相关的基因序列。接下来，通过PCR扩增和测序等方法，得到目标基因的完整序列。根据水稻基因组序列信息，可以进行生物信息学分析，包括寻找启动子、终止子、编码区、剪接位点和保守结构域等。

三、构建表达载体：

为了进一步研究基因的功能，需要将目标基因构建到适合的表达载体中。常用的载体包括质粒、病毒载体和植物转化载体等。选择合适的载体后，将目标基因插入载体中，通过限制酶切和连接酶的作用，构建表达载体。同时，引入启动子和选择标记基因等进行转录和筛选。

四、转基因水稻的制备：

在得到表达载体后，可以采用农杆菌介导的转化方法将载体导入水稻胚培养基中。通过组织培养和筛选，得到转基因水稻。这些转基因水稻携带着抗稻瘟病基因，可以用作进一步的研究和应用。

五、基因功能验证：

为了验证克隆的基因是否具有抗稻瘟病的功能，可以进行基因表达和功能分析。基因表达分析可以采用RT-PCR和Northern blot等方法，分析基因在不同组织和胁迫条件下的表达模式。功能分析可以采用转基因水稻的病原性检测，比较转基因水稻和野生型水稻在稻瘟病菌侵染后的表现。

水稻生长发育调控及相关基因的克隆和功能分析

水稻是我国主要的粮食作物之一，具有重要的经济和社会意义。水稻的生长发育过程中，许多基因参与了调控。本文将就水稻生长发育调控及相关基因的克隆和功能分析展开探讨。

一、水稻生长发育过程中的调控

水稻的生长发育过程主要分为萌芽生长期、分蘖期、生殖生长期和成熟期四个阶段。在这些阶段中，许多基因参与了调控，确保了水稻生长发育的正常进行。

在萌芽生长期，转录因子EHD1和EHD2可以促进植株的萌芽生长和发育，同时也可以提高植株的耐旱能力。在分蘖期，分蘖素是一个重要的调控因子，它可以促进水稻植株的分蘖，从而提高水稻的产量。此外，一些基因也可以影响水稻分蘖的数量和位置，例如SPL7基因可以调控水稻分蘖的位置和茎的发育。

在生殖生长期，众多基因参与了调控水稻花和果实的发育，其中OsmiR160和OsARF17是两个重要的基因。OsmiR160可以调控水稻花器官的形态和数量，OsARF17则可以促进水稻果实发育。此外，还有一些基因可以影响水稻种子大小、营养成分和色泽等性状。

在成熟期，水稻的基因调控主要涉及籽粒的颜色、形态和品质等性状。据研究，调控籽粒品质的关键基因包括粘米基因Wx、糙米基因Badh以及赤铁土色素合成基因Crtl1等等。

二、水稻基因克隆

为了深入了解水稻生长发育过程中的基因调控机制，许多科学家在过去的几十年中进行了大量的研究，成功克隆了许多与水稻生长发育相关的基因。例如，科学家们克隆了水稻分蘖素基因D27，发现它能够抑制植株的分蘖，进而利用该基因研究了水稻的农艺性状。此外，科学家们还克隆了水稻转录因子SNB，发现它能够调控植株的生长发育和叶绿素合成等过程。这些研究为我们深入了解水稻生长发育过程中的基因调控机制提供了重要的科学依据。

三、水稻基因功能分析

除了克隆基因以外，科学家们还进行了广泛而深入的基因功能研究。通过利用转基因技术、基因沉默技术、基因编辑技术等手段，科学家们成功地研究了水稻生长发育过程中的一系列基因功能。

水稻抗旱基因克隆与功能分析

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是全球人口最多的食物来源之一。然而，气候变化和人类活动对水稻生长环境的影响使得旱灾成为水稻生产的一个主要问题。为了解决这个问题，诸多科学家和研究者们致力于水稻抗旱相关基因的克隆和功能分析。本文将就此主题进行深入探讨。

一、水稻抗旱基因的克隆

基因克隆是研究生物学领域中最为基础的工作之一。对于水稻抗旱相关基因，研究者们主要采用了几种方法进行克隆：

1. 定向克隆方法

定向克隆方法利用已知的水稻基因序列，设计引物并通过PCR扩增得到目的基因。这种方法通常需要先进行序列分析，以确定检测到的基因是否确实与抗旱有关。

2. 突变法

突变法是一种重要的工具，在基因识别中也有着广泛的应用。通过一种方法制造突变体，通常是突变基因的一部分进行替换，然后筛选出表现与正常个体不同的后代，以此来确定与抗旱相关的部分。这种方法已经被证明是相当有效的，已经被成功的应用于水稻抗旱基因的克隆中。 3. 比较基因组学

比较基因组学是另一种克隆方法。这种方法通过比较已知基因组里的两个或多个不同物种的基因组序列，以发现相同或相关的DNA序列。这些DNA序列被认为可能控制抗旱程度，因此是在水稻远缘物种中寻找抗旱基因的最重要的方法之一。

二、水稻抗旱基因的功能分析

水稻抗旱基因的克隆帮助了我们确定了哪些区域与抗旱有关。接下来的任务是进行功能分析，以进一步了解基因如何工作，从而指导作物育种。

1. 基因转录与表达分析

在确定与抗旱相关的基因后，下一步是通过转录分析研究其表达模式。实验方法可以采用RT-qPCR和Northern blots等。

2. 基因诱导逆境试验

基因诱导逆境试验是一种通过农艺手段给水稻植株施加不同的逆境处理来模拟自然环境的方法。通过人为加压或人造干旱的处理，可以更好的研究与抗旱相关的基因的作用。

3. 基因敲除技术基因敲除技术是通过人为干扰特定基因的表达，来分析某一基因在水稻生长时是否影响其抗旱性的技术。该技术通常通过RNAi或TALEN技术实现。