载体构建流程PPT课件
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工程菌构建载体介绍课件
PART 03
载体构建原理
质粒载体构建原理
质粒定义
质粒是一种裸露的、自我复制的双链环状DNA分 子，能稳定地独立存在于宿主细胞染色质或自主 复制的质粒DNA上，并表达其所携带的遗传信息。
质粒复制
质粒复制涉及复制起点、复制子、复制酶等要素， 通过复制酶的催化完成。
质粒特点
质粒具有分子量小、拷贝数高、不整合于宿主染 色体等特点。
基因表达元件包括启动子、 增强子、沉默子等，负责调 控基因的表达。
表达载体构建
通过基因工程技术将目的基 因插入表达载体，再导入受 体细胞，使目的基因得以表 达。
表达产物检测
通过检测表达产物的量与性 质，评估目的基因的表达情 况。
PART 04
载体构建流程
目的基因的
详细描述
基因工程在生物工程中具有广泛的应用价值，它可以 为农业提供抗病、抗虫和抗逆的转基因作物，提高产 量和降低农药使用；在医药领域，基因工程技术可用 于生产重组蛋白药物、基因治疗和疫苗开发等；在工 业领域，基因工程可用于微生物发酵生产化学品、生 物燃料和酶等；此外，基因工程还可用于环保领域， 如降解污染物和修复生态等。
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工程菌构建载体介绍 课件
目 录
• 工程菌与基因工程 • 载体构建原理 • 载体构建流程 • 载体构建的实验操作 • 载体构建的应用与展望
PART 01
引言
目的和背景
介绍工程菌构建载体 的概念和应用领域
探讨工程菌构建载体 在生物工程领域的重 要性和意义
分析工程菌构建载体 的研究现状和发展趋 势
实验试剂
限制性内切酶、T4 DNA连接酶、 DNA聚合酶、dNTPs等。
实验步骤与注意事项
载体构建流程
菌落PCR
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。 初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
酶切检测阳性克隆
将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。 要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。 选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切 下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克 隆。
挑取阳性克隆去测序
测序是构建载体的最后一个关键的环节，只有测 序正确的阳性克隆才算成功构建载体。 ORF序列不允许出现插入、缺失、改变氨基酸的 点突变，至于密码子简并突变以及相似氨基酸间 的突变要视客户要求或是否影响所研究蛋白的表 达、结构、功能。 不符合要求的测序文件需要重克隆或对其进行修 补。
转化
基本步骤： （1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。 （2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以 混匀内容物。 在冰上放置30分钟。 （3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将 管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。 （4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行 复苏。 （5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl 培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
回收前
回收后
酶切载体带 酶切目的条带
连接
PCR、载体构建及转化
挑菌
准备工作: 1、提前打开37℃摇床，开紫外灯杀菌。 2、灭菌的带盖的刻度试管，试管架，消毒的黄枪头， 镊子，Amp抗性的LB液体培养基。 步骤： 1、将Amp抗性的LB液体培养基分装入试管，每管46ml。 2、用黄色的枪头挑白色的单克隆，连带枪头放入试 管中。 3、盖上试管盖，置摇床中，37℃，170转摇培过夜 （16-18小时）。
1在超净台内将试管中的菌液移入15ml离心管中21000rpm离心10min其间取si和rnase3弃上清留沉淀4每管加入100lsi和rnase04lrnasea浓度为100mgml可提前算好总的si和rnasea用量混匀后分装于离心管中5充分涡旋均匀6计算好sii用量临时将04nnaoh2sds等体积混合于灭菌的三角7每管加入混合好的sii200l轻轻上下颠倒几次dna8插入冰盒中静置5min此时菌液变的清亮粘稠9每管加入siii150l上下颠倒数次此时有白色絮状沉淀出现
引物设计常用软件： DNAstar：序列分析
Primer5.0：引物设计
DNAman：序列比对 在线引物设计： http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/
2. 载体构建
T-Vector连接
反应体系： • 2×Ligation Buffer 2.5µl • Inset fraction 1.5µl • T-easy vector 0.5µl • T4-ligase 0.5µl 混匀后置16℃连接0.5- 小时。
蓝白斑筛选：
• 野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物Xgal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。
•设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型 菌株，无法作用于X-gal产生蓝色物质。 •操作中，添加IPTG以激活lacz‘中的β-半乳糖苷酶的启动子， 在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色（空载）。 •当外源DNA与含lacz‘的载体连接时，会插入进MCS，这种 重组质粒不再表达α 肽链，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可 分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。
人工染色体载体PPT课件
筛选第一受体的克隆子，一般采用抗菌素 抗性选择标记；
筛选第二受体的克隆子，常用与受体互补 的营养缺陷型。
人工染色体克隆载体的特点： 能容纳长达1000 kb甚至3000 kb的外源
DNA片段。
人工酵母染色体克隆载体的构建
YAC(酵母人工染色体)克隆载体是最早构建 成功的人工染色体克隆载体。
将酵母染色体DNA的端粒(TEL)、DNA复制 起点 (ARS)和着丝粒(CEN)以及必要的选择标记 (HISA4和TRPl)基因序列克隆到大肠杆菌质粒 pBR322中，构建成YCA克隆载体。
二、YAC载体的工作原理
ARS1
TRP1
EcoRI
CEN4
EcoRI
EcoRI EcoRI
Apr
pYAC4
URA3 BamHI
ori
TEL BamHI TEL
重组酵母染色体
连 接
转化酵母菌
03.01.2024
37
（红色，赤红色）
此克隆载体的sup4(抑制基因：抑制赭色 表型 )基因上，组装了供插入外源DNA片段 的克隆位。
③一个自主复制序列(ARS1)；
④两个来自嗜热四膜虫
(Tetrahymenna thermophilp)的末
端重复序列(TEL)，以保持重组
•03.01.2Y02A4 C为线状结构；
•39
⑤在两个末端序列中间，有 一段填充序列(HIS3)，以 便pYAC4在细菌细胞中稳 定扩增；
⑥Amp抗性及细菌质粒复制 原点；
常用的YAC克隆载体有3种：
pYAC3、pYAC4和pYAC5。
差别： 在sup4基因上的克隆位点不同，分别是
SnaBI、EcoRI和NotI。
1.2-2基因表达载体的构建(共15张PPT)【优秀课件】
1.2-2基因表达载体的构建(共15张PPT )【优 秀课件 】
1.日本那些再现曲水宴的表演，有着 不少“中 国元素”，但是 由于现 代年轻 人对古 代中国 文化了 解甚少 ，并不 知道哪 些元素 来自中 国。 2.本着保证校车安全的原则，公安机 关将会 同教育 行政等 部门对 校车驾 驶人进 行逐一 审查， 坚决清 退不符 合安全 规定的 校车驾 驶人。 3.山寨文化是一种平民文化、草根文 化，自 然有其 存在的 意义和 价值， 但山寨 产品的 泛滥则 是中国 知识产 权意识 不足的 揭露与 讽刺。
谢谢观赏 4.神舟7号宇宙飞船载着三位航天英雄胜利返回地球，这艘宇宙飞船是我们国家自行研制的，每一个中国人不能不为之骄傲。 5.这家工厂虽然规模不大，但曾两次 荣获省 科学大 会奖， 三次被 授予省 优质产 品称号 ，产品 远销全 国各地 和东南 亚地区 。 6.杭州湾跨海大桥是一座由我国自行 建造、 自行设 计、自 行管理 、自行 投资的 特大型 交通基 础设施 ，是我 国跨海 大桥建 设史上 的一个 重要里 程碑。 7、为防止东南亚地区发生的禽流感 传入我 国，国 家质检 总局和 农业部 今天联 合发出 通知， 自即日 暂行禁 止进口 来自疫 区的禽 类及其 产品。
基因工程的基本操作程序P8
目的基因的获取 方法
目的基因的获取可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工 的方法合成。1.从基因中获取2.利用PCR
技术扩增目 的基因
3.化学方法直
接人工合成
第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
1.基因表达载体构建的
使目的基因在受体细胞中 稳定存在 ，并且可以遗传给下一代 使目的基因能够___表_达____和 发挥作用 。
1.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是（ C ）
1.日本那些再现曲水宴的表演，有着 不少“中 国元素”，但是 由于现 代年轻 人对古 代中国 文化了 解甚少 ，并不 知道哪 些元素 来自中 国。 2.本着保证校车安全的原则，公安机 关将会 同教育 行政等 部门对 校车驾 驶人进 行逐一 审查， 坚决清 退不符 合安全 规定的 校车驾 驶人。 3.山寨文化是一种平民文化、草根文 化，自 然有其 存在的 意义和 价值， 但山寨 产品的 泛滥则 是中国 知识产 权意识 不足的 揭露与 讽刺。
谢谢观赏 4.神舟7号宇宙飞船载着三位航天英雄胜利返回地球，这艘宇宙飞船是我们国家自行研制的，每一个中国人不能不为之骄傲。 5.这家工厂虽然规模不大，但曾两次 荣获省 科学大 会奖， 三次被 授予省 优质产 品称号 ，产品 远销全 国各地 和东南 亚地区 。 6.杭州湾跨海大桥是一座由我国自行 建造、 自行设 计、自 行管理 、自行 投资的 特大型 交通基 础设施 ，是我 国跨海 大桥建 设史上 的一个 重要里 程碑。 7、为防止东南亚地区发生的禽流感 传入我 国，国 家质检 总局和 农业部 今天联 合发出 通知， 自即日 暂行禁 止进口 来自疫 区的禽 类及其 产品。
基因工程的基本操作程序P8
目的基因的获取 方法
目的基因的获取可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以用人工 的方法合成。1.从基因中获取2.利用PCR
技术扩增目 的基因
3.化学方法直
接人工合成
第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）
1.基因表达载体构建的
使目的基因在受体细胞中 稳定存在 ，并且可以遗传给下一代 使目的基因能够___表_达____和 发挥作用 。
1.下列有关抗虫基因表达载体的叙述，正确的是（ C ）
载体构建流程pp课件
• 切胶回收PCR产物时，避免DNA在紫外线下暴露时间过长 从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。
• 凝胶电泳检测纯化后的PCR产物的浓度，优化连接反应时 插入片段与载体摩尔比例为2:1~10:1（通常为3:1）。
• PCR产物及载体应尽量避免反复冻融，否则易造成3’末端 残基的丢失。
• 一般连接25度2小时，16或4度过夜。
• 另外酶切后纯化前，均需热灭活，以免残余的限 制性内切酶干扰后续连接反应，降低阳性率。
15
回收前
回收后
酶切载体带 酶切目的条带
16
连接
• 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二 酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。
• PCR产物最好进行切胶回收纯化，以去除PCR产物中的非特 异性片段和引物等杂质。
• 初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
20
酶切检测阳性克隆
• 将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。
• 要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。
• 选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切 下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克 隆。
• 什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温 度太高等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温 度或做个梯度，摸一下条件。
10
PCR产物纯化
• 倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的杂蛋 白、离子等会造成酶切困难或星活性，残 余的聚合酶也会填平粘性末端，造成克隆 失败。
21
挑取阳性克隆去测序
• 测序是构建载体的最后一个关键的环节，只有测 序正确的阳性克隆才算成功构建载体。
• 凝胶电泳检测纯化后的PCR产物的浓度，优化连接反应时 插入片段与载体摩尔比例为2:1~10:1（通常为3:1）。
• PCR产物及载体应尽量避免反复冻融，否则易造成3’末端 残基的丢失。
• 一般连接25度2小时，16或4度过夜。
• 另外酶切后纯化前，均需热灭活，以免残余的限 制性内切酶干扰后续连接反应，降低阳性率。
15
回收前
回收后
酶切载体带 酶切目的条带
16
连接
• 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二 酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。
• PCR产物最好进行切胶回收纯化，以去除PCR产物中的非特 异性片段和引物等杂质。
• 初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
20
酶切检测阳性克隆
• 将菌检的阳性克隆所得质粒进行酶切分析，获得预期 条带的即为阳性克隆。
• 要进一步确认是否有因PCR所带来的点突变，插入， 缺失等改变目的基因的序列，还需要对阳性克隆进行 测序。
• 选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切 下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克 隆。
• 什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温 度太高等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温 度或做个梯度，摸一下条件。
10
PCR产物纯化
• 倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的杂蛋 白、离子等会造成酶切困难或星活性，残 余的聚合酶也会填平粘性末端，造成克隆 失败。
21
挑取阳性克隆去测序
• 测序是构建载体的最后一个关键的环节，只有测 序正确的阳性克隆才算成功构建载体。
2023届高三一轮复习生物：基因表达载体的构建、目的基因的导入课件
谢谢聆听
知新： 阅读书本P81资料卡，解决农杆菌转化法的相关问题：
资料1: 农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下侵染双子 叶植物和裸子植物，而对绝大多数单子叶植物没有侵染能力。
资料2: 农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上 的T—DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其 整合到该细胞的染色体DNA上
图中质粒没有标明的结构是___________，该结构的作用是_____________________T。—DNA
（2）过程②常用农杆菌转化法将重组质粒导入愈染伤色组体织D，NA该方法能够借助Ti质粒上的_______
将BT毒蛋白基因整合到愈伤组织的________________________。
2、如何处理受体细胞？
吸收
Ca2+处理
3、处理后的细胞具备什么样的特点？
细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
Ca2+ 感受态细胞
【典例】下列关于目的基因导入受体细胞的方法中，不正确的是( D )
A.我国利用花粉管通道法培育了转基因抗虫棉 B.用Ca2＋处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞 C.将目的基因导入动物细胞最常用、最有效的方法是显微注射法 D.利用农杆菌转化法培育大多单子叶转基因植物
【习题检测】下图是基因工程培育抗虫植物的示意图。下列叙述正确的是( D )
A．②的构建需要限制性内切核酸酶和DNA聚合酶参与B．③ 侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上C．④的染 色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状D．⑤只要表现 出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异
【习题检测】玉米是二倍体植物，某科研人员将BT毒蛋白基因导入玉米细胞，培育转基因抗虫玉
《载体构建流程》课件
度。
案例三：物联网设备中的载体应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
物联网设备中的载体构建主要关注设备的物理设计、通信 协议和数据传输等方面。
在物联网设备中，载体构建涉及设备的外观设计、内部结 构、通信协议选择和数据传输方案等。一个优秀的物理设 计能够确保设备的稳定性和耐用性；合理的通信协议选择 能够提高设备间的通信效率和稳定性；而高效的数据传输 方案则能够确保设备收集的数据能够及时准确地传输到中 心服务器进行处理。
使用调试技术定位和解决 载体构建过程中的错误和 异常，确保载体的稳定性 和可靠性。
04
载体构建的实际应用案例
案例一：网站建设中的载体应用
总结词
网站建设是载体构建的重要应用领域，通过合理的架构设计和内容规划，能够提高网站的可用性和用户体验。
详细描述
在网站建设中，载体构建主要涉及网站的页面设计、布局、导航、内容组织等方面。通过合理的页面设计，可以 提升网站的视觉效果和吸引力；合理的布局和导航设计，可以提高用户浏览和查找信息的效率；而合理的内容规 划，则能够确保网站提供的信息具有价值，满足用户需求。
载体制作
编程实现
根据设计稿，使用编程语言和工 具实现载体功能。
素材准备
准备所需的图片、音频、视频等 素材，确保内容质量。
测试与调试
在制作过程中，对载体进行测试 和调试，确保功能正常。
载体测试
功能测试
对载体的各项功能进行测试，确保其正常工作。
兼容性测试
测试载体在不同操作系统、浏览器等环境下的兼 容性。
案例四：游戏开发中的载体应用
总结词
游戏开发中的载体构建主要关注游戏画面的表现力、操 作体验和游戏机制等方面。
详细描述
案例三：物联网设备中的载体应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
物联网设备中的载体构建主要关注设备的物理设计、通信 协议和数据传输等方面。
在物联网设备中，载体构建涉及设备的外观设计、内部结 构、通信协议选择和数据传输方案等。一个优秀的物理设 计能够确保设备的稳定性和耐用性；合理的通信协议选择 能够提高设备间的通信效率和稳定性；而高效的数据传输 方案则能够确保设备收集的数据能够及时准确地传输到中 心服务器进行处理。
使用调试技术定位和解决 载体构建过程中的错误和 异常，确保载体的稳定性 和可靠性。
04
载体构建的实际应用案例
案例一：网站建设中的载体应用
总结词
网站建设是载体构建的重要应用领域，通过合理的架构设计和内容规划，能够提高网站的可用性和用户体验。
详细描述
在网站建设中，载体构建主要涉及网站的页面设计、布局、导航、内容组织等方面。通过合理的页面设计，可以 提升网站的视觉效果和吸引力；合理的布局和导航设计，可以提高用户浏览和查找信息的效率；而合理的内容规 划，则能够确保网站提供的信息具有价值，满足用户需求。
载体制作
编程实现
根据设计稿，使用编程语言和工 具实现载体功能。
素材准备
准备所需的图片、音频、视频等 素材，确保内容质量。
测试与调试
在制作过程中，对载体进行测试 和调试，确保功能正常。
载体测试
功能测试
对载体的各项功能进行测试，确保其正常工作。
兼容性测试
测试载体在不同操作系统、浏览器等环境下的兼 容性。
案例四：游戏开发中的载体应用
总结词
游戏开发中的载体构建主要关注游戏画面的表现力、操 作体验和游戏机制等方面。
详细描述
载体构建
载体构建
载体种类： 载体种类：
1.原核表达载体 2.真核表达载体 3.病毒表达载体（是真核载体的一种） 4.克隆载体
构建载体种类取决与实验的需要： 构建载体种类取决与实验的需要 本实验最常见的载体构建类型： 1. 构建基因表达载体 2. 构建microRNA表达载体 3. 构建shRNA干扰载体
基因表达载体的构建： 基因表达载体的构建 考虑问题： 考虑问题： 1. 选用什么样的表达载体？ 选用什么样的表达载体？
1）普通真核表达载体 ） 2）病毒载体 ） ①慢病毒载体（因模板从哪里来？
1）PCR从cDNA模板中扩增 ） 从 模板中扩增 2）商业化的IMAGE 克隆中扩增 ）商业化的
基因模板从哪里来？ 基因模板从哪里来？ 1）PCR从cDNA模板中扩增 ） 从 模板中扩增 引物设计最好采用巢式PCR方法 方法 引物设计最好采用巢式
5‘非翻译区 CDS区 3‘非翻译区
（内引物） 内引物） 初次PCR引物设计（外引物） 引物设计（外引物） 初次 引物设计 2）商业化的IMAGE 克隆中扩增 ）商业化的 直接设计与载体匹配的引物
在本次载体构 建：可以添加 AC,最后与C 组成三联体密 码（只要不是 终止码）
后续过程： 1.NESG1 PCR 扩增，纯化，EcoRI和KpnI酶切，纯化
2.质粒扩增，提取纯化, EcoRI和KpnI酶切线性化，低浓度琼脂糖电泳，胶回 收纯化 3.模板与线性化质粒连接
4.转化感受态大肠杆菌
5.鉴定（PCR、双酶切和测序鉴定）
选择载体的优缺点： 选择载体的优缺点： 1.普通真核表达载体 普通真核表达载体 优点：多克隆位点比较多， 优点：多克隆位点比较多，易于构建 缺点：建立稳定转染细胞时间长， 缺点：建立稳定转染细胞时间长，耗时耗力
载体种类： 载体种类：
1.原核表达载体 2.真核表达载体 3.病毒表达载体（是真核载体的一种） 4.克隆载体
构建载体种类取决与实验的需要： 构建载体种类取决与实验的需要 本实验最常见的载体构建类型： 1. 构建基因表达载体 2. 构建microRNA表达载体 3. 构建shRNA干扰载体
基因表达载体的构建： 基因表达载体的构建 考虑问题： 考虑问题： 1. 选用什么样的表达载体？ 选用什么样的表达载体？
1）普通真核表达载体 ） 2）病毒载体 ） ①慢病毒载体（因模板从哪里来？
1）PCR从cDNA模板中扩增 ） 从 模板中扩增 2）商业化的IMAGE 克隆中扩增 ）商业化的
基因模板从哪里来？ 基因模板从哪里来？ 1）PCR从cDNA模板中扩增 ） 从 模板中扩增 引物设计最好采用巢式PCR方法 方法 引物设计最好采用巢式
5‘非翻译区 CDS区 3‘非翻译区
（内引物） 内引物） 初次PCR引物设计（外引物） 引物设计（外引物） 初次 引物设计 2）商业化的IMAGE 克隆中扩增 ）商业化的 直接设计与载体匹配的引物
在本次载体构 建：可以添加 AC,最后与C 组成三联体密 码（只要不是 终止码）
后续过程： 1.NESG1 PCR 扩增，纯化，EcoRI和KpnI酶切，纯化
2.质粒扩增，提取纯化, EcoRI和KpnI酶切线性化，低浓度琼脂糖电泳，胶回 收纯化 3.模板与线性化质粒连接
4.转化感受态大肠杆菌
5.鉴定（PCR、双酶切和测序鉴定）
选择载体的优缺点： 选择载体的优缺点： 1.普通真核表达载体 普通真核表达载体 优点：多克隆位点比较多， 优点：多克隆位点比较多，易于构建 缺点：建立稳定转染细胞时间长， 缺点：建立稳定转染细胞时间长，耗时耗力
载体构建流程ppt课件
寒假来临，不少的高中毕业生和大学 在校生 都选择 去打工 。准备 过一个 充实而 有意义 的寒假 。但是 ，目前 社会上 寒假招 工的陷 阱很多
菌落PCR
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。
初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温 度太高等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温 度或做个梯度，摸一下条件。
寒假来临，不少的高中毕业生和大学 在校生 都选择 去打工 。准备 过一个 充实而 有意义 的寒假 。但是 ，目前 社会上 寒假招 工的陷 阱很多
PCR产物纯化
选用的酶通常为设计引物的两个酶，因为它能完整切 下ORF和载体骨架，可以通过条带大小以判断阳性克 隆。
寒假来临，不少的高中毕业生和大学 在校生 都选择 去打工 。准备 过一个 充实而 有意义 的寒假 。但是 ，目前 社会上 寒假招 工的陷 阱很多
挑取阳性克隆去测序
测序是构建载体的最后一个关键的环节，只有测 序正确的阳性克隆才算成功构建载体。
寒假来临，不少的高中毕业生和大学 在校生 都选择 去打工 。准备 过一个 充实而 有意义 的寒假 。但是 ，目前 社会上 寒假招 工的陷 阱很多
I 载体构建流程
提取mRNA RT
PCR
cDNA
得到目的基因
PCR产物纯化
菌落PCR 转化 连接
纯化酶切产物
酶切目的基因和载体
保菌
挑取生和大学 在校生 都选择 去打工 。准备 过一个 充实而 有意义 的寒假 。但是 ，目前 社会上 寒假招 工的陷 阱很多
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所以此步对整个分子克隆都至关重要，可 适当用酚抽提、柱纯化，必要的话也可以 胶回收。
.
11
酶切目的基因和载体
.
12
酶切注意事项
两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切 完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温 要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同， 先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反 应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的 活性。
.
4
RT
由于真核基因是由非编码的内含子将ORF分隔开 来的断裂基因，若以基因组为模板PCR得到的片 段克隆进载体，不能在原核细胞剪接内含子，也 不能在非对象真核细胞中正确剪接表达。所以要 克隆真核蛋白基因，需以不含内含子的连续编码 的mRNA为模板。
PCR耐热酶不能直接以mRNA为模板扩增，必须 通过逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA,再以cDNA 为模板扩增目的基因。
经典载体构建流程
.
1
I 载体构建流程
RT
PCR
提取mRNA
cDNA
得到目的基因
PCR产物纯化
菌落PCR 转化 连接
纯化酶切产物
酶切目的基因和载体
保菌
挑取阳性克隆去测序
测序正确的摇菌提质粒
.
导入表达宿主 测试表达情况2
.
3
提取mRNA
如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心 机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保 持清洁，并定期进行消毒。.操作过程中应自始至 终佩戴口罩和手套，并经常更换，以避免将手、 臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带 入试管或污染用具。操作过程所用器材都要经过 特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品 采用 连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵 180
形
DNA 2
成
条变 单性
子链延伸 DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
.
7
.
8
PCR常出现的问题
1.假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条
带一致， 有时其条带更整齐，亮度更高 2.出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带 与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现 特异性扩增带与非特异性扩增带 3.什么条带都没有
.
17
.
18
转化
基本步骤： （1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。 （2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以
混匀内容物。 在冰上放置30分钟。 （3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将
管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。 （4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行
另外酶切后纯化前，均需热灭活，以免残余的限 制性内切酶干扰后续连接反应，降低阳性率。
.
15
回收前
酶切载体带 酶切目的条带
.
回收后
16
连接
催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二 酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。
PCR产物最好进行切胶回收纯化，以去除PCR产物中的非 特异性片段和引物等杂质。
复苏。 （5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl
培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
.
19
菌落PCR
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。
初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
.
20
酶切检测阳性克隆
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出 现星号活性，可通过增加反应体系的总体积的方 法实现这一要求。
.
13
酶切常见问题
.
14
纯化酶切产物
通常此步是必要的，可以对比未经纯化的酶切产 物进行连接后获得的阳性克隆大大低于胶回收酶 切产物连接所得阳性克隆。
此步的目的是去除多余的片段，得到单一纯化的 目的基因与载体骨架，使之连接不受其他序列干 扰。
.
9
解决方法
假阳性的原因及解决方法：可能引物设计不合适：选择的扩增序列与 非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产 物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需 重新设计引物。还有就是靶序列或扩增产物的交叉污染 。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引 物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出 现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特 异性扩增。 其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调 换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。 ④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与
根据不同的目的，可有三类引物选择
.
5
.
6
PCR得到目的基因
刚开始摸条件时，
都会先做一个梯
度PCR，选出最
适条件。
94
由于此步为获
温
度 72
取正确的目的基 （℃）
因，所以尽量避
55
免PCR的突变格
外重要。其中所
采取的措施有：
22
使用高保真酶、
循环次数控制在
300cycle左右、
引物设计合理等。
1
延伸)。
什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温 度太高等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温 度或做个梯度，摸一下条件。
.
10
PCR产物纯化
倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的杂 蛋白、离子等会造成酶切困难或星活性， 残余的聚合酶也会填平粘性末端，造成克 隆失败。
切胶回收PCR产物时，避免DNA在紫外线下暴露时间过长 从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。
凝胶电泳检测纯化后的PCR产物的浓度，优化连接反应时 插入片段与载体摩尔比例为2:1~10:1（通常为3:1）。
PCR产物及载体应尽量避免反复冻融，否则易造成3’末端 残基的丢失。
一般连接25度2小时，16或4度过夜。
.
11
酶切目的基因和载体
.
12
酶切注意事项
两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切 完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温 要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同， 先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反 应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的 活性。
.
4
RT
由于真核基因是由非编码的内含子将ORF分隔开 来的断裂基因，若以基因组为模板PCR得到的片 段克隆进载体，不能在原核细胞剪接内含子，也 不能在非对象真核细胞中正确剪接表达。所以要 克隆真核蛋白基因，需以不含内含子的连续编码 的mRNA为模板。
PCR耐热酶不能直接以mRNA为模板扩增，必须 通过逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA,再以cDNA 为模板扩增目的基因。
经典载体构建流程
.
1
I 载体构建流程
RT
PCR
提取mRNA
cDNA
得到目的基因
PCR产物纯化
菌落PCR 转化 连接
纯化酶切产物
酶切目的基因和载体
保菌
挑取阳性克隆去测序
测序正确的摇菌提质粒
.
导入表达宿主 测试表达情况2
.
3
提取mRNA
如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心 机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保 持清洁，并定期进行消毒。.操作过程中应自始至 终佩戴口罩和手套，并经常更换，以避免将手、 臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带 入试管或污染用具。操作过程所用器材都要经过 特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品 采用 连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵 180
形
DNA 2
成
条变 单性
子链延伸 DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
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PCR常出现的问题
1.假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条
带一致， 有时其条带更整齐，亮度更高 2.出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带 与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现 特异性扩增带与非特异性扩增带 3.什么条带都没有
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17
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18
转化
基本步骤： （1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。 （2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以
混匀内容物。 在冰上放置30分钟。 （3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将
管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。 （4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行
另外酶切后纯化前，均需热灭活，以免残余的限 制性内切酶干扰后续连接反应，降低阳性率。
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回收前
酶切载体带 酶切目的条带
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回收后
16
连接
催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二 酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。
PCR产物最好进行切胶回收纯化，以去除PCR产物中的非 特异性片段和引物等杂质。
复苏。 （5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl
培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
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19
菌落PCR
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。
初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
.
20
酶切检测阳性克隆
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出 现星号活性，可通过增加反应体系的总体积的方 法实现这一要求。
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13
酶切常见问题
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纯化酶切产物
通常此步是必要的，可以对比未经纯化的酶切产 物进行连接后获得的阳性克隆大大低于胶回收酶 切产物连接所得阳性克隆。
此步的目的是去除多余的片段，得到单一纯化的 目的基因与载体骨架，使之连接不受其他序列干 扰。
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9
解决方法
假阳性的原因及解决方法：可能引物设计不合适：选择的扩增序列与 非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产 物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需 重新设计引物。还有就是靶序列或扩增产物的交叉污染 。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引 物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出 现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特 异性扩增。 其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调 换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。 ④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与
根据不同的目的，可有三类引物选择
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5
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6
PCR得到目的基因
刚开始摸条件时，
都会先做一个梯
度PCR，选出最
适条件。
94
由于此步为获
温
度 72
取正确的目的基 （℃）
因，所以尽量避
55
免PCR的突变格
外重要。其中所
采取的措施有：
22
使用高保真酶、
循环次数控制在
300cycle左右、
引物设计合理等。
1
延伸)。
什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温 度太高等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温 度或做个梯度，摸一下条件。
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10
PCR产物纯化
倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的杂 蛋白、离子等会造成酶切困难或星活性， 残余的聚合酶也会填平粘性末端，造成克 隆失败。
切胶回收PCR产物时，避免DNA在紫外线下暴露时间过长 从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。
凝胶电泳检测纯化后的PCR产物的浓度，优化连接反应时 插入片段与载体摩尔比例为2:1~10:1（通常为3:1）。
PCR产物及载体应尽量避免反复冻融，否则易造成3’末端 残基的丢失。
一般连接25度2小时，16或4度过夜。