尼克酸(维生素PP,又称烟酸)的测定方法
烟酸和烟酰胺的含量测定培训PPT
新标准代替 GB 5009.89-2016
主要变化内容
1. 高效液相色谱法调整为第一法，微生物法调整为第二法； 2. 增加了第二法 微生物法 中的微孔板法、试样处理后调节
pH的要求； 3. 修改了第二法 微生物法 的标准曲线浓度范围、精密度和
定量限。
第一法 高效液相色谱法
第一法 高效液相色谱法
3. 烟酸和烟酰胺标准混合工 作液
分别准确吸取标准混合中间液 1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL、10.0 mL、20.0 mL 于 100 mL 容量 瓶中，加水定容至刻度，混匀，得到质量浓度分别为 1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、 10.0 μg/mL、20.0 μg/mL 的标准混合工作液。临用现配。
1. 盐酸溶液(5.0 mol/L)：量取 415 mL 盐酸，加水定容至1000 mL。 2. 盐酸溶液(0.1 mol/L)：量取 8.3 mL 盐酸，加水定容至1000 mL。 3. 氢氧化钠溶液(5.0 mol/L)：称取氢氧化钠 200 g，加水定容至1
000 mL。 4. 氢氧化钠溶液(0.1 mol/L)：吸取20mL氢氧化钠溶液(5.0 mol/L)，
哪些食物可以补充烟酸？
烟酸在食物中分布广泛，含量丰富，例如动物为基础的食物有：动物肝脏、肾脏、鱼肉、禽类肉；植物为 基础的食物有：蘑菇、花生、全谷、坚果等等，还有些特殊的营养强化食物等
烟酸需要额外补充吗？
一般人不需要除膳食以外额外补充烟酸，也尚未见膳食摄 入烟酸过量引起中毒的报道。烟酸摄入过量，易出现皮肤潮红、 恶心、呕吐、糖耐量异常等不良反应，因此一般不建议过量服用。
4. 氢氧化钠溶液A(10mol/L)：称取 400g氢氧化钠，加水溶解并稀释至1 000 mL。
食品中烟酸(维生素PP)的测定(NO2)
食品中烟酸(维生素PP)的测定一、概述•烟酸又名维生素PP、尼克酸、抗癞皮病因子等，属水溶性维生素，是具有生物化学活性的吡啶-3-羟酸及其衍生物的总称•烟酸和维生素B1、维生素B2一起参与碳水化合物和能量的代谢、促进血液循环及皮肤健康、维持正常神经系统，也是合成性激素不可或缺的物质•自然界中的烟酸广泛存在于食物中，植物性食物中存在的主要形式为烟酸，动物性食物中主要以烟酰胺形式存在烟酸的化学式为C6H5NO2，相对分子质量为123.11，化学名称为吡啶-3-羟酸(3-pyridinecarboxylicacid)，结构式如下一、概述•烟酸为无色针状晶体，味苦。
性质比较稳定，在酸、碱、氧、光或加热条件下不易破坏，烟酸溶于水，溶于乙醇，但不溶于乙醚。
紫外扫描于198 nm、263 nm处有两个特征波长，其中最大紫外吸收波长为263 nm。
•目前尚未见到因食源烟酸摄入过多而引起中毒的报告，所见烟酸的毒副作用大多为临床大剂量使用烟酸所致。
当口服剂量为30 mg/d～1000 mg/d，有人出现血管扩张的症状；当口服剂量达到3 g/d～9 g/d时，可引起黄疸和血清转氨酶升高，但作用机制尚不十分清楚。
•目前大多数国家制定烟酸膳食参考摄入量为13 mg/d～20 mg/d。
我国推荐的膳食摄入量为男性14 mg/d，女性13 mg/d，和美国一致二、食品中烟酸的测定【说明1】(GB/T 5009.89-2003)微生物法【说明1】•标准方法的来源：• 1．本标准根据全国卫生标准技术委员会“第七个五年计划期间卫生标准研制计划第四项食品卫生标准中理化检验方法制标任务”，由原中国预防医学科学院营养与食品卫生研究负责建立并起草，内蒙古自治区卫生防疫站、青岛医学院等多家科研单位组成协作组反复验证后提出的。
• 2．本法主要是在参照AOAC 944.13以及美国《维生素分析方法》等文献的基础上建立的，适用于所有食品的分析1范围【说明2]•本标准规定了用微生物方法测定食品中的烟酸含量。
维生素PP的概述.docx
维生素PP的概述烟酸(尼古丁，尼克酸，维生素PP，抗癞皮病因子等)其氨基化合物为烟酰胺或尼克酰胺，二者都是吡啶的衍生物。
烟酸、烟酰胺均溶于水及酒精，25℃时，1g 烟酸可溶于60ml水或80ml酒精中，但不溶于乙醚;烟酰胺的溶解度大于烟酸，1g可溶于1ml水或1.5ml酒精，在乙醚中也能溶解。
烟酸和烟酰胺性质比较稳定，酸、碱、氧、光或加热条件下不易破坏;在高压下，120℃，20min也不被破坏。
一般加工烹调损失很小，但会随水流失。
【生理功能】烟酸主要是以辅酶的形式存在于食物中，经消化后于胃及小肠中吸收。
吸收后以烟酸的形式经静脉进入肝脏。
1)构成辅酶I(CoI)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)及辅酶Ⅱ(CoⅡ)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADP+)。
烟酰胺在体内与腺嘌呤、核糖和磷酸结合构成辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ，在生物氧化还原反应中起电子载体或递氢体作用。
2)葡萄糖耐量因子的组成成分。
烟酸与铬一样，是葡萄糖耐量因子的组成成分。
烟酸在其中的作用还不清楚。
3)保护心血管。
有报道，服用烟酸能降低血胆固醇、甘油三酯(TG)及-脂蛋白浓度和扩张血管.大剂量烟酸对复发性非致命的心肌梗死有一定程度的保护作用，但烟酰胺无此作用，其原因不清。
烟酸缺乏可引起癞皮病。
此病起病缓慢，常有前驱症状，如体重减轻、疲劳乏力、记忆力差、失眠等。
如不及时治疗，则可出现皮炎(Dermatitis)、腹泻(Diarrhea)、和痴呆(Depression)。
由于此三系统症状英文名词的开头字母均为D，故又称为癞皮病3D症状。
【膳食参考摄入量】由于色氨酸在体内可转化为烟酸，当蛋白质摄入增加时，可相应减少烟酸的摄入。
烟酸的需要量或推荐摄入量用烟酸当量(Nacin Equivalence，NE)表示。
根据测定，平均60mg色氨酸可转化为1mg烟酸，因此烟酸当量则为：烟酸当量(mgNE)=烟酸(mg)+1/60色氨酸(mg)中国营养学会推荐的膳食烟酸的参考摄入量(RNI)，成年男子14mgNE/日，成年女子13mgNE/日。
MMFSCNG食品添加剂烟酸
MM_FS_CNG_0514食品添加剂烟酸MM_FS_CNG_0514食品添加剂烟酸1.适用范围本方法适用于化学合成法制得的烟酸，在食品工业中作为营养强化剂。
2.化学名称、分子式、结构式、分子量化学名称：吡啶-3-羧酸pyridine-3-carboxylic acid分子式：C6H5 NO2结构式：分子量：（按1987年国际原子量）3.技术要求.性状本品为白色或类白色结晶或结晶性粉末；无臭或有微臭，味微酸；水溶液显酸性反应。
本品在沸水中溶解，在水中略溶，在乙醇中微溶，在乙醚中几乎不溶，在碱溶液中易溶。
项目指标含量（以C6H5NO2计），％～干燥失重，％≤炽灼残渣，％≤熔点，℃234～238 氯化物（以Cl计），％≤重金属，％≤.鉴别试剂2，4-二硝基氯苯；氢氧化钾乙醇溶液：取氢氧化钾，加95％乙醇100mL使溶解，静置后应用上清液；氢氧化钠溶液：取氢氧化钠，加水使溶解成100mL；硫酸铜溶液：取硫酸铜，加水使溶解成100mL。
鉴别方法.取样品约4mg，加2，4-二硝基氯苯8mg，研匀，置试管中，缓缓加热熔化后，再加热数秒钟，放冷，加氢氧化钾乙醇溶液3mL，即显紫红色。
.取样品约50mg，加水20mL溶解后，滴加氢氧化钠溶液至遇石蕊试纸显中性反应，加硫酸铜溶液3mL，即缓缓析出淡蓝色沉淀。
.取样品，加水制成每1mL中含20μg的溶液，按照分光光度法测定，在262nm的波长处有最大吸收，在237nm的波长处有最小吸收；吸收度237nm与吸收度262nm的比值应为～。
.含量测定试剂氢氧化钠标准滴定溶液：取氢氧化钠适量，制成溶液〔c（NaOH）＝／L〕；酚酞指示液：1％（m／V）乙醇溶液。
测定方法称取样品（准确至），加新沸过的冷水50mL溶解后，加酚酞指示液3滴，用氢氧化钠标准滴定溶液（／L）滴定至粉红色。
分析结果的表述x 1＝V·c××100 (1)m1式中：x1 ——烟酸（以C6H5NO2计）含量，％；V ——消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；c ——氢氧化钠标准滴定溶液浓度，mol／L；m1——样品质量，g；——与氢氧化钠标准滴定溶液〔c（NaOH）＝／L〕相当的烟酸的质量，g。
食品中水溶性维生素检验(二)
食品中水溶性维生素检验（二）(三)其他B族维生素测定 1．维生素B3维生素B3又称烟酸(nicotinamide)、尼克酸(niacin)、维生素PP。
是指具有烟酸生物学活性的吡啶-3-羧酸及其衍生物的总称，包括烟酸和。
为白色针状结晶，在酸、碱、光、氧或加热条件下不易被破坏，是维生素中最稳定的一种。
烟酸的测定办法有高效液相色谱法(GB 5413.15)、分光光度法(GB/T 9695.25)、微生物法(GB/T 5009.89)等。
高效液相色谱法是将试样经热水提取、酸性沉淀蛋白质后，以C18色谱柱分别烟酸和，用紫外检测器于261 nm波特长测定吸光度值，标准曲线法定量。
此法适用于婴幼儿食品和乳品中烟酸和的测定。
分光光度法的测定原理是：烟酸经溶液提取，与溴化氢结合，在对氨基苯乙酮作用下，生成黄色化合物，在420nm 波特长测定吸光度值，标准曲线法定量。
此办法适用于肉与肉制品中烟酸的检测。
2．维生素B6 (pyridoxine, PN)、(pyridoxal,PL)、(pyridoxamine,PM)是维生素B6的3种自然存在形式，它们易溶于水，在空气和酸性环境中稳定，碱性条件和光照下易被破坏。
维生素B6的测定办法有荧光分光光度法、微生物法(GB/T 5009.154)、高效液相色谱法(GB 5413.13)。
高效液相色谱法原理是：试样经热水提取、净化后，经C18色谱柱分别，荧光检测器检测，标准曲线法定量。
适用于婴幼儿食品和乳品中维生素B6的测定。
3．维生素B12又称钴胺素(cobalamin)，展现钴元素的深红色，易溶于水和乙醇，在强酸、强碱、光照条件下及氧化剂存在下易被破坏。
常用于测定维生素B12的办法有高效液相色谱法、离子交换色谱法、原子汲取分光光度法等。
食品平安国家标准中婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定采纳微生物法(GB 5413.14)；保健食品中维生素B12的测定办法采纳高效液相色谱法(GBIT 5009.217)，利用固相萃取或免疫亲和色谱法对样品提取液中的维生素B12举行富集并去除杂质后，用高效液相-紫外检测器举行测定。
尼克酸
尼克酸尼克酸：学名：吡啶3-羧酸。
可由烟碱［1-甲基-2-(3-吡啶基)吡咯烷］氧化而制得的一种B族维生素，与烟酰胺一起合称为维生素PP。
缺乏此维生素则引起糙皮病，含烟酸的辅酶有NAD＋或NADP＋两型。
烟酸是B 族维生素中唯一能在动物组织中合成的一种维生素(由色氨酸合成)。
烟酸也称作维生素B3，或维生素PP，分子式：C6H5NO2，耐热，能升华。
烟酸又名尼克酸、抗癞皮病因子。
在人体内还包括其衍生物烟酰胺或尼克酰胺。
它是人体必需的13种维生素之一，是一种水溶性维生素，属于维生素B族。
烟酸在人体内转化为烟酰胺，烟酰胺是辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的组成部分，参与体内脂质代谢，组织呼吸的氧化过程和糖类无氧分解的过程。
烟酸也称作维生素B3，或维生素PP，分子式：C6H5NO2，耐热，能升华。
它是人体必需的13种维生素之一，是一种水溶性维生素，属于维生素B族。
烟酸在人体内转化为烟酰胺，烟酰胺是辅酶Ⅰ和辅酶Ⅱ的组成部分，参与体内脂质代谢，组织呼吸的氧化过程和糖类无氧分解的过程。
烟酸(尼古丁酸，尼克酸，维生素PP)本品有较强的扩张周围血管作用，临床用于治疗头痛、偏头痛、耳鸣、内耳眩晕症等烟酸分子式(说明：分子式应为C5NH4-COOH)烟酸为维生素类药物，与烟酰胺统称维生素PP，用于抗糙皮病，亦可用作血扩张药，大量用作食品饲料的添加剂。
作为医药中间体，用于异烟肼、烟酰胺、尼可刹及烟酸肌醇酯等的生产。
若其缺乏时，可产生糙皮病，表现为皮炎、舌炎、口咽、腹泻及烦躁、失眠感觉异常等症状。
烟酸是少数存在于食物中相对稳定的维生素，即使经烹调及储存亦不会大量流失而影响其效力。
效用：促进消化系统的健康，减轻胃肠障碍；使皮肤更健康；预防和缓解严重的偏头痛；促进血液循环，使血压下降；减轻腹泻现象。
编辑本段适用症与缺乏症适应症介绍1、用于防治糙皮病等烟酸缺乏病。
也用作血管扩张药，治疗高脂血症。
也用于治疗血管性偏头痛、头痛、脑动脉血栓形成、肺栓塞、内耳眩晕症、冻伤、中心性视网膜脉络膜炎等。
烟酸的实验报告
烟酸的实验报告实验目的：通过实验了解烟酸的性质、结构和应用，并探究其在医学和食品行业中的重要作用。
实验原理：烟酸（化学式为C6H5NO2）是一种维生素B3的衍生物，也被称为尼克酸或维生素PP。
烟酸是一种白色结晶固体，可溶于水，并在水中形成稳定的溶液。
烟酸具有苦味并具有稳定性。
烟酸在生物体内通过酶催化反应转化为烟酸腺嘌呤二核苷酸（NAD），参与多种生物化学反应，如能量代谢以及蛋白质、脂类和碳水化合物的合成。
另外，烟酸还具有降低胆固醇水平、增进心血管健康以及治疗相关疾病的功效。
实验材料：- 烟酸固体- 蒸馏水- 装有烧杯的加热板- 化学品安全手套- 显微镜- 显微镜玻璃片实验步骤：1. 安全措施：戴上化学品安全手套，确保实验操作的安全。
2. 预备烟酸溶液：a. 取适量的烟酸固体加入烧杯中。
b. 加入适量的蒸馏水，充分搅拌，直到烟酸溶解。
c. 形成稳定的烟酸溶液后，备用。
3. 观察烟酸溶液：a. 将制备好的烟酸溶液倒入显微镜玻璃片上。
b. 用显微镜观察烟酸溶液的颜色、透明度以及有无浑浊情况。
4. 调节烟酸溶液的pH值：a. 分别取适量的烟酸溶液，并加入不同酸碱溶液（如NaOH溶液或HCl溶液）。
b. 使用pH试纸或pH计检测烟酸溶液的pH值。
5. 测量烟酸溶液的吸光度：a. 使用分光光度计分别测量烟酸溶液的紫外-可见吸收光谱。
b. 在指定波长范围内记录吸光度值，并绘制吸光度-波长曲线。
6. 进行烟酸萃取实验：a. 取一定体积的烟酸溶液，加入适量的有机溶剂（如乙醇或氯仿）。
b. 充分摇晃混合，使烟酸在有机溶剂中萃取。
c. 分离有机相和水相，并记录两相的颜色和透明度。
实验结果及讨论：1. 烟酸溶液观察结果：根据观察，烟酸溶液呈无色或淡黄色，透明且无浑浊物。
2. 烟酸溶液的pH值：根据所加入的酸碱溶液，可以调节烟酸溶液的pH值，通常保持在中性范围（pH约为7）。
3. 烟酸溶液的吸光度测量结果：根据测量结果显示，在特定波长范围内，烟酸溶液表现出一定的吸收峰。
尼克酸(烟酸、维生素PP)
尼克酸是吡啶的衍生物，它很容易转变成尼克酰胺。
尼克酸和尼克酰胺都是白色、无味的针状结晶，溶于水，耐热。
3－乙酰吡啶、吡啶3－磺酸和抗结核药物异烟肼（雷米封）是尼克酸的拮抗物。
无论是饲料中的尼克酸和尼克酰胺，还是合成物都能以扩散的方式迅速而有效地被吸收。
吸收的部位是在胃及小肠上段。
尼克酸在小肠粘膜中可转变成尼克酰胺，然后在组织中与蛋白质结合，变成辅酶NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)或NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)。
代谢产物主要经尿排出。
尼克酸主要通过NAD和NADP参与碳水化合物、脂类和蛋白质的代谢，尤其在体内供能代谢的反应中起重要作用。
NAD和NADP也参与视紫红质的合成。
尼克酸缺乏，猪表现为失重、腹泻、呕吐、皮炎和正常红细胞贫血。
鸡生长缓慢，口腔症状类似狗的黑舌病，羽毛不丰满、偶尔也见鳞状皮炎。
雏火鸡可发生跗关节扩张。
牛、羊瘤胃微生物能合成尼克酸。
小牛饲喂低色氨酸的饲粮可产生尼克酸缺乏症。
尼克酸广泛分布于饲料中，但谷物中的尼克酸利用率低。
动物性产品、酒糟、发酵液以及油饼类含量丰富。
谷物类的副产物、绿色的叶子，特别是青草中的含量较多。
饲粮中的色氨酸在多余的情况下可转化为尼克酸。
对于猪，50mg色氨酸可转化为1mg尼克酸，但猫和貂以及大多数鱼类缺乏这种能力。
除成年反刍动物外，都需饲粮提供尼克酸。
但高产奶牛和饲喂高营养浓度饲粮的肉牛，饲粮中亮氨酸、精氨酸和甘氨酸过量、色氨酸不足、能量浓度高以及含有腐败的脂肪等，都将增加反刍动物对尼克酸的需要。
畜禽及鱼类对尼克酸的需要一般为每千克饲粮10-50mg。
每日每千克体重摄入的尼克酸超过350mg可能引起中毒。
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尼克酸（维生素PP，又称烟酸）的测定方法（1）此处介绍微生物法、比色法以及复合维生素制剂中的烟酰胺测定方法（分光光度法）一、微生物法1.原理一种微生物生长必需某一些维生素，Lactobacillus arabinosus的生长需要尼克酸。
尼克酸是指具有尼克酸生物学活性的吡啶3-羧酸及其衍生物的总称。
它是白色晶体，是维生素中最稳定的一种，对酸、碱、热、光及弱氧化剂都很稳定，微溶于冷水，易溶于热水及乙醇。
其检出限为10ng。
2.适用范围本方法来源自AOAC和国标GB12395-90。
适用于食物及饲料中的尼克酸的检测。
3.仪器（1）电热恒温培养箱(37±0.5℃)（2）无菌室（紫外灯消毒）（3）电热手提式压力蒸汽消毒器（121℃，高压30min）（4）液体快速混合器（5）离心机（3000转，10min）（6）碱式滴定管（7）硬质玻璃试管4.试剂所用试剂皆为分析纯；所用水皆为蒸馏水4.1 标准溶液的配制（1）尼克酸标准储备液（0.1mg/ml）：准确称取50.0mg已干燥恒重并储于五氧化二磷干燥器中的尼克酸标准，以25%乙醇溶液溶解并定容至500ml，于冰箱中保存。
（2）尼克酸标准中间液（1ug/m）：吸取1.00ml尼克酸标准储备液，置于100ml容量瓶中，用25%乙醇溶液定容，混匀，于冰箱中保存。
（3）尼克酸标准工作液（0.1ug/m）：临用时吸取5.00ml尼克酸标准中间液，置于50ml容量瓶中，用水定容，混匀。
4.2 其它试剂的配制（1） 0.5mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入28ml H2SO4，用水稀释至1000ml。
（2） 10mol/L氢氧化钠：溶200g NaOH于水中，稀释至500ml。
（3） 0.1mol/L氢氧化钠：，取10ml 10mol/L NaOH，用水稀释至1000ml。
（4） 0.04%溴甲酚绿溶液，称取0.1g溴甲酚绿于研钵中，加1.4ml 0.1mol/L NaOH研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释到250ml。
（5）酪蛋白（sigma公司）：称取50g不含维生素的酪蛋白，加200ml （3mol/L）盐酸，121℃磅压力下水解6小时，将水解物转移至蒸发皿内，在水浴上蒸发至膏状。
加200ml水使之溶解后再蒸发至膏状，反复3次，以除去盐酸。
注意：*酸解酪蛋白是为了去除酪蛋白中的维生素，确保培养基中不含代测的尼克酸，但酸解并不一定彻底，因此选用不含维生素的酪蛋白。
*水浴蒸发时不可蒸干或使之焦糊，若溶液被蒸干，水解液所含营养物已被破坏用10mol/L氢氧化钠调节PH值至3.5，以溴酚蓝作外指示剂。
加20g活性炭，振摇，过滤，反复操作至滤液无色。
滤液加水稀释至500ml，加少许甲苯置冰箱中保存。
*注意：活性炭不能在溶液中太久，否则容易破坏酪蛋白的营养成分（待续）尼克酸（维生素PP，又称烟酸）的测定方法（2）（6）溴酚蓝：称取0.1g溴酚蓝，用1+4乙醇溶解后，再加乙醇稀释至100ml。
（7）甲苯（8） 4mol/L盐酸溶液，V+V=1+4（9） 5mol/L生理盐水：取9gNaCl溶于1000ml水中。
（10）胱氨酸、色氨酸溶液：称取4gL-胱氨酸和1gL-色氨酸溶于800ml水中，加热至70～80℃，逐滴加入20%盐酸，不断搅拌，直至完全溶解为止。
冷至室温，加水稀释至1000ml。
加少许甲苯于冰箱中保存。
（11）腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液：称取硫酸腺嘌呤，盐酸鸟嘌呤及尿嘧啶各0.1g，加75ml水和2ml 浓盐酸，然后加热使其完全溶解，冷却，若有沉淀产生，加浓盐酸数滴，再加热。
如此反复，直至冷却后无沉淀产生为止。
用水稀释至100ml。
加少许甲苯于冰箱中保存。
（12） D-泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇溶液：称取D-泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇各10mg 于烧杯中，以水溶解并稀释至1000ml，将此液置于棕色瓶中，加少许甲苯于冰箱中保存。
*注意：此溶液见光分解，因此储存于棕色瓶中（13） 0.02mol/L醋酸溶液：取1.18ml纯的冰醋酸，稀释至1000ml（14）核黄素、盐酸硫胺素、生物素溶液：溶解1mg生物素结晶于100ml 0.01747mol/L的醋酸中，取此液4ml（相当于40ug生物素），加入20mg核黄素和10mg盐酸硫胺素，以0.01747mol/L醋酸溶解并稀释至1000ml，将此液置于棕色瓶中，加少许甲苯于冰箱中保存。
*注意：此溶液见光分解，因此储存于棕色瓶中（15）甲盐溶液：取25g磷酸氢二钾和25g磷酸二氢钾，加水溶解后稀释至500ml，加少许甲苯于冰箱中保存。
（16）乙盐溶液：取10g硫酸镁、0.5g氯化钠、0.5g硫酸亚铁和0.5g硫酸锰，加水溶解后稀释至500ml，加5滴浓盐酸，加少许甲苯于冰箱中保存。
（17）乙醇溶液 V/V=1/3（18）溴酚蓝：称取0.1g溴酚蓝，用1+3乙醇溶液溶解后，再稀释至100ml。
（19） 0.04%溴麝香草酚蓝溶液：称取0.1g溴麝香草酚蓝于研钵中，加1.6ml，0.1mol/L NaOH，研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250ml。
（20） 0.004%溴麝香草酚蓝溶液：量取100ml0.04%溴麝香草酚蓝溶液，加水稀释至1000ml，供滴定用。
（21）基本培养基储备液：酸解酪蛋白 50ml胱氨酸、色氨酸溶液 50ml腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液 10mlD-泛酸钙、对氨基苯甲酸、吡哆醇溶液 10ml核黄素、盐酸硫胺素、生物素溶液 10ml甲盐溶液 10ml乙盐溶液 10ml无水葡萄糖 10g无水醋酸钠 10g（或结晶醋酸钠NaAC.3H2O 16.6g）将上列试剂混合，用水稀释至500ml用氢氧化钠调PH至6.8，以溴麝香草酚蓝作外指示剂。
（待续）尼克酸（维生素PP，又称烟酸）的测定方法（3）（22）琼脂培养基：无水葡萄糖 1g 醋酸钠 1g 蛋白胨 0.8g 酵母提取物干粉 0.2g 甲盐溶液 0.2 ml乙盐溶液 0.2ml 琼脂 1.2g混合，加水至100ml，加热至琼脂完全溶化，以溴麝香草酚蓝为外指示剂，用盐酸趁热调PH至6.8，尽快倒入试管中，每管3～5ml，加塞棉塞，于压力蒸汽消毒器中121℃灭菌10min，取出后竖直试管，冷至室温后保存于冰箱中。
4.3菌种的制备与保存（1）菌种的制备与保存：以阿拉伯乳酸杆菌�Lactobacillus arabinosus 17-5 ATCC No.8014 简称 Lac t.A?纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在37±0.5℃恒温箱中保温16-24小时，取出于冰箱中保存，至多不超过两周。
保存数周以上的菌种，不能立即用作制备接种液之用，一定要在使用前每天转种一次，连续2-3天，方可使用，否则生长不好。
（2）种子培养液的制备：加5ml 0.1ug/ml 的尼克酸标准应用液于尖头试管中，加入5ml基本培养基，塞好棉塞，于压力蒸汽消毒器内（高压锅）121℃下消毒10min，取出，置于冰箱中，此管可保存数周之久。
5.操作步骤5.1样品制备：取含尼克酸约5-50ug的均匀样品于100ml三角瓶中，加0.5mol/LH2SO450ml。
放入高压蒸汽锅121℃下水解30min，取出，于水中冷却，用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4调PH值至4.5，用溴甲酚绿做指示剂。
将三角瓶内的溶液转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，滤纸过滤，保存滤液于冰箱内备测（保存期不超过36小时）。
*用0.5mol/L硫酸水解，可以断开尼克酸和其它物质结合的键，使尼克酸游离出来。
*观察溴甲酚绿至草绿色为终点，说明溶液PH值到了4.5. 调PH值至4.5可以除去样品中刺激和抑制细菌生长的物质，如：淀粉、脂肪酸及磷脂。
许多蛋白质的等电点也在PH4.5，所以此PH值也可用来沉淀蛋白质。
5.2接种液的制备：使用前一天，将阿拉伯乳酸杆菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可同时制备两管，在37±0.5℃的恒温箱中培养16-24小时。
取出离心10分钟（3000rpm）倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗2次，再加10ml消毒过的生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成为混悬体，将此液倒入已消毒的注射器内，立即使用。
5.3样品标准曲线的测定：3组试管各加0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0ml工作液，每管加水稀释至5ml，再加5ml基本培养基，混匀，加棉塞。
（待续）尼克酸（维生素PP，又称烟酸）的测定方法（4）5.4试样的测定：在试管中分别加入1，2，3，4ml样液，加水稀释至5ml，再加入5ml基本培养基，用棉塞塞住试管，将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压锅（121℃）高压10min，冷至室温备用。
5.5接种和培养：每管种一滴接种液，于37±0.5℃恒温箱中培养72小时*注意：接种后用振荡器振荡混匀试管中的液体。
5.6滴定：从恒温箱中取出后，将试管中培养液倒入50ml三角瓶中，用5ml0.004%溴麝香草酚蓝分二次淋洗试管，洗液倒入该三角瓶中，以0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定，呈绿色即为终点，此时PH约6.8，绘制尼克酸标准工作曲线，用测定管得到的值，在标准曲线上查到测定管内所含尼克酸的量。
* 水解液的PH值调至6.8是为了不同的试剂加入基本培养基时，不致改变基本培养基的PH值。
（此乳酸菌生长的适宜PH值为6.8）6.计算以尼克酸标准系列的不同微克数为横坐标，滴定所需0.1mol/L氢氧化钠毫升数为纵坐标，作为标准曲线。
X=（C×V/m）×F×（100/1000）X--样品中尼克酸的含量，mg/100g；C--每毫升样品中尼克酸含量的平均值，ug/ml；V--样品水解液定容总体积，ml；F--样品试液的稀释倍数；m--试样质量，g；100/1000--折算成每100g样品中尼克酸含量，mg。
7.举例取一螺旋藻样品1.004g（m），处理后定容为100ml（V），从中取1ml稀释至25ml（F），取1，2，3，4ml入试管中，加入水和培养基，高压消毒，培养，滴定，测量根据曲线分别得出四管C值为0.037，0.073，0.110，0.136，所以四管平均值为C=（0.037+0.073/2+0.110/3+0.136/4）/4=0.036。
代入方程式为：X=（C×V/m）×F×（100/1000）=（0.036×100/1.004）×25×（100/1000）=8.96（mg/100g）因此得出每100克螺旋藻中含8.96毫克尼克酸。