流式细胞术样品制备技术(完整)
流式细胞仪的样本制备与数据分析指南
引言：
流式细胞仪（flow cytometer）是一种广泛应用于生物学、医学研究领域的仪器，能够对单个细胞进行快速、准确的分析和排序。为了获得可靠的实验结果，正确的样本制备和数据分析至关重要。本文将为您介绍流式细胞仪的样本制备和数据分析的基本指南。
一、样本制备
1.细胞准备
3.细胞染色
细胞染色是为了标记细胞内特定的分子或结构，以便在流式细胞仪中进行检测和分析。常见的细胞染色方法包括荧光染色、酶标记等。在选择染色方法时，需要考虑染色效果、染色稳定性以及对细胞活力的影响。
4.样本预处理
在进行流式细胞仪分析之前，有时需要对样本进行预处理，以消除背景噪音、增强信号等。常见的样本预处理方法包括细胞排序、细胞分选、细胞富集等。
结语：
流式细胞仪的样本制备和数据分析是流式细胞仪实验中至关重要的环节。正确的样本制备和数据分析方法能够提高实验结果的可靠性和准确性，为后续的研究工作提供有力支持。希望本文所提供的指南能够对您的流式细胞仪实验有所帮助。
二、数据分析
ห้องสมุดไป่ตู้1.数据获取
在流式细胞仪实验完成后，需要将得到的原始数据导出到计算机进行后续的数据分析。通常，流式细胞仪会输出FCS（Flow Cytometry Standard）格式的数据文件，其中包含了细胞的荧光强度、散射信号等信息。
2.数据清洗
在进行数据分析之前，需要对原始数据进行清洗，去除噪音、异常数据等。常见的数据清洗方法包括设置门控条件、排除双重tsne等。
3.数据解读
数据解读是流式细胞仪数据分析的核心环节。通过对数据的统计学分析、聚类分析、细胞子群分析等，可以获得关于细胞表型、细胞数量、细胞状态等信息。在数据解读过程中，需要结合实验设计和研究目的，从中提取有意义的结果。
流式细胞术样品制备技术(完整)
流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。
因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。
在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。
它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。
流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。
第1节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。
尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。
在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。
所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。
目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。
（一）酶消化法1 作用原理：对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。
酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。
常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。
胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。
流式细胞仪试验方法1.
流式细胞仪实验方法一、实验准备1.标本制备：2.最小化非特异性结合：二、凋亡1.凋亡的检测方法：网站和其它2.PI染色法3.A nn ex in V 法4.TUNNEL 法三、细胞因子1.激活的细胞因子2.CBA四、血小板1.活化2.活化检测3.网织血小板五、红细胞1.网织红细胞2.PNH3•胎儿红细胞六、肿瘤学1.DNA细胞周期2.蛋白3.多药耐药4.微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备（一直接免疫荧光标记法取一定量细胞（约1X106细胞/ml,在每一管中分别加入50卩的HAB,并充分混匀, 于室温中静置1分钟以上（，再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应（如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入，。
孵育20-60分钟后，用PBS（pH7.2—7.4洗1-2次,加入缓冲液重悬上机检测。
本方法操作简便，结果准确, 易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
（二间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液（约1X106细胞/ml,先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原一抗体一抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
、最小化非特异性结合的方法1•荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2.在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白(BSA,脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
流式细胞术样本制备.
样本制备实例:细胞表面蛋白荧光染色 (Immunofluorescence Staining原理:对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色(DIF 和间接染色(IIF 两种。
直接染色是指用直接联有荧光的抗体染色;而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合,然后再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。
荧光染色的方法在蛋白质检测中使用非常普遍,因为只要采用合适的抗体,几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。
但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同,以及临近通道串色的问题, 多色实验的基本原则是:最强的染料配表达最弱的蛋白,最弱的染料配表达最强的蛋白; 如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通道。
还需要考虑染料之间的溢漏、以及偶联染料已降解的问题。
现出现了 405nm 的激光激发的新型染料如 BV421、 BV605等为多色实验提供了更多的选择空间。
材料:∙被检测细胞∙FACS Lysing Solution (细胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀释到 1倍后使用∙相应的蛋白荧光染色抗体 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC步骤:1. 在 100 µL外周血加入抗体:a. 同型对照:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+Isotope PE 20 µL+Isotope APC 5 µLb. 单阳管:PB 100µL +CD4 FITC 20 µL+Isotope PE 20 µL+Isotope APC 5 µLc. 单阳管:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+CD8 PE 20 µL+ Isotope APC 5 µLd. 单阳管:PB 100µL +Isotope FITC 20 µL+ Isotope PE 20 µL+CD3 APC 5 µLe. 样品管:PB 100µL +CD4 FITC 20 µL+CD8 PE 20 µL+CD3 APC 5 µL2. 避光 15min3. 在每管中加入 2mL 裂解液,室温下避光孵育 10min4. 将裂解好的外周血离心 1200rpm , 5min ,去上清液5. 加入 2mL 鞘液,混匀6. 离心 1200rpm , 5min ,去上清液7. 加入 500 µL鞘液,混匀8. 3小时内上机(如果不能立刻上机, 2⁰ C -8⁰ C 避光保存样本对照:a. 同型对照(和使用的抗体同源、同亚型、同荧光标记:Isotope*3b. 单阳 CD4 加 Isotope PE & APCc. 单阳 CD8加 Isotope FITC & APCd. 单阳 CD3 加 Isotope FITC & PE细胞周期 (Cell Cycle原理:细胞在有丝分裂的过程中,核内的 DNA 会进行复制,造成 DNA 含量的波动。
流式细胞术样品制备(完整)
一、单层培养细胞分散为单个细胞
㈠贴壁的单层培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤： 1、将单层培养细胞(对数生长期)中的旧培养液倒掉。
2、加入少量0.25%胰酶，消化细胞，在倒置显微镜下观
察，见细胞稍变圆时，立即终止消化（假如含有10%胎 牛血清的培养基），收集细胞，离心后去上清，PBS液
洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液， 用振荡器使细胞分散。
实验证实，用化学试剂处理组织导致细胞 成活率降低，细胞产额较低，细胞碎片和细胞 丛结的量不稳定，因此，化学试剂处理方法不 单独使用，可与其他方法联合使用。 机械法常常造成严重的细胞损伤，较低的 细胞产量，为使细胞碎片不影响FCM检测结果， 需采用适当的方法除去碎片或尽量减少碎片。 酶学法对实体肿瘤的分散解聚是较理想的， 但是会对所测化学成分造成不良影响，所以根 据使用目的去选择合适的单细胞悬液制备方法， 才能获得理想的样品和更好的FCM结果。
3、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常 规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。
（二）悬浮培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤：
1、离心去除旧培养液，PBS液洗涤细胞一次，离心去掉 上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。
2、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常 规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。
注意事项： 一定将石蜡从组织中脱干净，检验是否将石蜡 脱净的方法是，弃去二甲苯，加入100%乙醇， 如无絮状物浮起，即视为石蜡已脱净，反之则 没有脱净。 消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞 核被消化掉。 切片不可过薄或过厚，过薄则碎片增多，影响 流式分析结果，过厚造成脱蜡不净或脱蜡时间 过长，一般以40-50μm为宜。
流式样本制备
流式样本制备
流式样本制备是一种通过流式细胞仪或流式细胞分选仪对细胞或颗粒物进行快速精确的分离和分类的技术。
它可以对样本中的细胞进行筛选、鉴定和排序，并根据细胞的特定性质进行直接分离和收集。
流式样本制备的步骤通常包括样本准备、样本染色、细胞排序和收集等过程。
下面是一个基本的流程：
1. 样本准备：首先需要将待分析的样本制备成单细胞悬浮液。
对于组织样本，可以通过机械或酶解法将组织细胞分离并制备成单细胞悬浮液。
对于细胞悬浮液，需要将其进行稀释，使得细胞以单个细胞的形式存在于悬浮液中。
2. 样本染色：将样本中的细胞或颗粒物经过染色，以便于流式细胞仪对其进行鉴定和分类。
常用的染色方法包括标记细胞表面标志物的流式抗体染色和使用细胞荧光探针的染色等。
3. 细胞排序：将染色后的样本通过流式细胞仪进行分析和鉴定。
流式细胞仪通过检测细胞的大小、形状、荧光染色强度等特性对细胞进行分类和区分。
4. 细胞收集：根据需要，流式细胞分选仪可根据细胞的特定性质（如荧光染色强度）对细胞进行分离和收集。
分选后的细胞可以进一步用于后续实验，如基因分析、细胞培养等。
注意事项：
- 在进行流式样本制备时，需要注意使用无菌的操作条件以避免细胞的污染。
- 样本准备和染色的步骤需要根据具体实验目的和方法进行优化和调整。
- 对于染色步骤，需要选择适当的流式抗体或荧光探针，并根据实验要求对样本进行处理和处理时间的控制。
流式细胞方法测定
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：网站和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
流式细胞操作步骤
流式细胞操作步骤：
1.制备脾细胞悬液1 107/ml
2.每个流式管（即样品）放入100ul 细胞悬液
3.每个样品中加入2ul CD4及5ul CD5 ，避光孵育30分钟
4.洗涤：每个样品中加入2ml的流式缓冲液，1200rpm下离心7分
钟，弃上清后漩涡混匀，再重复洗涤一次，共两次
5.每个样品中加入1ml Foxp3 固定/渗透液，混匀后4℃过夜
6.每个样品中加入2ml流式缓冲液
7.室温下1200rpm离心（400g×5min），弃上清
8.重复步骤（6），（7）
9.每个样品中加入小鼠血清2ul，室温下孵育15分钟
10.每个样品中加入2.5ul的Foxp3抗体，室温下孵育30分钟，并用
PE Rat IgG2a在平行管中空白对照
11.每个样品中加入2ml流式缓冲液，室温下1200rpm离心（400g×
5min），弃上清
12.重复步骤（11）
13.每个样品中加400ul流式缓冲液，上机。
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流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。
因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。
在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。
它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。
流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。
第1节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。
尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。
在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。
所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。
目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。
（一）酶消化法1 作用原理：对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。
酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。
常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。
胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。
不同酶对细胞和细胞间不同组分有特异作用，可根据分散组织类型来确定使用的酶类。
2 注意事项：①酶需要溶解于适当的溶液中，而这些溶液不致于造成酶效价降低；②要注意酶的使用浓度和消化时间；③要注意酶活性的PH值。
如胃蛋白酶在碱性环境中失去活性，胰蛋白酶在中性溶剂中活性不佳等；④要随时注意影响酶活性的其它因素，如酶的生产批号等。
3 方法学程序（1）将适合于酶消化的组织置于离心管中；（2）将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中；（3）一般消化20-30分钟（恒温37℃或室温），消化期间要间断振荡或吹打；（4）终止消化，收集细胞悬液，以300目尼龙网过滤，除去细胞团块，以低速成离心除去细胞碎片；（5）将制备好的单细胞悬液进行进一步荧光染色后上机检测，或保存备用。
（二）机械法机械法分散实体组织包括：用手术剪刀剪碎或者用锋利的解剖刀剁碎组织，用匀浆器匀浆，再用细注射针头抽吸细胞或用300目尼龙网滤出单细胞悬液；采用搓网法也能获得大量细胞。
机械法易造成细胞碎片和细胞团块，所以机械法常与其它方法配合使用。
1 剪碎法：①将组织块放入平皿中，加入少量生理盐水；②用剪刀将组织剪至匀浆状；③加入10ml生理盐水；④用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中；⑤离心沉淀1000prm,3-5min，再用生理盐水洗3遍，每次以低速（500-800prm）短时离心沉淀去除细胞碎片；⑥以300目尼龙网滤去细胞团块；⑦细胞用固定液固定或低温保存备用。
2 网搓法①将100目，300目尼龙网扎在小烧杯上；②把剪碎的的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边加生理盐水冲洗，直到将组织搓完；③收集细胞悬液，离心沉淀500-800prm，2分钟；④固定细胞或低温保存备用。
3 研磨法准备一只70ml研磨器。
①先将组织剪成1-2mm3大小组织块；②放入组织研磨器中加入1-2ml生理盐水；③转动研棒，研至匀浆；④加入10ml生理盐水，冲洗研磨器；⑤收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀500-800 prm，1-2 min，再以生理盐水洗3 遍，离心沉淀；⑥固定或低温保存细胞悬液，备用。
（三）化学处理法1 作用原理化学处理法是将组织细胞间起粘着作用的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散开来。
2 试剂的配制① 0.2%EDTA配制：称EDTA 0.2g，加入Hankˊs液100ml，封装高压消毒。
置0℃-4℃保存；②胰酶加EDTA配制：胰酶0.25g 加PBS（pH7.0）200ml，浓度0.125%，EDTA 0.2g加PBS（pH7.0）100ml，浓度0.2%。
各取40ml混合，分装置冰箱保存，用时过滤即可使用。
3 实验方法①将组织切成薄片，置入试管中；②首先加入EDTA液5ml，室温下0.5h，离心弃之；③再加入胰酶-EDTA液5ml。
在37℃恒温水浴振荡器30min；④用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000prm，5min。
再以生理盐水洗2-3次；⑤细胞固定或低温保存备用。
以上几种分散细胞的方法都是目前对实体组织解聚的常用的方法。
实验证明，用化学试剂方法处理组织导致细胞成活率低，细胞产额低，细胞碎片和细胞聚集的量不稳定；化学试剂可单独使用，也可与其它方法结合使用；机械法常常造成严重的细胞损伤，单细胞产量低；酶学法、化学法对实体组织的分散解聚较理想，但对所测化学成分有不良影响。
所以要根据实验目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，才能获得理想的样本和更好的FCM检测结果。
（四）注意事项①新鲜组织标本应及时进行处理保存，以免组织在室温下放置时间过长，产生中心组织坏死以及细胞自溶，影响FCM测定结果；②根据实验目的选择最隹的固定方法，以免由于固定剂的原因，造成FCM检测结果的不稳定；③酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH值、浓度等方面对酶消化法的影响。
④需注意不同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，就不一定采用酶学法或化学法；往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞；⑤在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好，因为胶原酶具有在Ca++、Mg++存在或在血清状态下不发生活性降低的特性。
二组织活检、窥镜取材标本单细胞悬殊液的制备正常组织、瘤组织和淋巴结等活检组织以及窥镜（胃镜、食管镜等）取材标本，由于材料较少，制备起来比较麻烦。
但其制备方法与实体组织基本相似。
1 取材后立即放入盛少许PBS液青霉素小瓶中；2 另取一只小烧杯，杯口用300目尼龙网盖住并用线绳固定好，并用PBS液湿润；取新鲜组织标本置尼龙网上；因标本量较少，尤其是窥镜取材只少要取3块以上；3 在操作前，先将剪刀用PBS液浸润一下，然后开始剪碎组织；4 先剪几下，视基本无组织块存在时，用原来装标本的青霉素小瓶中的PBS液，冲洗细胞均浆并过滤于小烧杯中；如果这时仍有可见组织块，再用剪刀剪碎，再加适量该PBS 液冲洗，直至网上无组织块为止。
这样可尽量多的收集细胞；5 细胞加固定液或低温保存，备用。
三石蜡包埋组织样本的制备石蜡包埋组织单细胞分散方法的建立，扩大了流式细胞术的应用围。
对大量临床随访资料通过病理包埋组织的流式细胞术分析，可以重新得到深入研究和利用。
现将常用的石蜡包埋组织制备单细胞方法介绍如下。
1 实验方法：①把石蜡包埋组织切成40-50um厚的组织片3-5片，或用乳钵研成0.5mm直径大小颗粒状，放入10ml的试管中；②加入二甲苯5-8ml, 在室温下脱蜡1-2 天，视石蜡脱净与否，更换1-2 次二甲苯，石蜡脱净后，弃去二甲苯；③水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度乙醇5ml，每步为10 min，去乙醇，加入蒸馏水3-5 ml，10 min 后弃之；④消化：加入2 ml 0.5% 胰蛋白酶（pH 1.5-2.0）消化液，置37℃恒温水浴中消化30 min，在消化期间，每隔10min 用振荡器振荡1次；⑤消化30 min 后，立即加生理盐水终止消化；⑥经300目尼龙网过滤，未消化好的组织可做第2次消化；⑦收集细胞悬液，离心沉淀1500 prm ,再以生理盐水漂洗1-2 次，，离心沉淀500-800 prm 去碎片；⑧保存细胞备用。
2 注意事项①一定将石蜡从组织中脱干净，一般脱蜡第1遍应在12小时左右，第2遍为30min左右，检测是否将石蜡已脱净的方法:是弃去二甲苯，加入无水乙醇如果无絮状物浮起，即可视为蜡已脱净，反之则蜡尚未脱净；②消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞核被消化；③切片不可过薄或过厚，过薄细胞碎片过多，影响分析结果；过厚造成脱蜡不理想。
④消化后的组织应先用眼科剪刀剪碎，然后再加胃蛋白酶消化，30min，37℃，然后用尖吸管吹打成悬液状；⑤消化后的组织悬液经过过滤后可能细胞数很少，这样就要将组织片放在300目尼龙网上，用底部圆滑的试管磨碎，再用PBS液冲洗一下；如此反复，就能得到较多的单细胞悬液。
四外周血单个核细胞样本的制备血液是天然的单个细胞分散的细胞悬液，血细胞在生理状态下呈分散的游离状态。
它是流式细胞分析的理想样品。
血液中的主要细胞成分为白细胞、红细胞和血小板；而其中白细胞主要成分又分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。
但在血细胞中一般检测单个核细胞较为多见。
1 外周血细胞样本制备方法的选择一般检测细胞大分子成分——DNA、RNA、总蛋白质、个别基因表达蛋白等，多采用淋巴细胞分离液分离法制备单个核细胞悬液。
这样可以从血液中分离出单个核细胞——淋巴细胞、单核细胞、幼稚血细胞和肿瘤细胞等。
外周血免疫细胞、细胞因子、某些基因蛋白、细胞表面标志检测可采用溶红细胞法。
2 单个核细胞样品制备程序：①取外周血2ml，肝素抗凝，用生理盐水将血稀释成4 ml ,混匀；②将稀释后血液沿试管壁徐徐加入4ml淋巴细胞分离液到液面之上，勿用力过大，以免造成血液与分离液混合，保持清晰的分层状态；③离心2000prm,30min,室温18-20℃，离心后可见试管的血液清楚的分为4 层，上层为血浆层，中层为分离液层（单个核细胞所处于血浆层和分离液层中间），底层为红细胞层，红细胞层上为粒细胞层；④用吸管将上层与中层之间的淋巴细胞层吸出收集到另1 试管中，用生理盐水洗2 遍，每次均以1500 prm ,10 min ,弃上清后即得到高纯度的单个核细胞悬液；⑤用适当的固定液固定或置低温冰箱保存待用。
五骨髓细胞单细胞悬液的制备1 制备方法（1）无菌抽取骨髓液0.5 ml；（2）将骨髓标本滴入1000u/ml肝素抗凝的1 ml PBS液中；（3）再加入PBS液稀释至10ml；（4）用吸管吸取5 ml 稀释骨髓液徐徐加入盛有4 ml 的人类淋巴细胞分离液液面之上；（5）在以上条件下，骨髓有核细胞分层在PBS-人类淋巴细胞分离液之间形成的界面上；（6）吸取有核细胞层，加入到10 ml PBS液中，混匀；（7）以1000 prm 离心 5 min ，弃上清；收集骨髓细胞，加固定液或置低温冰箱备用。