细胞库建立标准
脐带血造血干细胞库基本标准
脐带血造血干细胞库基本标准脐带血造血干细胞库是保存新生儿脐带血中造血干细胞的设施，用于将脐带血中的宝贵干细胞存储起来，以备将来使用。
这些干细胞具有重要的临床应用前景，可以治疗许多恶性疾病、骨髓衰竭和免疫系统疾病。
基于其价值和潜力，脐带血造血干细胞库应遵守一系列的基本标准。
首先，脐带血的采集应该在婴儿出生后的第一时间内进行。
脐带血应通过连接到适当的集血袋或容器中的脐带采集包进行收集。
采集过程需要有专业医护人员进行操作，确保采集到足够的血量。
其次，采集过程必须符合安全标准，确保脐带血采集对母婴无害。
医护人员应使用符合卫生标准的器具，并且遵循相应的消毒程序。
采集过程中，应采取适当的采血速度和采血压力，以避免对新生儿造成伤害。
然后，采集的脐带血必须经过适当的处理和保存。
脐带血需要在采集后尽快送至脐带血造血干细胞库，并进行必要的检测和处理程序。
处理过程中，应遵守严格的质量控制流程，确保干细胞的存活率和质量。
脐带血库还需要具备适当的设施和设备，确保干细胞的长期保存。
库房应具备恒温、恒湿等条件，以确保保存的脐带血样本在良好的状态下保存。
此外，库房还需具备防火、防震和安全保障等措施，以保护脐带血样本的完整性和安全性。
同时，脐带血库应具备适当的管理制度和技术能力，确保脐带血样本的追踪和管理。
样本信息应进行详细记录，包括采集时间、采集者、处理记录等信息。
为了保障样本安全，库房应设立严格的准入和标识流程，确保只有授权人员才能接触和操作脐带血样本。
最后，脐带血库应符合相关法律法规的要求，并接受相关政府部门的监管。
脐带血库应申请相关的经营许可证，并定期接受卫生部门的检查和评审。
此外，脐带血库还应与相关医疗机构建立合作关系，确保干细胞的合理使用和临床应用。
总的来说，脐带血造血干细胞库的建设需要遵守一系列的基本标准，包括采血过程的安全与规范、样本的适当处理与保存、库房设施与管理制度的完善等。
只有确保符合这些标准，才能保证脐带血库的安全性、有效性和可持续发展。
细胞库资料
细胞库的类型与特点
根据细胞来源和保存方式的不同，细胞库可以分为以下几类
• 胚胎干细胞库：收集、保存和提供胚胎干细胞 • 成体干细胞库：收集、保存和提供成体干细胞，如神经干细胞、肌肉干细胞等 • 细胞系库：收集、保存和提供已经建系的细胞，如肿瘤细胞系、正常细胞系等 • 特殊细胞库：收集、保存和提供具有特殊功能的细胞，如免疫细胞、基因修饰细胞等
细胞库在生物技术其他领域的应用前景
• 生物技术创新：利用细胞库资源，推动生物技术的创新和发展 • 生物技术服务：利用细胞库资源，提供生物技术服务和支持 • 生物技术创新应用：利用细胞库资源，推动生物技术在各领域的应用
04
细胞库的质量控制与标准化
细胞库的质量控制标准与检测方法
细胞库的质量控制标准
• 细胞纯度：检测细胞中污染细胞的含量，确保细胞纯度 • 细胞活力：检测细胞的存活率，确保细胞的生物活性 • 细胞遗传稳定性：检测细胞的遗传稳定性，确保细胞的遗传特性
各类细胞库的特点
• 胚胎干细胞库：具有多向分化潜能，可用于组织修复和再生医学 • 成体干细胞库：具有自我更新和分化潜能，可用于组织工程和疾病治疗 • 细胞系库：具有稳定的遗传特性，可用于基因工程、药物筛选和疾病模型研究 • 特殊细胞库：具有特定的生物功能，可用于免疫治疗、基因治疗等
细胞库的建立与管理
细胞库的建立需要经过以下几个步骤
• 细胞收集：从不同组织中提取、分离和纯化细胞 • 细胞扩增：通过体外培养技术，使细胞数量增加 • 细胞保存：将扩增后的细胞冷冻保存于液氮中 • 细胞质量控制：对细胞进行一系列的质量检测，确保其活性和稳定性
细胞库标准化建设要点
细胞库标准化建设要点一、细胞库建设要求1.一般要求（1）细胞库的设计应符合GB19489第5章的原则要求。
其地形、地质、水文条件、占地面积及周围环境、交通状况等应满足建筑安全及使用要求。
（2）应满足样本储存和样本信息储存等功能的要求。
提供镜像保存服务的应在异地设立镜像储存库。
（3）细胞库总体平面布局应清晰合理，宜设置行政办公区域、样本库区域、档案存放区域、机房区域(电子信息储存)，且各区域相互独立，不应交叉混合使用。
2.样本库（1）功能分区样本库区域应根据使用需求和样本储存条件进行功能分区，应能够防止混淆、差错和交叉污染，至少包括:样本接收区(包含暂存区)、样木-80℃ 低温储存区、样本-150℃深低温储存区、气体储存区、物料储存区；（2）环境样本库区域环境应满足以下基本要求：通风应符合GB50346 的要求、环境温度应控制在16℃~28℃、相对湿度宜不高于60%、氧浓度应不小于19.5%、一般照明的照度值宜大于300LX，对照度有特殊要求的区域应设置工作照明，在冻存样本附近应使用冷光源照明、环境噪声排放限值应不大于60dB(A)、环境洁净度宜根据样本自身储存需求设置相适应的级别。
（3）设备设施样本库区域专业设施设备在符合对实验室设施和设备的要求基础上，还应满足以下要求：a应配置环境在线实时监测系统，如氧气监测系统、温湿度监测系统、洁净度监测系统等；b应配置设备在线实时监测系统，如液氨温度监测系统、液氮量监测系统、冰箱温度监测系统等；c宜设置液态氨气自动供应系统，系统管道安装应符合GB/T20801.4的要求；d应配备-80℃超低温冰箱，设备应能够保持箱体内部温度精确稳定，且具有记录和保存温度数据功能，配备远程报警接口，具备安全门锁设计；e应配备程序降温仪，设备应能够精确控温及快速降温，可连续显示腔体/样本温度，降温程序可编程；f应配备低温工作台，设备应具有高精度温度监测和记录功能，并与液氮输送管道连接；g应配备气相液氨罐，设备应能维持内部温度稳定，能实时探测并显示罐内温度和液位高度，且具备多功能的报警及密码保护等安全设置；h应配备备用贮存设备；i应配置环境消毒装置，如紫外灯、臭氧消毒机等；j应配备不间断电源。
喜格干细胞库建设之操作规范
《人间充质干细胞库建设与管理规范》DB33/T2030—2017SICOLAB干细胞库建设之操作规范范围：人间充质干细胞库、胎盘组织造血干细胞库的建设、操作规范、质量管理的基本方法。
适用：人间充质干细胞库、胎盘组织造血干细胞库建设与管理。
一、概要1、符合GB/T22278要求，并严格按照标准和规范执行；2、制定相应标准和管理规范（样本采集、运输、接收、分离、培养、冻存和复苏等涉及干细胞操作所有过程）；3、人组织样本采集由专业的医护人员完成，样本制备由经过专业培训的人员完成。
二、样本采集场所1、洁净手术室（无菌采集）：人组织样本。
2、无洁净级别要求：人月经血样本、乳牙样本（并保持个人基本卫生）。
3、Ⅱ级洁净手术室要求：新生儿脐带、胎盘、骨髓样本。
4、Ⅲ级洁净手术室要求：脂肪组织样本。
三、样本采集方法1、新生儿脐带来源间充质干细胞①胎儿分娩后，在距胎儿脐部5cm至8cm处，用止血钳分别夹住脐带上下两端，消毒剂消毒脐带。
②用消毒剪刀于两钳中间断脐，截取至少15cm无针孔的脐带置于无菌采集瓶中，同时加入保存液以浸没脐带组织。
贴条形码作为唯一标识。
③脐带的两端需要用手术线结扎。
2、新生儿胎盘来源间充质干细胞或造血干细胞①胎儿娩出后，待胎盘与母体完全分离，用生理盐水充分清洗胎盘，再用75%医用酒精快速冲洗表面。
②迅速将胎盘放入胎盘采集盒，再加入保存液予以全部浸没。
③采集盒密闭包装，并贴上条形码作为唯一标识。
3、人脂肪来源间充质干细胞①脂肪组织采集过程由整形科医生实施，需制定抽脂方案和术前术后的防感染措施。
②行脂肪抽吸术时应尽可能保证抽脂过程无菌，采集完毕转移至采集瓶中，确保密封，并贴上条形码作为唯一标识。
4、人骨髓来源间充质干细胞①骨髓组织采集前应联系负责骨髓采集医师，制定骨髓穿刺方案和术前术后的防感染措施。
②行骨髓穿刺术，抽取骨髓液，即时转移至无菌采集瓶中保存，确保密封，并贴上条形码作为唯一标识。
5、人子宫内膜来源间充质干细胞①组织来源：手术切除成年女性子宫内膜增厚组织或子宫内膜异位组织，置于采集液中保存，并贴上条形码作为唯一标识。
细胞模型建立的指导原则和标准操作标准第一版
细胞模型建立的指导原则和标准操作规范沈阳军区总医院医学实验科2012年6月15日第一部分细胞模型建立的操作环境1.细胞培养室结构布局的设计：细胞培养室的结构布局必须合理，才能够使细胞培养工作顺利地进行，否则，则可能因为环境不符合要求而导致细胞培养经常出现问题，甚至失败。
细胞培养室的选址要选择建筑物中僻静，少尘，人流走动稀少的位置。
细胞培养室的结构应该包括细胞培养间、更衣间、缓冲间等。
细胞培养间内仪器设备的摆放要合理，总的原则是防止污染、方便实验。
部分结构布局参见GMP格局设计。
2.细胞培养室的空气净化和消毒：细胞培养室的空气质量的优劣直接影响细胞培养的质量，有条件的单位应当安装空气净化设备，使细胞培养间的空气至少达到10万级，局部百级。
如果没有条件，细胞培养间的窗户应该密闭，以防止外界的灰尘进入。
细胞培养间应安装紫外线灯，在进行细胞培养前照射30分钟。
每周应用过氧乙酸或福尔马林熏蒸消毒以及其他化学消毒剂消毒和熏蒸(消毒和熏蒸方法见附件10)。
3.超净工作台和生物安全柜：超净工作台和生物安全柜是细胞培养必须的设备，在超净工作台和生物安全柜中，可以保持空气的质量达到百级，在这样的局部环境中进行细胞培养操作，可以避免因为空气所导致的污染。
在使用前必须对超净工作台和生物安全柜进行一系列预处理，（1）紫外线照射30分钟；（2）打开风机，运行10～15分钟；（3）用75%医用酒精擦拭工作台面和内面四壁。
（4）退场时也要用75%医用酒精擦拭工作台面和内面四壁后撤场。
详细操作按《BSC-1500ⅡA2-X型生物安全柜操作规程》执行。
4.细胞培养室内温度和湿度的控制：细胞培养室内温度和湿度不合适，容易导致细菌霉菌生长，极易引起细胞污染，因此，必须对细胞培养室内温度和湿度进行控制。
对温度的控制一般使用空调，将室内温度控制在20-25℃之间。
湿度过大容易导致霉菌生长，温度及相对湿度标准：温度18～26℃，相对湿度45～65%。
临床级细胞库建立标准
临床级细胞库建立标准临床级细胞库建立标准1.细胞来源控制细胞库的建立首先需要确保细胞的来源可靠且符合法律法规。
所有用于临床级细胞库的细胞应来自经严格认证的合法供体，并且应尽可能遵循无菌、无致癌物质和无其他有害物质的准则。
对于涉及人类组织和器官的细胞来源，应遵循伦理和道德原则，并获得相关伦理委员会的批准。
2.细胞质量标准为确保细胞的稳定性和安全性，需制定严格的质量控制标准。
这些标准应包括细胞的纯度、活力、数量、分裂能力、无菌性、支原体以及特定病原微生物检测等。
细胞应具备稳定的遗传背景，无致瘤性，并对各种刺激因素无过度反应。
在细胞培养过程中，应定期进行质量控制检查，以确保细胞库的细胞持续符合这些标准。
3.细胞培养条件细胞培养环境对细胞的生长和分化具有重要影响。
培养条件应包括适当的温度、湿度、气流、二氧化碳浓度以及无菌环境等。
同时，培养基和添加因子应满足细胞的营养需求，并防止细胞在培养过程中受到物理、化学或生物等因素的不良影响。
为保证细胞的稳定生长和繁殖，应定期监测和调整培养条件。
4.细胞传代与扩增为确保细胞的稳定性和可重复性，细胞库的细胞应采用标准化方法进行传代和扩增。
传代过程中应遵循无菌操作原则，并及时去除死细胞和污染物。
扩增过程应严格控制细胞的分裂和生长速度，以维持细胞的稳定状态。
为保证细胞的遗传稳定性和表型特征，应限制细胞的传代次数，并记录详细的细胞传代和扩增信息。
5.细胞冻存与复苏为长期保存细胞库的细胞，需采用冻存技术。
冻存过程中应选择适合的冷冻保护剂，并严格控制降温速度，以防止细胞内冰晶形成导致细胞损伤。
复苏过程中应缓慢加入冷冻保护剂，并逐步提高温度，以最大程度地保留细胞的活力和特性。
为保证细胞的存活率和稳定性，应定期进行冻存和复苏实验，并记录详细过程。
6.细胞鉴定与标记为确保细胞库中细胞的种类和来源清晰可辨，应对每种细胞进行鉴定和标记。
这可以通过形态学、免疫学、分子生物学等方法实现。
此外，为防止交叉污染，应对不同种类的细胞进行物理隔离或标记特殊的识别标志。
atcc细胞入库基本要求
atcc细胞入库基本要求
ATCC细胞入库基本要求
ATCC细胞库是一个重要的生物资源库，为科学研究和医学应用提供了无尽的可能。
为了保证细胞库的质量和可靠性，ATCC对细胞入库有一系列的基本要求。
下面将详细介绍这些要求。
细胞的来源必须明确，包括细胞的种类、来源组织和原始细胞的鉴定信息。
这些信息对于科学研究和应用非常重要，能够保证细胞的准确性和可追溯性。
细胞在入库之前必须进行一系列的检测和鉴定。
这包括细胞的纯度、活力和无菌性等检测。
只有通过这些检测，并且符合ATCC的标准，细胞才能被接受入库。
细胞的传代次数也是一个重要的指标。
细胞的传代次数过多会导致细胞老化和功能丧失，影响科研的可靠性。
因此，ATCC要求细胞入库时，传代次数必须在一定范围内。
细胞的存储条件也是一个重要的要求。
细胞在存储过程中需要保持稳定的温度和湿度，以确保细胞的长期保存和使用。
ATCC细胞库有着严格的存储标准，以保证细胞的质量和可靠性。
ATCC细胞库要求用户在使用细胞时需遵守一定的规定和条款。
这些规定包括细胞的使用范围、使用方式和使用时的注意事项等。
用户
必须遵守这些规定，以保证科研和应用的合法性和可靠性。
ATCC细胞入库有一系列的基本要求，这些要求保证了细胞的质量和可靠性，为科学研究和医学应用提供了重要的支持。
科研人员和用户在使用ATCC细胞库的时候，应该遵守这些要求，以确保研究的准确性和可靠性。
通过遵守这些要求，我们可以更好地利用ATCC 细胞库的资源，推动科学进步和医学发展。
细胞库建立标准-检测模板
细胞库建立标准-检测模板
简介
细胞库是细胞研究领域中非常重要的资源，为了确保细胞库的质量和可用性，建立细胞库的标准是至关重要的。
本文档旨在提供细胞库建立的检测模板，以确保细胞库符合相关要求。
检测项目及指标
1. 细胞存活率检测：
- 方法: 使用显微镜观察细胞形态及活力，根据细胞活力计算存活率。
- 指标: 细胞存活率应达到90%以上。
2. 细胞净化效果检测：
- 方法: 使用流式细胞仪检测细胞混杂率。
- 指标: 细胞混杂率应低于1%。
3. 细胞污染检测：
- 方法: 使用聚合酶链反应（PCR）或细胞培养和涂片染色等方法检测常见的细胞污染源，如细菌、真菌、酵母等。
- 指标: 细胞污染检测结果应为阴性。
4. 细胞株鉴定：
- 方法: 使用基因测序技术或比对已有基因库资料进行鉴定。
- 指标: 细胞株鉴定结果应与所宣称的细胞株一致。
5. 冻存样品质量检测：
- 方法: 检测冻存样品的凝聚物、活力和细胞数量等指标。
- 指标: 冻存样品质量应满足相关标准。
检测报告与记录
1. 所有的检测项目均应详细记录，并标明检测日期、检测方法和结果等信息。
2. 检测报告应存档，并可供需要时进行查阅。
结论
细胞库建立标准的检测模板提供了对细胞库质量的监控及评估方法。
通过严格按照这些标准进行检测和记录，可以确保细胞库的可靠性和可用性，为细胞研究提供有力的支持。
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细胞库建立概况一、对细胞库细胞基质总的要求(一)细胞系／株历史资料1.细胞系／株来源资料应具有细胞系／株来源的相关资料,如细胞系／株制备机构的名称,细胞系／株来源的种属、年龄、性别与健康状况的资料。
这些资料最好从细胞来源实验室获得,也可引用正式发表文献。
人源细胞系／株须具有细胞系／株的组织或器官来源、种族及地域来源、年龄、性别及生理状况的相关资料。
动物来源的细胞系／株须具有动物种属、种系、饲养条件、组织或器官来源、地域来源、年龄、性别、病原体检测结果及供体的一般生理状况的相关资料。
2.细胞系／株培养历史的资料应具有细胞分离方法、细胞体外培养过程及建立细胞系／株过程的相关资料,包括所使用的物理、化学或生物学手段,就是否有外源添加序列,以及细胞生长特征、生长液成分、选择细胞所进行的任何遗传操作或选择方法等。
同时还应具有细胞鉴别、检定、内源及外源因子检测结果的相关资料。
应提供细胞培养液的详细成分。
如使用人或动物源成分,如血清、胰蛋白酶、水解蛋白或其她生物学活性的物质,应具有这些成分的来源、制备方法、质量控制、检测结果与质量保证的相关资料。
(二)细胞库的建立细胞库的建立可为生物制品的生产提供已标定好的、细胞质量相同的及能持续稳定传代的细胞种子。
1.原材料的选择建立细胞库的各种类型细胞的供体均应符合细胞库细胞的检定中相关规定。
神经系统来源的细胞不得用于生物制品生产。
培养细胞用牛血清应来源于无牛脑海绵体脑病流行地区的健康牛群,其质量标准应符合规定(附录XIII D)。
不得使用人血清作为细胞培养液。
如需使用人血白蛋白,则须使用有批准文号的合格制品。
消化细胞用胰蛋白酶应进行检测,证明其无细菌、真菌、支原体或病毒污染。
特别应检测胰蛋白酶来源的动物可能携带的病毒,如细小病毒等。
用于生物制品生产的培养物中不得使用青霉素或β- 内酰胺(β-Lactam)类抗生素。
2.细胞培养操作的要求细胞培养生产人员应定期检查身体。
在生产区内不得进行非生产制品用细胞或微生物的操作;在同一工作日进行细胞操作前,不得操作或接触有感染性的微生物或动物。
3.建立细胞库细胞库为三级管理,即原始细胞库、主细胞库及工作细胞库。
如为引进的细胞,可采用主细胞库与工作细胞库组成的二级细胞库管理。
在某些特殊情况下,也可使用主细胞库一级库,但须得到国务院药品监督管理部门的批准。
(1)原始细胞库(PCB)由一个原始细胞群体发展成传代稳定的细胞群体,或经过克隆培养而形成的均一细胞群体,通过检定证明适用于生物制品生产或检定。
在特定条件下,将一定数量、成分均一的细胞悬液,定量均匀分装于安瓿,于液氮或一130℃以下冻存,即为原始细胞库,供建立主细胞库用。
(2)主细胞库(MCB)取原始细胞库细胞,通过一定方式进行传代、增殖后均匀混合成一批,定量分装,保存于液氮或一130℃以下。
这些细胞必须按其特定的质控要求进行全面检定,全部合格后即为主细胞库,供建立工作细胞库用。
(3)工作细胞库(WCB)工作细胞库的细胞由MCB细胞传代扩增制成。
由MCB的细胞经传代增殖,达到一定代次水平的细胞,合并后制成一批均质细胞悬液,定量分装于安瓿,保存于液氮或一130℃以下备用,即为工作细胞库。
冻存时细胞的传代水平须确保细胞复苏后传代增殖的细胞数量能满足生产一批或一个亚批制品。
复苏后的传代的水平应不超过批准的该细胞用于生产的最高限定代次。
所制备的WCB必须经检定合格,方可用于生产。
4.细胞库的管理每种细胞库均应分别建立台账,记录放置位置、容器编号、分装及贮存安瓿数量,取用记录等。
细胞库中的每支细胞安瓿均应注明细胞系／株名、代次、安瓿号、冻存日期,贮存容器的编号等。
冻存的细胞存活率应在90％以上。
冻存后的细胞,应至少做一次复苏培养并连续传代至衰老期,检查不同传代水平的细胞生长情况。
主细胞库与工作细胞库分别存放。
非生产用细胞应与生产用细胞严格分开存放。
(三)细胞库细胞的检定细胞检定主要包括以下几个方面:细胞鉴别、外源因子污染与内源因子的检测、致瘤性检测等。
必要时还须进行细胞染色体核型检查。
这些检测内容对于MCB细胞与WCB细胞均适用。
建立细胞库的实验室应至少进行一次MCB细胞的全面检定,检定应包括:细胞鉴别试验,细菌、真菌检查,支原体检查,外源病毒因子检查等。
每次建立WCB后,均应按规定项目进行检定。
1.细胞鉴别试验新建细胞系／株、细胞库(MCB与WCB)与生产结束时的细胞应进行鉴别试验,以确认为本细胞,无其她细胞的交叉污染。
细胞鉴别试验方法有多种,包括细胞遗传检测(如特征染色体标志)、遗传标志检测(如DNA指纹图谱、STR图谱、基因组二核苷重复序列)、免疫学检测(如组织相容性抗原、种特异性抗血清)与生物化学鉴别法(如同工酶试验)等。
可选其中一种或几种方法,但均须经国家药品检定机构认可。
细胞表型特征与遗传学特征相结合来判断,更有利于细胞鉴别。
2.细菌、真菌检查取细胞培养上清液样品3.支原体检查取细胞培养上清液样品,应为阴性。
4.细胞内、外源病毒因子检查应注意检查细胞系／株中就是否有细胞来源物种中潜在的可传染的病毒,以及由于操作带入的外源性病毒。
对细胞进行病毒检查的种类及方法,须根据细胞的种属来源、组织来源及细胞特性决定。
(1)细胞形态观察及红细胞吸附试验(简称血吸附试验)取混合瓶细胞样品,接种至少6个细胞培养瓶或培养皿,待细胞长成单层后换维持液,持续培养两周。
每日镜检细胞,细胞应保持正常形态特征。
细胞至少培养14天后,分别取1／3细胞培养瓶或培养皿,用0·2％～0、5％豚鼠红细胞与鸡红细胞混合悬液进行血吸附试验。
加入红细胞后置4～8℃30分钟,然后置20～25℃30分钟,分别进行镜检,观察红细胞吸附情况,结果应均为阴性。
新鲜红细胞在2～8℃保存不得超过7天,且溶液中不应含有钙离子或镁离子。
(2)不同细胞传代培养法检测病毒因子自MCB或WCB来源的细胞,分别接种下列三种单层细胞,包括猴源细胞、人源二倍体细胞与同种不同批的细胞。
每种单层细胞接种至少10000000个活细胞或裂解细胞及其培养上清液,每种细胞至少接种2瓶。
接种样品量应占维持液的1／4以上,培养至少14天。
取培养7天的上清液各一瓶,分别接种于同种细胞培养,盲传一代,继续培养7天,观察细胞病变并进行细胞形态观察及红细胞吸附试验。
若待检细胞已知可支持人巨细胞病毒(CMV)的生长,则应在接种人二倍体细胞后至少观察28天,应无细胞病变。
同时,应进行血吸附病毒检测,应为阴性。
(3)接种动物与鸡胚法检测病毒因子MCB细胞或WCB细胞以及增殖到或超过生产用体外细胞龄限制代次的细胞,须采用动物体内接种法进行外源病毒因子检测。
选用乳鼠、成鼠与鸡胚(两组不同日龄)共计4组,按表1所列方法进行试验与观察。
如试验到期有80％以上动物或鸡胚健存,此试验成立,结合其她检测确定结果。
对于新建细胞系／株,还应接种豚鼠与家兔(见表1)。
豚鼠主要用于检查细胞内结核分枝杆菌,在注射前观察4周,结核菌素试验为阴性者方可用于试验。
家兔主要用于检测猴来源细胞中就是否存在B病毒污染,也可用兔肾细胞培养法代替。
动物组要求数量接种途径细胞浓度／个活细胞·ml※接种细胞液量／ml·只- 观察天数结果判定乳鼠24小时内10(2窝) 脑内腹腔>10 7 O.01 O.1 21应健存成鼠15～20g 10 脑内腹腔>2X10 6 0、03 O.5 21应健存鸡胚①9～11日龄10 尿囊腔>5X106 O.2 3～4 尿液血凝试验阴性鸡胚5～6日龄10 卵黄囊>2X106 O.5 5 应存活豚鼠350～500g 5 腹腔>4X10 5 5.O 42 应健存,解剖无结核病变家兔1、5～2、5kg 5 皮下皮内②>2X10s 9、0 O.1×10 21 无异常,健存(4)逆转录病毒及其她内源性病毒或病毒核酸的检测可采用下列方法对MCB细胞或WCB细胞以及增殖到或超过生产用体外细胞龄限制次的细胞进行逆转录病毒的检测。
①逆转录酶活性测定采用敏感的方法,如产品增强的逆转录酶活性测定法(PERT)或其她检测逆转录酶的方法,检测细胞培养液上清中逆转录酶活性。
②透射电镜检查收集待检细胞,低速离心后,弃上清,沉淀中应含有1×10 7个细胞,且细胞存活率应不低于99％。
在沉淀中加入固定剂,于4℃保存或直接包埋后制备超薄切片,置于铜网上染色后透射电镜观察。
③感染性试验将待检细胞感染逆转录病毒敏感细胞,培养后检测。
根据待检细胞的种属来源,须使用不同的敏感细胞进行感染性试验。
这三种方法具有不同的检测特性及灵敏度,因此应采用不同的方法联合检测。
若逆转录酶活性检测阳性时,建议进行透射电镜检查或感染性试验,以确证就是否存在感染性逆转录病毒颗粒。
小鼠来源与其她啮齿类来源的细胞系或其杂交瘤细胞系有可能携带潜在的逆转录病毒。
因此,对于人一鼠杂交瘤细胞系则应进行特异性逆转录病毒检测。
如用于单克隆抗体生产的小鼠细胞系,则可不检测特异性的逆转录病毒,但在生产工艺中应增加病毒灭活程序。
(5)特殊外源病毒因子的检测应对MCB细胞或WCB细胞进行特殊病毒的检测。
检测病毒的种类应根据细胞系／株种属、组织来源等确定。
如鼠源的细胞系,可采用小鼠、大鼠与仓鼠抗体产生试验,检测其种特异病毒。
人源的细胞系／株,则应检测如人鼻咽癌病毒、人巨细胞病毒、人逆转录病毒、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒。
在某些情况下,也可能进行转化病毒的检测,如人乳头瘤病毒、腺病毒及人单纯疱疹病毒。
这些病毒的检测可采用适当的体外检测技术。
5.致瘤性检查某些传代细胞系已证明具有致瘤性,如来源于啮齿类的细胞系BHK21、CHO、C127胞等,或细胞类型属致瘤性细胞,如杂交瘤细胞,则可不必做致瘤性检查。
某些传代细胞系已证明在一定代次内不具有致瘤性,而超过某代次则具有致瘤性,如Vero 细胞,则必须进行致瘤性检查。
人上皮细胞系、人二倍体细胞株及所有用于活病毒疫苗生产的细胞系／株应进行致瘤性检查。
另外,新建细胞系／株必须进行致瘤性检查。
在某些情况下,用于人体细胞治疗及基因治疗的细胞也须进行致瘤性检查。
将来源于MCB细胞或WCB细胞的增殖到或超过生产用体外细胞龄限制代次,再进行致瘤性试验。
下述两种致肿瘤性试验方法可任选其一:①裸鼠至少10只,将细胞悬浮于适量无血清培养基中,使细胞浓度为每lml含5×10 7个细胞,每只裸鼠皮下注射或肌内注射O.2ml;同时用Hela细胞或HeP-2细胞设立阳性对照,阳性对照组至少10只,每只注射0.2ml含10 6个细胞;可用人二倍体细胞株作为阴性对照,阴性对照组至少10只,每只注射0.2ml含10 7个细胞。
②新生小鼠(3～5日龄),8～lOg小鼠10只,在出生后第0天、2天、7天与第14天,分别用O.1ml抗胸腺血清(ATS)或球蛋白处理,然后同上每只皮下接种10 7个活细胞。