病原真菌的分离与培养
一、植物病原真菌的分离培养及纯化技术2011
4．常规分离方法 •植物病原真菌的分离方法主要有两种：
组织分离法和稀释分离法。
•组织分离法是最常用的方法. •稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子 的病原真菌的分离。
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4.1 组织分离法
植物病原真菌的分离一般都是用组织分离法。 就是切取小块病健组织，经表面消毒和灭菌水 洗过以后，移殖在琼脂培养基平板上培养。 切取组织的大小要适宜，一般可将较大的 组织，在消毒液中消毒后切取中央部分，经灭 菌水洗过以后培养。
4、灭菌
制备好的培养基必须经过灭菌，方能使用。 分离培养时需要的培养皿等，要事先洗净、晾干 /烘干、包装好，进行干热灭菌。 灭菌方法：高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌 化学灭菌、以及辐射灭菌等。 高压蒸汽灭菌：15磅/英寸或1kg/cm20.1Pa/cm2,持续 15-30min，培养基及其它一些用品可用此法灭菌。
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4.2.1 孢子分离法
产生大量孢子的病菌如青霉属(Penicillium)
、交链孢属(Alternaria)、小丛壳属
(Glomerella)、拟茎点霉属(Phomopsis)及茎点属
(Phoma)等，则可配制成孢子悬浮液,以稀释法或
划线法分离。
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许多真菌的孢子在成熟时有弹射的作用，这样就可以
2）向装有病组织的小碟中加入70%酒精
（约半碟）进行表面消毒，十几秒后倒掉 酒精。
注:先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡，
减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间 较短(一般数秒至lmin)。
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3）向小碟中加入0.1%升汞或10%次氯酸钠
溶液（约半碟）进行表面消毒，处理时间 可自30秒至3分钟不等，然后倒掉废液。
病原物的分离培养和纯化
病原物的分离培养和纯化摘要：本实验采用组织分离法，在无菌操作条件下对一种山茶树叶部病原真菌进行分离培养和纯化。
该实验在PDA平板培养基的四个方向上各放置一片新鲜的病叶组织（3mm×3mm），四片病叶组织用0.1％升汞液消毒，时间分别为10s、15s、20s、25s。
设两组重复4d后观察发现，一个PDA平板培养基四个方向上都长出了菌落，而另一个只有10s和15s方向长出了菌落。
长出的菌落均较为单一，但观察可知消毒15s得到的菌落病原真菌生长最良好，因此15s 的消毒时间比较适合于这种真菌的分离。
在无菌条件下，用接种铲从消毒时间为15s的菌落边缘挑取两小块分别移入两支斜面试管培养基，在25℃左右恒温箱内培养，几天后，都被细菌污染了。
关键词:山茶病叶，真菌，分离培养，纯化，PDA培养基，斜面试管培养基目的意义在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。
然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫做分离。
分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一，了解其基本原理及方法，对植物病害描述、鉴定、命名以及植物病害接种体的培养等很多经常接触或者要使用到的试验操作步骤和研究手段都是很有帮助的。
通过本实验，我们可以了解植物病原菌分离培养和纯化的基本原理和方法，掌握实验室常用的消毒与灭菌方法，掌握培养基的制作和无菌操作技术。
1材料与方法1.1 试验材料1.1.1供试材料新鲜山茶树真菌病叶叶片1.1.2 试验仪器与用品真菌培养基、水、超净工作台、灭菌培养皿、试管、玻璃棒、铁架台、棉花、纱布、烧杯、接种铲、70％酒精、0.1％升汞、胶头滴管、天平、无菌水、酒精灯、火柴、镊子、剪刀、试管塞、报纸、扎绳、记号笔、不锈钢锅、电磁炉、高压锅蒸汽灭菌锅、恒温培养箱等。
1.2 试验方法1.2.1试管的制作用棉花和纱布制作试管塞，要求拔出时有明显声音，盖上时端部留3分之一且膨大，能够阻止杂菌的进入，拔出时力度合适。
植物病原真菌的分离培养精选文档
植物病原真菌的分离培养精选文档TTMS system office room 【TTMS16H-TTMS2A-TTMS8Q8-实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。
植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。
二、实验目的：植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。
三、实验材料及准备：1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。
2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。
真菌分离以及培养
一、（越南进境人参果炭疽病病原菌的分离鉴定2009年第3期植物检疫胡佳王卫芳¨）1.病原菌分离采用组织分离法，取病果病健交界果皮组织分离培养(马铃薯葡萄糖琼脂培养基[ PDA]，25℃，1 2 h荧光与1 2 h黑暗循环交替)，病菌纯化后保存备用。
2、病原菌培养特征和形态观测取病果病部组织进行徒手切片，显微观察分生孢子盘和分生孢子的形态特征；观察病菌的培养特性( P D A，2 5 o C，1 2 h荧l 2 h黑暗循环交替)；观测分离物分生孢子的形态和大小；从培养7 d的菌落中挑取分生孢子团，配制成孢子悬浮液，采用载片悬滴法，观测附着孢的形态及大小。
3、病原菌1 8 S r D N A序列扩增与测定将纯化菌株置于P D A、2 5 o C、1 2 h荧~／1 2 h 黑暗循环交替条件下培养5 d ，挑取菌落边缘新鲜菌丝，采用常规C T A B法提取病原菌基因组D N A作扩增模板，进行P C R扩增。
所用引物为真菌1 8 S r D N A通用引物G e o A 2和G e o l 1 【9 J 。
反应体系为2 5 总体积，d d H 2 O 1 6 ．3 7 5，1 0倍P C R缓冲液( 含Mg C 1 2 ) 2 ．5 I x L，d N T P( 2 ．5 mm o l ／L) 2 L ，G e M1 ( 1 0 I ~ mo l ／L ) 1 L ，G e o A 2 ( 1 0 l x m o L ／L ) 1 LT a q ( 5 u ／l x L ) 0 ．1 2 5 L，模板 D N A 2 L 。
反应程序为9 4 ℃预变性2 m i n ，9 4 o C 4 5 s ，5 5 o C 4 5 s ，7 2 o C2 mi n ，3 0个循环，7 2 ~ C延伸1 0 mi n ，4 ℃保存。
P C R产物送上海英骏生物有限公司纯化测序。
测序结果与G e n B a n k数据库中的已知序列进行B L A S T比较。
病原物的分离与培养
病原物的分离与培养病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。
一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。
所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养.病原物的分离与培养，需经以以几个步骤：1。
有关器皿的灭菌和消毒；2.制作培养基；3。
病原菌的分离4.病原菌的培养。
－、灭菌与消毒灭菌与消毒是两个不同的概念。
灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。
消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中,需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。
消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。
（一) 热力灭菌热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。
1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。
在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小,凝固越慢。
因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160～170℃），时间长1～2 h.但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧.干热灭菌使用的仪器是烘箱。
干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。
火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌.涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。
通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。
此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。
进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板,以防包装纸烤焦起火;在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮,表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂.2 湿热灭菌(1) 高压蒸汽灭菌此法是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，0。
植物真菌类病害组织病原菌的分离及抑菌圈实验[技巧]
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植物真菌类病害组织病原菌的分离及抑菌圈实验1、病原菌的分离培养及保存1.1材料：（1）病害组织（2）分离培养基（PDA培养基）：20%土豆煮汁，2%琼脂条，1%葡萄糖，蒸馏水，121℃高温灭菌（3）次氯酸钠（4）试管斜面培养基：成分为PDA培养基，121℃高温灭菌1.2方法：剪取作物病害部位，将病害部位用次氯酸钠表面消毒后，置于分离培养基上，然后放置于28℃恒温培养箱内培养。
7天后取出，通过菌落形态和孢子镜检挑选出所要分离的病原菌转接试管斜面，然后将斜面放置于28℃恒温培养箱内培养。
7天后取出，包好放于4℃冰箱内低温保存。
2、病原菌摇瓶菌丝体的培养及菌液的制备2.1材料：（1）试管斜面孢子（2）摇瓶培养基：20%土豆煮汁，1%葡萄糖，蒸馏水，121℃高温灭菌。
2.2方法：将试管斜面孢子转接到摇瓶培养基，然后将摇瓶放到220转/分的摇床上培养，2—3天后，摇瓶菌丝体长到一定的成熟状态（不同真菌菌丝体不同）后，取下摇瓶，放于4℃冰箱内低温保存，待需要做抑菌圈实验时，将摇瓶从冰箱内取出，用组织捣碎机将摇瓶菌丝体高速捣碎2分钟左右，至菌液状态。
3、供试药剂的抑菌圈实验3.1材料：（1）打碎的病原菌菌液（2）底层培养基：2%琼脂粉、蒸馏水，121℃高温灭菌。
（3）上层培养基：成分同PDA培养基，121℃高温灭菌。
（4）链霉素溶液：2400U/mL3.2方法：（1）融化底层培养基，待温度降至70℃，倒入测定木盘，放平至凝固。
（2）融化上层培养基，待温度降至54℃，用无菌移液管加入1mL链霉素溶液以防杂菌干扰；继续降温至48℃，用无菌移液管加入6—12mL的病原菌菌液后迅速晃匀后，倒入测定木盘，放平，待凝固后，即做成抑菌圈实验所用的测定盘。
（3）稀释供试药剂到制定浓度。
（4）在测定盘内摆放牛津杯。
（5）用P型移液器将稀释好的药剂滴入牛津杯内，滴液量为0.26mL/杯，然后盖上玻璃板，放置于28℃恒温培养箱内培养，培养时间为16—18小时。
【精品】植物病原真菌的分离培养
【精品】植物病原真菌的分离培养植物病原真菌的分离培养是植物病害学研究中的常规技术，它是诊断病原微生物的重要手段。
通过环境、罹病组织或病株上的真菌分离，可以准确地确定病原物种，病害发生的原因和病害防治的策略。
本文将介绍植物病原真菌的分离培养方法及其注意事项。
一、实验材料1. 植物体、果实或病株。
2. 无菌匀质培养基：具备营养丰富，pH约为7.0，含有适量的蔗糖、氨基酸、维生素和矿物质元素。
3. 无菌器具：试管、培养皿、匀质棒、无菌酒精灯、注射器等。
二、分离方法1. 选材：选择患病植物或病株，减少环境污染的干扰，以便于真菌分离和培养。
2. 分离：在实验室中进行无菌操作，将病株或罹病组织的表皮割去，注意不要带皮层或子叶，然后用30%的酒精或75%的酒精消毒5-10秒，沥干后放入无菌盘中。
3. 培养：将培养基煮沸，冷却后加入抗生素，避免杂菌污染，用培养皿接种盘，置于26℃左右的恒温箱中孵育。
初次孵育检查时间视病原真菌的生长速度而定，通常在1-2周内可见初生菌丝和菌落。
如果没有生长或生长极为缓慢，可能需要增加孵育时间或重新分离。
4. 子培养：将孵育的菌落通过匀质棒挑选到其他含有抗生素的培养基中，进行子培养，以保证分离出的真菌种属的准确性。
如培养子菌落中有杂菌或真菌菌落与初步分离的不一致，应重新分离。
5. 稳定培养：对于经过检查并确认是病原真菌的菌株，应进行深层冻存或贮存，以免失掉纯度，同时要做好鉴定记录。
三、注意事项1. 操作要无菌，防止环境污染，避免误诊。
2. 病株样品与周围环境隔离，减少环境干扰。
3. 选用适当的培养基，保证真菌菌落的生长和营养。
4. 操作时注意安全，避免接触真菌孢子、毒素等对人体有害的物质。
5. 菌落的检查应在暗的环境下进行，以免光照影响观察结果。
四、结语植物病原真菌的分离培养是诊断和定位植物病害的一个重要工具。
通过正确的操作方法和注意事项，可以准确地分离出病原菌，并对其性质和特征进行鉴定和确认。
实验七 病原真菌的分离
实验四柯赫（koch）法则实验------------病原菌的分离培养一、实验目的如何确定使植物致病的微生物？对于寄生性很严格的真菌类群，我们可以根据病症就能作出肯定的诊断，但对于那些腐生性较强而我们又不很熟悉的菌类，就比较困难。
因为在任何一种植物体上，几乎在任何时候都可以找到许多微生物，但它们不一定都是致病微生物，因此，需要通过各种实验手段加以检定。
通常是先冲病组织上分离培养出菌种，然后将这种菌体再接种到同种的健康植物组织上去，接种后如果植物体发生了同原先病例一样的症状，在将接种发病的植物病组织进行分离，如果获得的是与原来相同的菌体，就证明该钟病菌是该种植物病害的致病菌。
这就是柯赫（Koch）假定的规则。
本实验的目的就是要学习掌握研究植物病害的这一基本规则。
二、材料和用具大叶黄杨炭疽病新鲜标本；95%酒精，次氯酸钠，消毒培养皿，PDA培养基。
镊子，剪刀，酒精灯，火柴，纱布，刀片。
三、方法和步骤1、将已溶化的PDA培养基倾入消毒的培养皿中，每皿越倾入10-15毫升，注意倾入时将培养皿上盖稍稍揭起，轻轻倾入培养基（此过程要在酒精灯火焰旁进行），切勿使培养基沾污培养皿边缘，然后盖好盖，在桌面上徐徐摇转，使培养基在皿底分布均匀，冷却。
（注意：如果培养基的三角瓶中还剩有未用完的培养基时，要将瓶口在酒精灯火焰上消毒，塞好棉塞，以备再用）。
2、，选取病健组织交界处，剪成小段（块），大小约3平方毫米。
3、将病组织放入盛有次氯酸钠的消毒液中，消毒1-2分钟，取出后用灭菌水谁洗二次。
4、将已消毒的病组织用镊子（先将镊子插入95%酒精中，然后以火焰消毒）。
分别移置于培养皿中，每皿放五块，均匀分布，整个操作过程要迅速，准确，以尽量减少可能的污染。
5、用玻璃蜡笔在培养皿上注明物名，日期，姓名，然后将培养皿放入24摄氏度温箱中培养。
6、三天后检查病组织有无菌丝长出。
7、将新生菌丝移植到试管。
斜面培养基中培养，以备接种作菌种。
病原实验报告
病原物的分离培养和纯化病原物的分离和纯化摘要：本实验主要通过用对辣椒炭疽病或柑橘炭疽病病菌的分离和在pda培养基中对炭疽病菌消毒后做无菌培养然后转移到斜面培养的实验过程观察炭疽病菌的生长情况，了解分离与纯化病原物的基本原理与方法，掌握实验室常用的消毒灭菌方法，并掌握培养基的制作和无菌操作技术。
关键词：分离培养、炭疽病、pda培养基、灭菌前言柯赫氏法则(koch’s rule)又称柯赫氏假设(kochs postulates)或柯赫氏证病律，是确定侵染性病害病原物的操作程序。
如发现一种不熟悉的或新的病害时，就应按柯赫氏法则的四个步骤来完成诊断与鉴定。
诊断是从症状等表型特征来判断其病因，确定病害种类。
鉴定则是将病原物的种类和病害种类同已知种类比较异同，确定其科学名称或分类上的地位。
有些病害特征明显，可直接诊断或鉴定，如霜霉病或秆锈病。
但在许多场合难以鉴定病原物的属、种。
如花叶症状易于识别，要判断由何种病原物引起，就必须经详细鉴定比较后才能确定。
柯赫氏法则表述为：“(1)在病植物上常伴随有一种病原微生物存在；(2)该微生物可在离体的或人工培养基上分离纯化而得到纯培养；(3)将纯培养接种到相同品种的健株上，出现症状相同的病害；(4)从接种发病的植物上再分离到其纯培养，性【1】状与接种物相同”。
如果进行了上述四步鉴定工作得到确实的证据，就可以确认该微生物即为其病原物。
但有些专性寄生物如病毒、菌原体、霜霉菌、白粉菌和一些锈菌等，目前还不能在人工培养基上培养，可以采用其他实验方法来加以证明。
侵染性病害的诊断与病原物的鉴定都必须按照柯赫法则来验证，每个医学家和植物病理学家都应能熟练地运用。
柯赫氏法则同样也适用来对非侵染性病害的诊断，只是以某种怀疑因子来代替病原物的作用，例如当判断是否缺乏某种元素而引起病害时，可以补施某种元素来缓解或消除其症状，即可确认是某元素的作用。
1. 材料、仪器与用具1.1实验材料柑橘炭疽病或辣椒炭疽病病害部位、pda培养基（自制）1.2仪器用具超净工作台、培养箱、培养皿、试管、接种铲、接种针、70%酒精、0.1升汞、电炉等 2. 内容与方法2.1培养基的配制“培养基按成分及对成分了解程度分为天然培养基、半组合培养基、组合培养基三类，从物理性分为固体培养基、液体培养基两种，培养基不同，配制方法【2】不同。
简述植物病原真菌组织分离法和稀释(孢子)分离法的适用材料及优缺点-概述说明以及解释
简述植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料及优缺点-概述说明以及解释1.引言植物病原真菌是引起农作物疾病的主要病原体之一，研究植物病原真菌的组织分离方法和稀释（孢子）分离方法对于疾病的诊断和防治具有重要意义。
植物病原真菌组织分离法是通过从感染植物组织中分离出纯种的真菌菌落，从而研究其特性和致病机制。
稀释（孢子）分离法则是通过将真菌孢子稀释到一定浓度后分离，利用分离得到的孢子进行研究和防治。
本文将对这两种方法的适用材料、优点和缺点进行简述和总结，以期为植物病原真菌研究提供参考。
）分离法的缺点":{}}}}请编写文章1.1 概述部分的内容1.2文章结构文章结构是指文章的整体架构和组织方式，帮助读者更好地理解和掌握文章的内容。
本文主要介绍植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料及其优缺点。
具体的文章结构如下：1. 引言1.1 概述1.2 文章结构1.3 目的2. 正文2.1 植物病原真菌组织分离法2.1.1 适用材料2.1.2 优点2.1.3 缺点2.2 稀释（孢子）分离法2.2.1 适用材料2.2.2 优点2.2.3 缺点3. 结论3.1 总结植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料3.2 总结植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的优点3.3 总结植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的缺点在文章结构中，逐步展开对植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的介绍，包括适用材料、优点和缺点等方面的内容。
最后通过结论对两种方法进行总结和概括，使读者对这两种方法有个整体的认识。
1.3 目的本文的目的是对植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料及其优缺点进行简要描述和分析。
通过介绍这两种常用的真菌分离方法，旨在帮助读者更好地了解和选择适合的实验方法，提高病原真菌的分离效率。
具体而言，我们将详细介绍植物病原真菌组织分离法的适用材料，包括所需的培养基、植物组织、分离介质等。
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汞浸泡、擦拭
离ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ料
（2）清洁和消毒工作环境 为了避免污染，分离工作要求在无菌条件下进行，无菌室、超净工作台或
无菌操作箱（接种箱）是分离工作不可缺少的设施。在分离前，无菌室内用 紫外灯照射20-30min，以杀死室内空气中的大多数细菌。无菌操作箱可在分 离前用化学消毒剂清除箱内微生物。
若分离工作只能在普通房间进行时，必须对房间进行彻底清洁，关闭门 窗，避免空气流动，经过喷雾或在地上多洒些水，以除去空气及地面灰尘后 进行操作，也可获得较好的结果。工作前擦净桌面，最好铺上湿毛巾自认清 洁或纱布上，尽量避免工作过程中临时取物带来污染。工作人员要注意清洁， 工作前用肥皂洗手，分离前还要用70%乙醇擦拭双手。
园艺作物病虫害防治
学习情境1 蔬菜病虫害防治
子学习情境2:侵染性病害防治
病原真菌的分离与培养
一、目的要求 掌握病原真菌分离培养的基本原理、学会消毒、灭菌、倒平板、病原
真菌的组织分离和稀释分离的基本方法。 二、材料、用具和药品
新鲜的真菌病害分离材料、PDA的斜面与平板培养基、无菌室、超净 工作台或无菌操作箱（接种箱）、恒温箱、紫外线灭菌灯、酒精灯、火柴、 吸管、剪刀、镊子、接种环、接种针、福尔马林、70%乙醇、0.1%升汞、 无菌水和记号笔等。
3.切取病组织小块（叶斑病类）：取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离 材料)，选择典型的单个病斑，用解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取 小块(边长3--4mm)病组织数块。 提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入 的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此， 一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。
常压蒸汽
不宜用高压蒸汽灭菌的 培养基
煮沸
玻璃器皿
用30W、253.7nm波长的紫外灯照 无菌室、无菌箱、衣物
射20-30min.
等空气及物体表面
70%乙醇、2%煤酚皂（来苏水）、 无菌室、无菌箱 5%石碳酸液等喷雾
0.25%新洁尔灭、0.5%次氯酸钙 （漂白粉）擦拭
玻璃器皿、金属和木质 器皿等
70%乙醇、0.1%新洁尔灭、0.1%升 手（不可用升汞），分
马铃薯琼脂培养基（PDA培养基）的制作：
配方：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL，pH值自然。 （1）称量和熬煮：药品实际用量计算后，按培养基配方逐一称取去皮土豆。
土豆切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持 20－30min，用可用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。滤液补充 水分到1000ml。 （2）加热溶解：把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g（提前 搞碎），然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂 糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所需量。 （3）分装：按实验要求，将配制的培养基分装入试管或500ml三角瓶内。 分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染。
灭菌与消毒：
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般 培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。
常用的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌、 常压间歇式灭菌、超高温灭菌、过滤除菌、辐射灭菌、化学药品灭菌等方 法。
本实验培养基的灭菌常使用的是高压蒸汽灭菌，它是利用高温湿热空气 使菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的。
果实、块茎和枝杆等组织内部的病原菌可用脱脂棉蘸70%酒精涂拭病 部表面，通过火焰烧去表面酒精，重复进行2-3次，达到表面消毒。
提示：先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡，减少表 面张 力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短(一般数秒lmin)。 升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s至30min不等，一般情况下， 需时间3，5min。
三、内容与方法 分离是将病原物从发病组织上与其他微生物分开；培养是将
分离的病原物移到可以让这种病原物正常生长的营养基质（培养 基）上，从而获得其纯培养。 （一）分离前的准备工作
1.工作环境和分离用具的清洁和消毒 （1）常用的消毒方法：
常用消毒方法及其使用范围
方法 湿热法
辐射法 化学药品法
操作
使用范围
（3）消毒分离用具 凡是和分离材料接触的器皿和材料都要保持无菌。将分离用具
浸于70%乙醇中，使用时在灯焰上烧去乙醇灭菌，如此3次（刀、 剪、镊等不宜烧时过长，以防退火），再次使用时必须重复灭菌。 2、选择分离材料
分离材料应尽量新鲜，减少腐生菌混入的机会。从受病组织 边缘靠近健全组织的部分分离，可减少污染，同时这部分病原生 物处于较为活跃的状态，生长快，易分离成功。
高压灭菌锅操作过程
加水 装锅 盖盖 加热 当压力升为0.5kg/cm2时排 放冷空气 正式升压 保压（1.1kg/cm2，121℃，保持 20-30min） 停止加热 自然降压至零 排放余汽 开 盖 取出灭菌物品 趁热摆斜面 检验灭菌效果。
约50℃
倒平板
灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基
防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
四、病原真菌的分离方法： （一）组织分离法：
1.培养皿准备：取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上注 明分离日期、材料和分离人姓名。
2.培养皿平板制作：无菌操作法向培养皿中加入25%乳酸1-2滴 （减少细菌污染），然后将熔化而冷至45℃左右的马铃薯琼脂 培养基倒入培养皿中，轻轻摇成平面（分离细菌时则不能加乳 酸）。
5.接种：用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放4--6块。 提示：在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上
吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染。
(6) 培养：将培养皿倒置放人26-28℃左右恒温箱内培养。一般3—4d后 观察待分离菌生长结果。