细胞周期调控蛋白MPF的研究
MPF的研究历程
Nurse回忆说："我发现这个遗传学方法相当好。 "所以在他拿到phD学位后，就来到了英国 Edinburgh大学工作，也开始在另一种酵母--裂 殖酵母中来找细胞周期基因，跟Hartwell一样， 也很快拿到一系列突变基因，也叫“wee”突变， 它们作用在酵母进入有丝分裂的初期，其中 wee2,也就是Nurse开始称为cdc2的基因，被他 证明是控制细胞分裂起始的。Nurse后来又转 到了Sussex大学，稍后又来到Oxford，期间他 跟同事一起发现cdc2基因编码一种蛋白激酶， 而且他们发现cdc2跟Hartwell在 裂殖酵母中发 现的cdc28有相似之处。就此看来，Nurse的获 奖有一定程度上要感谢那部破机器。
2 Willian Wasserman 和Dennis Smith (Puidue大学) 1978发表一篇关于MPF在早期两栖动物发育过
程中的行为报告
3 他们推断： MPF 在早期胚胎中表现的 活性只是在卵母细胞中显示出的活性的 剩余部分 4 但Wasserman和Smith发现MPF的活性 在与细胞周期的变化相关的卵裂过程中 表现出明显的波动 5 例如人们发现从受精后30-60min内正在 分裂的蛙卵中取出的细胞质表现出很小 甚至不表现出可以被人们发现的 MPF 活 性（通过将未成熟的卵母细胞注射进去 进行化验得知）
6 如果孕酮只是通过在卵母细胞外面表面、 介导，从而诱导成熟，那么如果将激素 注入卵母细胞内，卵母细胞将没有任何 反应。 7 激素在细胞表面的活动诱发了卵母细胞 质里的次级变化，导致生发泡破裂和与 成熟相关的其他变化
二、 1 为了解更多的细胞质对诱发成熟的反应 变化， Yoshio Masui(Toronto 大学 ) 和 Clement Market(yale大学)开始了一系列实验。他们取走 经孕酮处理的不同阶段的单独的蛙卵母细胞， 将供体细胞质的 40 — 60 纳米注入完全生长的不 成熟未经处理的卵母细胞中。 2 他们发现，从卵母细胞（孕酮处理后的第12 小时的卵母细胞）取出的细胞质对受体有很微 小甚至没有影响。 3 然而，这一时期之后，细胞质获得了这种在 受体细胞内诱导成熟的能力。 4 从供体卵母细胞取出的细胞质在经孕酮处理 20小时后表现出最大效力，到40小时效力开始 下降
细胞周期调控蛋白MPF的研究
细胞周期调控蛋白MPF的研究第三节细胞周期调控的分子机理一、MPF的生化本质、活性调节及其功能MPF(卵细胞促成熟因子，matuation-promotingfactor;细胞促分裂因子，mitosis-promotingfactor;M期促进因子，M-phase-promoting factor)。
Johnson和 Rao1970将Hela细胞同步于不同阶段，然后与M期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合，发现与M期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的早熟凝集染色体prematurely condensedchromosome，PCC。
不同形态的PCCG1期PCC为单线状，因DNA未复制;S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制;G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。
人M期细胞与袋鼠 (Ptk)G1、S、G2 期细胞融合诱导 PCC:提示M期细胞存在诱导PCC的因子; 不仅同类M期细胞可以诱导PCC，不同类的M期细胞也可以诱导PCC产生，如人和蟾蜍的细胞融合时同样有这种效果，这就意味着M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子maturation promoting factor，MPF。
1971年， Masui和Markert用非洲爪蟾做实验，明确提出MPF的概念 ? ? ? 注射实验表明:孕酮诱导卵母细胞成熟;成熟卵细胞质中，含有Sunkara将不同时期Hela细胞的提取液注射卵母细胞成熟的因子，称做MPF1979年，到蛙卵母细胞中，发现G1和S期的抽取物不能诱导GVBD，而G2和M期的则具有促进胚胞破裂的功能，它将这种诱导物质称为有丝分裂因子MF。
后来在CHO细胞，酵母和粘菌中也提取出相同性质的MF。
这类物质被统称为MPF。
在此后20年里，许多学者致力于MPF的提纯，试图揭示MPF的生化本质。
第二个研究领域是为了弄清楚细胞周期调节基因，遗传学家们利用裂殖酵母和芽殖酵母温度敏感突变株，分离细胞增殖必需的基因(cdc genes cell division cyclegenes) 1960s L. Hartwell以芽殖酵母为实验材料，利用阻断在不同细胞周期阶段的温度敏感突变株(在适宜的温度下和野生型一样)，分离出了几十个与细胞分裂有关的基因cell division cycle gene，CDC，如芽殖酵母的cdc28基因，在G1/S或G2/M转换点发挥重要的功能。
细胞周期调控
2.cdc基因 Leland Hartwell、 Paul Nurse分别以不同的酵母为实验材料，发现了许多与细胞分裂
有关的基因(cell division cycle gene，CDC)。如芽殖酵母的cdc28、裂殖酵母cdc2基因。 进一步研究发现：P34cdc2与P34cdc28是同源物，二者本身并不具有激酶活性，只有当其与有 关蛋白结合后，其激酶活性才能够表现出来。例如：P34cdc2必须与另一种蛋白P56cdc13结合 后才具有激酶活性。
表皮生长因子（EGF)受体 集落刺激因子－1（CSF-1)受 体 神经生长因子（NGF)受体
酪氨酸激酶 丝氨酸激酶 GTP/GDP结合蛋白
转录因子（AP-1) DNA结合蛋白 类固醇受体家族成员
3．抑癌基因 抑癌基因可抑制细胞周期于静止期，并使DNA复制不完全或损伤的细胞不能进入分裂期，
避免细胞的癌变。
（1）Ink4(Inhibitor of cdk 4) 如P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，专一地与CDK4、CDK6结合，阻止CDK和 cyclinD的结合。使细胞周期不能从G1期的调控点进入到下一个时相。
（2）Cip/Kip
包括P21cip1 (cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、 P57kip2等，能与多种cyclin - CDK复合物包括cyclinE–CDK2、cyclinD–CDK6、cyclinD– CDK4结合，抑制cyclin - CDK复合物的蛋白激酶活性，使一些细胞增殖所需要的蛋白质磷 酸化受阻，细胞停留在G1期。
此外P21cip1还可与DNA聚合酶δ亚单位PCNA (proliferating cell nuclear antigen, PCNA )相互作用， 抑制DNA复制，但不影响DNA修复。
细胞周期的理解
一、简述MPF的结构组成及其对细胞周期运转的调控机制？MPF= Cdc2(细胞分裂周期蛋白，催化亚基)+cyclin（周期蛋白，调节亚基）催化亚基与调节亚基两者结合表现出蛋白激酶活性；催化亚基在细胞周期中保持稳定，周期蛋白（调节亚基）呈周期性波动，从而导致MPF的周期性激活与失活，推动细胞周期的进行。
cyclin B在G1晚期开始合成，G2期末CyclinB 含量达最大值，周期蛋白依赖激酶CDC2只有与cyclin B结合,并且其Thr161位磷酸化,Thr14和Tyr15去磷酸化才能被激活，MPF活化后，可促使H1组蛋白磷酸化，使染色质凝集，促使核纤层蛋白磷酸化，使核膜解体，使微管蛋白磷酸化重排形成纺锤体，调节细胞越过G2/M监控点进入M期，M后期，CyclinB降解，MPF失去活性，染色体去凝集、纺锤体消失、核被膜和核仁重建，细胞从M期向G1期转化。
二、论述真核细胞细胞周期各分期的特点及细胞周期运行的调控机制。
1、细胞周期概念和间期、分裂期各期特点分裂细胞从一次分裂结束开始到下一次分裂结束所经历的时期和顺序变化称为细胞周期,包括细胞间期和分裂期间期：G1期: G1期主要合成大量RNA和专一蛋白质，如DNA复制所需酶、细胞周期蛋白、触发蛋白等，为S期DNA合成作准备。
G1期晚期有限制点（R点），控制着新一轮周期的运转。
S期: DNA复制，组蛋白、非组蛋白也与DNA复制同时进行，中心粒开始复制。
G2期：合成成熟促进因子（MPF），合成微管蛋白，中心粒开始向两极分离。
M期前期：染色质凝集，分裂极确定和有丝分裂器形成，核仁消失和核膜解体前中期：纺锤体微管捕获染色体动粒中期：染色体排列在赤道板上后期：着丝粒分离，姐妹染色单体分开并向细胞两极移动末期：染色体到达两极、解凝集，核膜和核仁重现，形成两个子细胞核胞质分裂一般始于分裂后期，将细胞膜、细胞骨架、细胞器及可溶性蛋白质等分配最终形成两个子细胞。
2、细胞周期运行的调控机制细胞存在一系列监控机制，可鉴别细胞周期进程中的错误，阻止细胞周期进一步运行，这些监控机制即为检验点。
细胞周期调控与检测
４、M期（有丝分裂期，细胞经过分裂将染色体平均分配到两个子细 胞中） 在此期细胞中，染色体凝集后发生姊妹染色单体的分离，核膜 核仁破裂后再重建，胞质中有纺锤体收缩环出现，随着两个子核的 形成，胞质也一分为二，由此完成细胞分裂。
2020/11/14
DNA合成前期（G1期） 细胞间期 DNA合成期（S期）
细
DNA合成后期（G2期）
胞
周
前期
期
有丝分裂期（M期）
中期 后期
末期
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（3）随着成熟刺激因子（maturation promoting factor, MPF），细胞周 期素（cyclin），细胞周期素依赖性蛋白激酶 (cyclin dependent kinase，CDK)的发现使对细胞周期及与肿瘤的发生发展关系的研究 有了很大进展。
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（３）S期是细胞合成的主要时相
此时细胞质中可出现大量的组蛋白mRNA，新合成的组蛋白 从胞质进入胞核，与复制后的DNA迅速结合，绕成核小体，进而 形成具有两条单体的染色体。除了蛋白质合成以外，在S期细胞 中不断进行着组蛋白的持续磷酸化。
（４）中心粒的复制也在S期完成
原本垂直的一对中心粒发生分离，各自在其垂直方向形成一 个子中心粒，由此形成的两对中心粒在以后的细胞周期进程中， 将发挥微管组织中心的作用，纺锤体微管，星体微管的形成均与 此相关。
B、细胞周期素（cyclin) ➢ 特点：在细胞周期中呈周期性变化。 ➢ 作用：能与CDK结合，激活CDK，间接调节细胞周期运行。 ➢ 已知30余种，在脊椎动物中为cyclinA1-2、B1-3 、C、 D1-3、 E1-2、F、G、H等。
CELLCYCLE一、MPF的发现及其作用
人们猜测，在M期的细胞中存在着某中分别提取出了能够 促进细胞分裂的的因子，统称为成熟促进因子 (maturation promoting factor，MPF)。
爪蟾卵子成熟过程
处于第六期的爪蟾卵母细胞（RD前期I），具GV。
MPF的生化成分：含有两个亚单位 MPF =Cdc2+cyclin （催化亚单位+调节亚单位）
•后来Paul Nurse（1990）进一步的实验证明P32 实际上是Cdc2的同源物，而P45是cyclinB的同源 物，从而将细胞周期三个领域的研究联系在一起。
•即MPF是由cyclin和CDC基因编码的依赖于 cyclin的蛋白激酶(cyclin-dependent kinase， CDK)，
不具有活性，使CDK/cyclin不断积累。 • 在M期，Wee1的活性下降，CDC25使CDK去磷酸化，去除
了CDK活化的障碍。 • CDK的激活需要Thr161的磷酸化，它是在CDK激酶(CDK
activating kinase CAK)的作用下完成的。
CDK activating
DNA复制的控制
S-CDK触发 pre-RC的启动， 同时阻止了DNA 再次进行复制， 因为S-CDK将 CDC6磷酸化，使 其脱离ORC，磷 酸化的CDC6随后 被SCF参与的遍 在蛋白化途径降 解。从而保证了 DNA的复制当且 仅当一次
限制点在细胞周期中的作用
•细胞要分裂，必须正确复制DNA和达到一定的 体积，在获得足够物质支持分裂以前，细胞不可 能进行分裂。细胞周期的运行，是在一系列称为 检验点（check point）的严格检控下进行的， 当DNA发生损伤，复制不完全或纺锤体形成不正 常，周期将被阻断。
–G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。
细胞周期和细胞死亡的分子调控机制
细胞周期和细胞死亡的分子调控机制细胞是生命的最基本单位，每个细胞都经历着重要的两个过程，即细胞周期和细胞死亡。
在细胞周期中，细胞不断地复制其DNA和细胞器，并最终分裂成两个完全相同的细胞。
而当细胞出现异常或者受到外部因素的影响时，细胞就会经历死亡过程。
细胞周期和细胞死亡的分子调控机制影响着许多生物学现象，如肿瘤的发生和治疗、细胞分化和再生等，因此具有极大的研究价值。
一、细胞周期细胞周期是一个持续的过程，包含G1期、S期、G2期和M期四个阶段。
在G1期，细胞增长并复制基因组；在S期，DNA被复制；在G2期，细胞继续增长并制备分裂所需的细胞器和物质；最后在M期，细胞分裂成两个完全相同的细胞。
细胞周期的过程由许多分子调控，如细胞周期蛋白（Cyclin）和细胞核分裂素激活蛋白激酶（MPF）等。
Cyclin与CDK（Cyclin Dependent Kinase）相结合，形成复合物，其活性被MPF调节。
在M期，MPF活性升高，将细胞推向促进微管聚合和核分裂的过程。
二、细胞死亡细胞死亡是细胞生命周期中的一个重要事件，细胞死亡方式包含凋亡、坏死、自噬等多种类型。
细胞凋亡是一个常见的死亡方式，它是一种有序的细胞死亡方式，是一个高度调控的过程，包括内在途径和外在途径两种途径。
在内在途径中，细胞发生损伤或遭受外界刺激，释放出细胞死亡蛋白酶（Caspase），从而启动死亡程序。
在外在途径中，外界刺激通过细胞的受体，例如Fas受体，激活一个叫作“死亡信号复合物”的蛋白质结构。
该复合物能够激活Caspase酶活性，并导致细胞死亡。
三、细胞周期和细胞死亡的相互作用细胞周期和细胞死亡有着密切的相互作用。
在细胞周期过程中，细胞必须通过一系列的准备工作，如复制DNA、制备细胞器，才能成功完成分裂。
但是如果细胞周期中存在一些异常因素，例如突变或DNA损伤，细胞需要通过死亡来保证其正常生长发育，以避免畸形或肿瘤的形成。
在细胞死亡的过程中，也会发生一些异常，如无端凋亡。
14 细胞周期(二)
细胞生物学第十四章细胞周期(二)The Cell Cycle Control System•The cell cycle control system is regulated by both internal and external controls.•The clock has specific checkpoints where the cell cycle stops until a go-ahead signal is received.2细胞周期调控一、细胞周期调控因子的发现二、细胞周期调控因子三、细胞周期调控的机制四、其他3一、细胞周期调控因子的发现1、有丝分裂促进因子（mitosis promoting factor，MPF）2、成熟促进因子（maturation promoting factor，MPF）3、细胞分裂周期基因（cell division cycle gene，cdc）4、细胞周期蛋白(cyclin)41、MPF 的发现5G1期PCC S 期PCC G2期PCC1970年，Johnson RT和Rao PN 发现M 期HeLa 细胞与间期细胞融合形成早熟染色体凝集（PCC ）。
这一现象提示在M 期细胞中存在诱导染色体凝集的因子，称为有丝分裂促进因子（mitosis promotingfactor ，MPF ）。
•1971年，Masui Y 和Markert CL 通过非洲爪蟾卵实验发现成熟卵母细胞细胞质中含有促卵母细胞成熟的因子，称为成熟促进因子（maturation promoting factor ，MPF ）。
卵细胞成熟示意图：细胞质移植实验发现MPF ：MPF 的发现•1988年，James Maller 实验室在爪蟾卵中分离出MPF ，证明MPF 由p32和p45两种蛋白构成，p32和p45结合后表现出蛋白激酶的活性。
7MPF 激酶p32p45MPF 的组成•1970s ，Leland Hartwell 利用芽殖酵母发现了几十个细胞分裂周期（cell division cycle,cdc ）基因，如cdc28。
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第二个研究领域是为了弄清楚细胞周 期调节基因，遗传学家们利用裂殖酵母和 芽殖酵母温度敏感突变株，分离细胞增殖 必需的基因（cdc genes, cell division cycle genes）
1960s L. Hartwell以芽殖酵母为实验材料，利用 阻断在不同细胞周期阶段的温度敏感突变株（在适 宜的温度下和野生型一样），分离出了几十个与细 胞分裂有关的基因(cell division cycle gene， CDC)，如芽殖酵母的cdc28基因，在G1/S或G2/M 转换点发挥重要的功能。Hartwell还通过研究酵母 菌细胞对放射线的感受性，提出了checkpoint（细 胞周期检验点）的概念，意指当DNA受到损伤时， 细胞周期会停下来。
第三个研究领域，以美国科学家T.Hunt为代表，以 海胆为研究材料，发现了细胞周期的另一个重要调 控者-------细胞周期蛋白（cyclin）
多年来在上述三个领域的研究，互相之间 并没有联系，一直到1988年才突然打破这一 局面。1988年Lohka最终将非洲爪蟾卵的 MPF纯化，发现MPF由32kD 和45kD两种蛋 白质构成，其中32kD是Ser/Thr蛋白激酶。
cdc2是第一个被分离出来的cdc基因，表达 34kDa的蛋白，称p34cdc2。进一步研究发现其具有 激酶活性，可以使许多蛋白磷酸化，在裂殖酵母 的周期调控中起重要作用。芽殖酵母中的一个关 键cdc基因是cdc28，是第二个被分离出来的cdc基 因，编码34kDa的蛋白，具有激酶活性。 p34cdc28 是 p34cdc2的同原物，调控细胞周期，特别是G2/M 期转变。但研究者很快发现， p34cdc28 或p34cdc2单 独并不具有激酶活性，需要同相关蛋白结合后才 具有活性（如p34cdc2和蛋白p56cdc13结合）。
M期细胞也可以诱导PCC产生，如人和蟾蜍的
细胞融合时同样有这种效果，这就意味着M期
细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，
即成熟促进因子(maturation promoting
factor，MPF)。
1971年， Masui和Markert用非洲爪蟾做实验，明 确提出MPF的概念
Ⅳ
Ⅴ
Ⅵ
注射实验表明：孕酮诱导卵母细胞成熟；成熟卵 细胞质中，含有卵母细胞成熟的因子，称做MPF
第三节 细胞周期调控的分子机理
一、MPF的生化本质、活性调节及其功能
MPF（卵细胞促成熟因子，matuation-promoting factor；细胞促分裂因子，mitosis-promoting factor； M期促进因子，M-phase-promoting factor）。
Johnson和 Rao(1970)将Hela细胞同步于不同阶段， 然后与M期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导 细胞融合，发现与M期细胞融合的间期细胞产生了形 态各异的早熟凝集染色体(prematurely condensed chromosome，PCC)。
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2001
Prize citation: "for their discoveries of key regulators of the cell cycle"
Leland Hartwell, born 1939. Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA.
问题：MPF和p34cdc2有何关系？
J.Maller和P.Nurse实验室立即合作，很快证 明爪蟾卵中的p32与p34cdc2是同原物。与此 同时，T.Hunt实验室等以海胆卵为材料研究 细胞周期调控，发现一类与细胞分裂有关的 蛋白，称为周期蛋(cyclin)。
然后J.Maller和T.Hunt实验室合作，发现周 期蛋白B，证明与p45和p56cdห้องสมุดไป่ตู้13为同原物。
Tim Hunt, born 1943. Imperial Cancer Research Fund, Clare Hall Laboratories, South Mimms, UK.
Paul Nurse, born 1949. Imperial Cancer Research Fund, Lincoln's Inn Fields, London, UK.
这样，沿着不同路线研究细胞周期调控的 科学家的研究成果汇合到一点，奇异地发现 他们所研究的实际上是共同的东西，MPF即 P34cdc2和cyclin B. 这样一个概念逐渐明朗起 来：从酵母到海洋无脊椎动物一直到人类的 所有真核细胞中存在一个共同的生化分子机 制来调节M期启动。因而Nurse（1990）年提 出了“M期启动调节的普遍机制”这一概念。
不同形态的PCC
G1期PCC为单线状，因DNA未复制；S期PCC为 粉末状，因DNA由多个部位开始复制；G2期PCC 为双线染色体，说明DNA复制已完成。
人M期细胞与袋鼠 （Ptk）G1、S、G2 期细胞融合诱导 PCC：提示M期细 胞存在诱导PCC的 因子；
不仅同类M期细胞可以诱导PCC，不同类的
2001年的诺贝尔医学奖的获得者为 一位美国科学家与两位英国科学家，他们 在细胞研究领域取得了重大发现，这些发 现有可能引导人们找到治疗癌症的新方法。 美联社的记者对此评论说，科学家们所做 的工作将使人们对癌症有了进一步的了解。
以P.Nurse为代表的另一批酵母生物学 家研究不同温度下培养的裂殖酵母细胞， 也分离出数十种温度敏感的突变体。这些 不同的突变体在限定温度下，会滞留在细 胞周期的某个阶段。这些与细胞分裂和周 期调控有关的基因被称为cdc(cell division cycle)基因，根据被发现的先后顺序被命 名。
1979年，Sunkara将不同时期Hela细胞的提取 液注射到蛙卵母细胞中，发现G1和S期的抽取 物不能诱导GVBD，而G2和M期的则具有促 进胚胞破裂的功能，它将这种诱导物质称为有 丝分裂因子(MF)。后来在CHO细胞，酵母和 粘菌中也提取出相同性质的MF。这类物质被 统称为MPF。
在此后20年里，许多学者致力于MPF的提纯， 试图揭示MPF的生化本质。