基因克隆及在大肠杆菌中的表达
基因在大肠杆菌中表达的实验流程
为了让一个基因在Escherichia大肠杆菌中做它的事情，我们首先要做的就是创造一个超冷的表达矢量。
这个矢量需要有一个涡轮充电的促
进器来恢复基因的表达，同时需要有一个ribosome绑定的站点（RBS）来确保基因像老板一样被翻译出来。
嘿，我们不能忘记一个
选择标记，像抗生素抗体基因，所以我们可以挑出细菌已经提取了
载体。
塞恩斯是真正有趣的部分——我们利用一些精致的分子克隆技术，把感兴趣的基因弹入载体中，比如用限制酶切开，然后像一个基
因谜题一样将其重新粘合起来。
对于一些细菌生物学刺激来说如何？
将表达矢量组合起来后，要通过变换等过程，将其粘入E。
coli细胞。
你用正确的抗生素将转化出来的细菌生长在藻类板上。
这使得只有
具有表达载体的细菌才能存活。
一旦你选择了细菌，你就抓住一个单
一的聚落，用它开始一个液体培养。
你让培养物生长到有很多细胞，
然后你可以打开你感兴趣的基因。
E。
coli基因表达的诱导是推进基因研究和生物技术创新的关键步骤。
必须根据表达矢量中使用的具体促进器，仔细选择适当的诱导器，因
为各种促导器对不同的诱导器表现出不同的反应。
在加入诱导物后，
培养物会受到指定孵化期的制约，以方便被利益基因编码的蛋白质的
合成。
在诱导过程之后，细菌被收获，通过SDS—PAGE，西部布局，酶活性测定等方法，彻底检查基因表达水平。
这些精心规划和执行的
实验使研究人员能够全面评估E。
大肠杆菌蛋白质产量的定量和定性方
面，从而为遗传工程和工业生物技术领域今后的研究和政策决定提供信息。
实验 7 外源基因在大肠杆菌中的表达(或诱导表达)和检测 (1)
显色反应： 在1ml样品（细胞与培养基混合液）中直接加入 X-Gal 200ul. 充分混合，观察颜色反应
（如果时间紧张，将三个样品带回，观察、拍照！）
Introduction of pRSET Vector The pRSET vectors are pUC-derived expression vectors designed for high-level protein expression and purification from cloned genes in E. coli. High levels of expression of DNA sequences cloned into the pRSET vectors are made possible by the presence of the T7 promoter. In addition, DNA inserts are positioned downstream and in frame with a sequence that encodes an N-terminal fusion peptide. This sequence includes an ATG translation initiation codon, a polyhistidine tag that functions as a metal binding domain in the translated protein, a transcript stabilizing sequence from gene 10 of phage T7, the Xpress. epitope, and the enterokinase cleavage recognition sequence.
鸡α-干扰素基因克隆及其在大肠杆菌中表达
Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄｓ ： Ｃｈ ｉ ｃ ｋ ｅ ｎ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｆ ｅ ｒ ｏ ｎ Ｏ ； Ｇｅ ｎ ｅ ｃ ｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ； Ｅ． ｃ ｏ ｌ ｉ ；Ｉ ｎ ｃ ｌ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ ｂ ｏ ｄ ｙ ； Ａｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ
Ｃｌ ｏ ｎｉ ｎｇ ｏ ｆ Ｃｈｉ ｃ ｋ ｅ ｎ Ｉ ＦＮ－ ｕ Ｇｅ ｎｅ ａ ｎｄ Ｉ ｔ ｓ Ｅｘ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ Ｅｓ ｅ ｈ ｅ ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ ｃ ｏ ｌ ｉ
Ｗａ ｎ ｇ Ｌ ｅ ｉ ，Ｌ ｉ ｎ ｇ Ｈｏ ｎ ｇ ｌ ｉ ， Ｗａ ｎ ｇ Ｈｏ ｎ ｇ ｈ ｕ ａ ，Ｓ ｕ ｎ Ｈａ ｉ ｘ ｉ ｎ
ａ ｎ ｄ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｅ ｄ ｂ ｙ Ｓ ＤＳ － Ｐ ＡＧＥ ａ ｔｅ ｆ ｒ ｉ ｎ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗｉ ｔ ｈ Ｉ Ｐ ＴＧ． Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｉ ｎ ｄ ｉ ｃ ａ ｔ ｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｗａ ｓ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｅ ｄ ａ ｓ ｉ ｎ ｃ ｌ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ ｂ ｏ ｄ ｙ ． Ｔ ｈ ｅ
中国动物检疫 ２ ０ １ ３年第 ３ ０卷第 ２期
主持 人： 胡藕祥
鸡 Ｑ一 干扰 素基 因克隆及其在大肠杆菌 中表达
王 雷 ，凌红 丽 ，王宏华 ，孙 海新
（ 青岛宝依特生物制药有限公司，山东青 岛 ２ ６ ６ １ １ ４ ）
摘 要 ：根据 Ｇｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ中鸡 Ｉ Ｆ Ｎ． ０基 因设 计 引物对，利用 Ｐ Ｃ Ｒ技术克 隆并 测定 了 Ｓ Ｐ Ｆ鸡的 Ｉ Ｆ Ｎ． Ｑ基 因，再在成 熟肽基 因 两侧 设计 一对 引物 ，分别加入合 适的酶切位 点 ，将其 亚克隆在表 达载体 ｐ Ｅ Ｔ上 ，转化 ＢＬ ２ １（ Ｄ Ｅ ３ ）后用 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ诱 导表达 ，用 Ｓ ＤＳ — Ｐ ＡＧＥ电泳分析表 达形 式，结果 为蛋 白以包涵体形式表 达。提取 的 包涵体用 ７ｍｏ ｌ ／ Ｌ盐酸胍变性 ，利用胱氨 酸一半胱氨 酸
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验一般分为以下几个步骤：
1. 构建表达载体：将待表达的基因克隆到适当的表达载体上,如常用的pET、pGEX等载体中。
2. 转化大肠杆菌：将表达载体转化到大肠杆菌细胞中。
可以通过化学方法、电转化、冷冻复苏、热激转化等方法进行。
3. 诱导表达：在大肠杆菌细胞进行生长至适当时期后,添加适宜浓度的诱导剂,如IPTG等,诱导待表达基因蛋白的合成。
4. 细胞收获和破碎：诱导一定时间后,收获大肠杆菌细胞并进行破碎,以获得待表达蛋白。
5. 蛋白提取：对细胞破碎物进行离心、超滤等步骤,去除残余细胞构成和杂质,得到含有待表达蛋白的上清液。
6. 纯化和分析：将上清液进行分离、纯化、鉴定,以确定表达蛋白相应的分子量、酶活性等。
在以上步骤中,实验者需要进行质控和评估,确认实验步骤是否正确和表达蛋白是否达到预期,以确保实验结果的可靠性和准确性。
苹果PGIP基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
苹果PGIP基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达熊帅;张军科;谌悦【摘要】[目的]从富士苹果幼果果实中克隆多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因,并进行原核表达,为进一步研究PGIP的生物学功能奠定基础.[方法]根据Genbank 中已经发表的苹果PGIP基因序列设计引物,采用RT-PCR从苹果果实中扩增PGIP 基因cDNA,回收目的基因片段并连接到pMD18-T载体,鉴定后进行测序.然后将PGIP全长cDNA和去信号肽的cDNA导入到pET-32a(+)表达载体中,分别获得融合表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP-X,将其分别转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用不同终浓度IPTG进行诱导表达,收集表达产物并进行SDS-PAGE电泳.对pET-PGIP-X基因工程菌表达产物的可溶性进行检测.[结果]苹果PGIP cDNA序列长为1 091 bp,编码区为993 bp,可编码330个氨基酸残基,将其命名为MdPGIP;重组表达质粒pET-PGIP和pET-PGIP.X在宿主大肠杆菌中分别表达出分子质量约49.6和46.1 ku的融合蛋白,pET-PGIP-X表达产物以包涵体的形式存在.[结论]成功克隆了苹果PGIP基因,并在大肠杆菌中获得高效表达.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(038)002【总页数】7页(P123-128,134)【关键词】苹果;多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白;基因克隆;内源多聚半乳糖醛酸酶【作者】熊帅;张军科;谌悦【作者单位】西北农林科技大学,园艺学院,农业部西北园艺植物种质资源利用重点开放实验室,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,园艺学院,农业部西北园艺植物种质资源利用重点开放实验室,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,园艺学院,农业部西北园艺植物种质资源利用重点开放实验室,陕西,杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】S661.1植物细胞壁可以有效地阻碍植物病原真菌的侵染，但植物病原真菌可分泌一系列的酶来降解植物细胞壁。
多亚基蛋白表达 大肠杆菌
多亚基蛋白表达大肠杆菌大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴性菌，广泛存在于自然环境中，同时也是一种重要的实验室模式生物。
多亚基蛋白（subunit protein）是指由多个亚基组成的蛋白质。
在大肠杆菌中，多亚基蛋白的表达是一种重要的研究手段。
多亚基蛋白的表达过程可以分为三个主要步骤：基因克隆、表达载体构建和大肠杆菌转化。
基因克隆是制备多亚基蛋白表达所必需的第一步。
研究人员首先需要从某种生物体中提取目标蛋白的基因序列，并使用聚合酶链式反应（PCR）扩增得到目标基因。
接下来，将扩增得到的基因与表达载体进行连接，通常采用限制性内切酶切割和连接酶连接的方法。
最后，将连接好的基因插入到大肠杆菌的表达载体中。
接下来，通过表达载体构建，将目标基因导入大肠杆菌中。
表达载体是一种能够在大肠杆菌中稳定复制并表达目标基因的DNA分子。
常见的表达载体包括质粒和噬菌体。
将表达载体导入大肠杆菌后，通过培养和筛选，筛选出含有目标基因的大肠杆菌。
将含有目标基因的大肠杆菌进行培养和诱导表达。
培养过程中，研究人员需要提供适宜的培养基，以提供菌体生长所需的营养物质。
同时，还需要对培养条件进行优化，如温度、pH值和氧气含量等。
在诱导表达过程中，可以通过添加诱导剂，如异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），来激活目标基因的表达。
多亚基蛋白在大肠杆菌中的表达具有许多重要的应用。
首先，通过对目标蛋白进行表达和纯化，可以用于蛋白质结构和功能的研究。
其次，多亚基蛋白的表达还可用于制备抗原，用于疫苗研究和诊断试剂的开发。
此外，通过对多亚基蛋白表达的调控研究，可以深入了解蛋白质合成和调控机制。
总结起来，多亚基蛋白在大肠杆菌中的表达是一种常用的研究手段。
通过基因克隆、表达载体构建和大肠杆菌转化等步骤，可以将目标基因导入大肠杆菌中，并通过培养和诱导表达得到目标蛋白。
多亚基蛋白的表达在生物学研究中具有广泛的应用价值，可以用于蛋白质结构和功能的研究，以及抗原制备和蛋白质调控机制的研究。
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程通常包括以下步骤：
1. 克隆：首先需要将目标基因克隆到适当的表达载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，然后将其与表达载体连接，形成重组质粒。
2. 转化：将重组质粒转化到大肠杆菌细胞中。
可以使用化学方法（如热冲击法）或电穿孔法将质粒导入细胞。
3. 选择：转化后，将细胞分散在含有适当抗生素的琼脂平板上培养。
只有带有重组质粒的细胞能够存活并形成菌落。
4. 培养：将含有重组细胞的培养液转移到适当的培养基中，并在适当的条件下培养。
这可能包括调节温度、pH值和搅拌速度等。
5. 表达：在培养期间，目标基因会被大肠杆菌细胞转录和翻译为蛋白质。
使用适当的启动子和调控序列，可实现目标蛋白的高效表达。
6. 细胞破碎：一旦细胞达到最佳表达水平，就需要破碎细胞以释放目标蛋白。
这可以通过多种方法实现，如超声波、高压破碎或化学方法。
7. 纯化：通过使用各种分离和纯化技术（如亲和层析、凝胶过滤、离子交换层析等），从细胞裂解液中纯化目标蛋白。
以上是在大肠杆菌中表达重组蛋白的一般流程。
具体的步骤和条件可能因实验设计和目标蛋白的特性而有所不同。
GAPC2基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达
Ａｒｓｏ ｍ ｅ ｃ ；其 他 常用 试 剂 购 于成 都 博瑞 克 生 物 公 司 。 １ ２ 方 法 ． １ ２ １ 基 因 全 长的扩 增 根 据 Ｎ Ｂ 上 已发表 的Ｇ Ｐ ２的基 因序 列 ．． ＣＩ ＡＣ 设 计特 异 性 引物 ，引 物序 列如 下 ：
—
因 片段 。
匕 弓 物 为Ｆ： ５ 一 Ｇ Ｇ Ｔ Ｃ Ｔ Ｇ Ｔ Ａ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ｃ Ｇ 一 ’， 游 Ｉ ’ＣＧＡＣＡＧＣ ＧＣＡＡＧＴＡＡ ３ Ｆ 弓 物 为Ｒ ５ 一 Ｃ ｃ Ｔ Ｇ ｃ Ａ Ａ ｃ ＧＡ Ｇ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ａ Ｔ Ａ Ａ 一 ’ 中设 计 的 酶 切 位 点 为 Ｂ ｍ Ｉ Ｓ ｌ 。 以拟 南 芥 ｃ Ｎ 为模 板 ，加 ａＨ和 ａＩ ＤＡ
Ｌ１ ａ的 Ｂ 三 磷 酸 一 油 醛 脱 氢 酶 （ ｌ Ｃ ｒ １ ｅ ｙ ｅ ３ Ｐ ０ Ｐ ａ ｅ Ｇ Ｐ ２ 化 大 肠 杆 菌 Ｂ ２ 感 受 态 细 胞 中 ，在 含 有 Ｋ ｎ Ｌ 平 板 上 甘 Ｇ Ｙ ｅ ｅ ｄ ｈ ｄ 一 一 ｈ ｈ ｔ Ａ Ｃ 转 Ｓ ｄｈｄｏｅａｅ ｅｙｒｇｎｓ， 忉 是 高 等植 物 体 内糖 酵 解 和 糖异 生 途 径 中 培 养 过 夜 。挑 取 菌 落进 行Ｐ Ｒ 定 ，０ ８ 的琼 脂 糖凝 胶 电泳 检 测 Ｃ鉴 ．％ 的 关 键 酶 ，能 够 催 化 ３ 磷 酸 甘 油 醛 转 变 为 １ ３ 二 磷 酸 甘 油 酸 。 一 ，一 目的条 带 大 小 。 ．． 位于细胞质中 的 是 由４ 同种 亚基 个 组 成 的 多 聚 体 ，而 １ ２ ４ 融 合 蛋 白的 诱 导 表 达 挑 取 单 个 含 表 达 质 粒 的 阳 性 菌 落
１材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
重 悬 沉 淀 。 分别 取 ２ ｌ 液 重 悬 于Ｓ Ｓ Ｐ Ｇ 上 样 缓 冲 液 中 ， ０ 菌 ｕ Ｄ —Ａ Ｅ ｌ０ 煮沸３５ ｉ ０℃ － ｍ ｎ，冷 却 后 准 备 上 样 。用 微 量 注 射 器 取 ２ 样 ０ｌｌ Ｉ 品 上样 ，进 行 Ｓ Ｓ Ｐ Ｇ 电泳 。考 马 斯 亮蓝 Ｒ ２ ０ 色 ｌ ，脱 色 至 Ｄ—Ａ Ｅ 一５染 ｈ 胶 上 出现 清 晰条 带 。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
KGF-2基因克隆及在大肠杆菌中的表达1引言角质形成细胞生长因子-2 ( Keratinocyte Growth Factor-2，KGF-2)，又称为成纤维细胞生长因子-10 (Fibroblast Growth Factor-10，FGF-10)，是FGFs超家族中角质细胞生长因子家族的一员。
1.1 KGF-2的来源和基因结构KGF-2主要是由成纤维细胞及其他间充质来源的细胞分泌，如成纤维细胞、损伤修复中的肉芽组织以及上皮组织周围的γδT细胞均可分泌KGF-2。
此外，上皮组织的损伤还可上调KGF-2的表达。
人kgf-2基因位于染色体的5p12-p13区域，其基因为单拷贝，由3个外显子和2个内含子组成。
1997年，Emoto等[1]克隆了人的kgf-2的cDNA，其编码的蛋白质由208个氨基酸组成，N端有39个氨基酸组成的疏水信号肽，成熟蛋白含169个氨基酸，其中4个半胱氨酸形成2对二硫键，另一个折叠在肽中。
理论相对分子质量为19.3KD，对肝素具有较强的亲和作用。
Kgf-2的立体结构与其它FGF家族成员相似，为β三叶草型。
1.2 KGF-2的功能KGF-2通过与上皮细胞细胞膜上受体作用特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移，是胚胎器官发育中重要的多功能信号分子。
KGF-2能够通过刺激表皮细胞的增殖、迁移和分化直接促进伤口的愈合，在组织的重塑过程中起趋化作用[2]。
KGF-2通过与损伤位点黏膜的表皮细胞上的受体结合，引起细胞向受伤处迁移，保护角质细胞免受ROS诱导的细胞凋亡，由此来加快伤口的愈合。
此外，KGF-2同时也能通过刺激其它在组织修复和再生过程中有着非常重要作用的细胞因子(如血小板衍生生长因子，转化生长因子和成纤维细胞生长因子)的表达来间接作用于组织的重塑[3]。
KGF-2有两种细胞膜表面受体：FGFR1Ⅲb和FGFR2Ⅲb。
KGF-2与FGFR2Ⅲb的亲和力高，是其特异性配体。
KGF-2与受体结合后，促使受体处于细胞内的Ｃ端酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的受体具有酪氨酸蛋白激酶活性，并与一系列靶蛋白发生作用，引发信号级联反应，发挥生物学功能[4,5]。
在脊椎动物器官形态发生过程中，KGF-2 在间充质-上皮相互作用中十分关键，如在四肢形成过程中，KGF-2在侧板中胚层的有限区域表达，它诱导尖外胚层嵴细胞的分化，刺激细胞增殖导致肢芽形成[6]。
脊椎动物器官的分支状形态发生也与FGFs家族相关，研究表明在小鼠肺的发育过程中，KGF-2可能是一个十分关键的生长因子和趋化物质[7]。
其它经历分支状发生的器官，像泪腺和胰腺，KGF-2在其发育过程中也发挥一定作用[8,9]。
另外，KGF-2几乎参与颅面区所有的结构发育，无论是早期的形成过程，还是后期的生长调节，KGF-2/KGFR2b 信号通路都是十分关键的[10]。
在生殖系统的发育过程中，KGF-2 也起着重要的作用。
在前列腺的发育过程中，间充质通过分泌KGF-2 等细胞因子来诱导前列腺上皮细胞发育。
Donjacour等研究FGF-10雄性小鼠模型时发现，大多数这种小鼠出生时雄性第二性器官缺失或萎缩，包括前列腺、精囊、尿道球腺和尾部输精管[9]。
另外，Yucel等利用基因敲除小鼠模型证实，KGF-2 等生长因子在生殖结节的正常发育过程中协同其他细胞因子起着非常重要的作用[10]。
这些研究结果说明KGF-2可能在前列腺和其他附属性器官发育中起十分重要的作用。
目前已经发现KGF-2在脊椎动物四肢、牙齿和毛发（羽毛），以及肺、耳、盲肠、颌下腺、胰腺和前列腺等器官的形成过程中起着极为重要的作用[11]。
KGF-2也有辐射防护作用[12]。
KGF-2可以提高辐射后小鼠的肠干细胞的存活率，并对辐射引起的气道上皮细胞的通透性升高具有拮抗作用。
Knan等人应用离子微集落刺激法发现，KGF能显著降低辐射引起的肠道损伤。
Waters 和Savla等人用测定荧光素异硫氰酸盐标记的牛血清白蛋白（FITC-BSA）的外渗来反应培养的Calu-3和16HBE140单层细胞的通透性，结果发现在同等剂量的辐照条件，KGF（50ng/ml）预处理的培养单层细胞对FITC-BSA的通透性明显下降，而KGF对未辐射过的单层细胞的通透性无影响。
通过激活蛋白激酶C（PKC），KGF可以加速辐射诱导的DNA 损伤修复，并维持细胞骨架蛋白F-肌纤蛋白的稳定和保护细胞间连接。
1.3 Kgf-2在大肠杆菌中的表达优势近年来的研究发现kgf-2基因在毕赤酵母中表达时，目的产物容易遭受宿主蛋白酶的降解[13]。
大肠杆菌表达系统具有容易操作、能高效表达的特点，而且就重组蛋白的生物学活性而言，两种方式表达的重组蛋白均具有类似天然蛋白的生物学功能，其刺激NIH/3T3细胞增殖能力也几乎相当。
因此本研究希望利用大肠杆菌表达系统来实现该基因的高效稳定表达。
2 主要仪器及原料2.1 材料2.1.1 菌株来源BL21菌株由军事医学科学院馈赠2.1.2 寡核苷酸引物实验所需引物由上海生工公司合成pet28kgf(+)：CGGAATTCGGTCAAGACATGGTGTCACCpet28kgf(-)：CGCTCGAGTTATGAGTGTACCACCATTGGA2.1.3 试剂PCR反应体系：dNTP溶液，Taq酶，XhoⅠ，Mg2+溶液DNA电泳体系：琼脂糖，MarkerⅢ，6×loading Buffer ，TAE 缓冲液，Goldview蛋白电泳体系：10%过硫酸铵，TEMED，巯基乙醇，30% 胶母液，分离胶缓冲液（pH 8.8），浓缩胶缓冲液（pH6.8），10×电极缓冲液（pH 8.3），2 ×上样缓冲液，染色液，脱色液试剂盒：质粒提取试剂盒，PCR产物回收试剂盒培养基：LB液体培养基，LB固体培养基溶液：60mmol/L氯化钙溶液抗生素：卡那霉素，氨苄青霉素2.2 实验仪器PCR仪：Eppendorf公司DNA电泳仪：北京六一蛋白电泳仪：北京六一低温离心机：美国Beckman公司摇床：ZHWY2008B制冰机：SIM-F124（SANYO）恒温水浴锅：GFL1002超低温-20冰箱：MDF-U5410（SANYO）4 ℃冰箱：BCD-257SLB漩涡混匀器：VORTEX-GENIE2超净工作台：HD-1360新型格兰仕WD750ASL23微波炉电转化仪3 实验方法[14,15]3.1 质粒DNA的提取分别取BL21（pET28a）和BL21（pET22b kgf-2）菌液接种于5ml(含氨苄青霉素和卡那霉素)的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，各自用试剂盒法提取质粒DNA ，步骤如下：（1）将5 ml菌液13 000rpm离心30s，收集沉淀。
（2）倒掉上清，将沉淀完全悬浮于100μl悬浮液（溶液Ⅰ）中。
（3）加入150μl裂解液（溶液Ⅱ）轻柔地颠倒混匀10次左右，溶液逐渐变得粘稠清亮。
（4）加入150μl中和液（溶液Ⅲ），轻柔地颠倒混匀10次左右。
（5）13 000rpm离心8-10分钟左右，将上清液小心转移入一个新的1.5 ml离心管中，加入等体积的（约400μl）结合液，颠倒混匀。
（6）将混合液吸入离心纯化柱中，静置至少3分钟，13 000rpm离心30 s，倒掉收集管中的废液。
（7）将纯化柱重新套入废液收集管中，加入600μl 80% 的异丙醇，13 000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。
（8）取出纯化柱，将其套入一个干净的1.5 ml 离心管，开盖放置2-3分钟，加入50μl 双蒸水于硅胶膜上，不能粘在管壁上，室温下放置5分钟后，13 000rpm离心1分钟。
（9）将洗脱液重新吸入纯化柱中，再洗脱一次，这样可获得较高产量的质粒DNA。
（10）离心管中收集的液体即是洗脱下来的质粒DNA。
模板pET22b 重组子质粒电泳确认后准备进行PCR，pET28a质粒电泳确认后4℃保存准备酶切。
3.2 PCR扩增目标基因（1）取一个PCR管，在其中按顺序添加以下各成分反应液反应液：正链引物pet28kgf(+) 1μl负链引物pet28kgf(-) 1μldNTP 1μlBuffer 5μl模板pET22b重组子1μl双蒸水40μlTaq酶1μl总体积50μl（2）稍作离心。
（3）将反应管放入PCR仪中，按下列条件设计好程序，进行PCR 反应。
（4）反应程序：94 ℃条件下模板DNA预变性5分钟变性94 ℃30s退火52℃30s延伸72 ℃2min30个循环后，72 ℃条件下延伸10min补平单链。
（5）PCR反应结束后取2μl反应液用1.2% 琼脂糖凝胶进行电泳，鉴定PCR产物是否存在以及大小。
（6）电泳确认后，余下的PCR产物用试剂盒法进行纯化。
3.3 酶切A PCR产物酶切体系ddH2O 33μlPCR回收产物10μlEco RⅠ1μlXhoⅠ1μlXhoⅠ缓冲液5μl定容50μlB pET28a 酶切体系第一次酶切：ddH2O 34μlpET28a10μlEco RⅠ1μlEco RⅠ缓冲液5μl定容50μl酶切产物经回收后，进行第二次酶切第二次酶切：ddH2O 34μlpET28a 10μlXhoⅠ1μlXhoⅠ缓冲液5μl定容50μl（1）用手指轻弹管壁使溶液混匀，用离心机甩一下，使溶液集中在管底。
（2）混匀反应体系后，将Eppendorf管插于泡沫塑料板上，37 ℃水浴下反应6-8小时。
（3）酶切完全后用试剂盒法纯化产物。
（4）取2μl纯化后产物进行1.2 %琼脂糖凝胶电泳，确认酶切是否完全。
3.4 连接（1）在一1.5mlEppendorf 管中加入2μl酶切后的载体pET28a和6μl 酶切后的PCR产物片断。
（2）添加1μl的10 ×DNA缓冲液以及1μl的DNA连接酶。
即PCR产物6μlpET28a 2μl10×连接缓冲液1μlT4连接酶1μl总体积10μl（3）混匀后用离心机将液体全部甩到管底。
（4）16℃条件下保温过夜。
（5）利用宿主的感受态细胞进行转化实验。
3.5 转化3.5.1细菌感受态的制备（1）取5μl的BL21菌种接种于5 ml的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。
（2）取100μl培养液转接于5 ml的LB液体培养基中37℃振荡培养2-2.5小时左右，使A600达0.4左右。
（3）将培养液1.5ml移至Eppendorf 管中，冰浴20分钟，使其停止生长。
（4）4℃条件下，3 000r/min离心5分钟，弃取上清液。
（5）添加0.75 ml预冷的60mmol/L氯化钙溶液，用枪轻轻吹打。
（6）冰浴20-30分钟后，4℃条件下，3000r/min离心5分钟，尽可能弃取上清液。