23 生物化学实验--二乙酰一肟显色法测定血清尿素氮
二乙酰一肟法测定血清尿素
3) 肾后性疾病：所有使尿路阻塞的因素都可引起血
液中尿素含量增高,如前列腺肿大、尿路结石、尿
道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道受压等。
1．血液尿素浓度增高
分生理性和病理性因素两方面。
(1)生理因素：
高蛋白饮食引起血清尿素浓度和尿液排出量显
著增高。血清尿素浓度男性比女性平均高0.3～ 0.5mmol/L，随年龄增加有增高倾向。成人日间生 理变异平均为0.63mmol/L。
(2) 病理因素
1) 肾前性疾病：最重要的原因是失水，因血液浓
0.02 ——
0.50 5.0
—— ——
0.50 5.0
—— ——
0.50 5.0
蒸馏水
二乙酰一肟试 剂 酸性试剂
混匀后，置沸水浴中加热12min，取出置冷水中冷却5min，波长 540nm，空白管调零，分别读取各管吸光度 。
沸水浴中加热12min
冷水浴中冷却5min
标准管
测定管
标准l / L ) A 测定 A 标准 5 mmol/L
（A为吸光度值，取平均值）
参考范围：1.78~7.14mmol/L
七、注意事项
1.血标本应及时处理，以防尿素酶水解尿素。最好血标
本加草酸钾或氟化钠抗凝以抑制尿素酶。
2.本法试剂单一，方法简便，但试剂具毒性和腐蚀性。
3.煮沸时间和煮沸时液体蒸发量影响结果。因此测定和
2.血清尿素浓度降低
除婴儿、孕妇以及低蛋白高糖饮食者外,常见
于肝功能衰竭患者。
测定血清尿素的实验报告
一、实验目的1. 掌握血清尿素测定的原理和方法。
2. 熟悉二乙酰-肟法测定血清尿素氮的实验操作。
3. 了解实验中可能出现的误差及其处理方法。
二、实验原理血清尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）是血液中尿素氮的浓度，是反映肾功能的重要指标。
尿素氮是蛋白质代谢的终产物，主要由肝脏产生，通过肾脏排泄。
二乙酰-肟法是一种常用的测定血清尿素氮的方法，其原理如下：在酸性反应环境中加热，尿素与二乙酰缩合，生成色素原二嗪，称为Feorin反应。
因为二乙酰不稳定，所以通常由反应系统中二乙酰-肟与强酸作用，产生二乙酰，二乙酰与尿素反应，综合生成红色的二嗪。
其颜色的深浅与血清中尿素含量成正比。
三、实验材料1. 试剂：- 碱性试剂：在三角烧瓶中加蒸馏水约100ml，然后加入浓硫酸44ml及85%H3PO466ml冷至室温，加入硫氨脲50mg及硫酸镉2g溶解后加蒸馏水稀释至1升，置棕色瓶放冰箱保存，可稳定半年。
- 二乙酰-肟溶液：称取二乙酰-肟20g，加蒸馏水约900ml溶解后，再用蒸馏水稀释至1升置棕色瓶中，贮存放于冰箱内可保存半年不变。
- 尿素标准贮存液（100mmol/L）：称取干燥纯尿素（MW60.06）0.6g，溶解于水中并稀释至100毫升，加0.1g叠氮钠防腐，置冰箱内稳定六个月。
- 尿素标准应用液（5mmol/L）：取5.0ml贮存液用去氨蒸馏水稀释至100ml。
2. 仪器：- 分光光度计- 离心机- 实验室试管四、实验步骤1. 标准曲线的绘制：- 取5支试管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0ml尿素标准应用液，用去氨蒸馏水稀释至5.0ml。
- 向每支试管中加入2.0ml碱性试剂，混匀。
- 将试管置于沸水中加热5分钟，取出冷却至室温。
- 以540nm波长，1cm光程，测定各管吸光度。
- 以尿素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 样品测定：- 取2支试管，分别加入0.5ml血清和0.5ml尿素标准应用液，用去氨蒸馏水稀释至5.0ml。
二乙酰一肟法测尿素的原理
二乙酰一肟法测尿素的原理二乙酰一肟法是一种常用于测定尿素含量的方法。
该方法基于尿素能与二乙酰一肟发生反应生成氨基脲的原理。
下面将详细介绍二乙酰一肟法测尿素的原理。
尿素是生物体代谢产物，也是一种重要的氮源。
测定尿素的含量对于了解生物体的氮代谢及肾功能等具有重要意义。
二乙酰一肟法是一种常用的尿素测定方法，其基本原理为将尿素与二乙酰一肟发生酰化反应，生成氨基脲。
具体的操作步骤如下：1. 取一定量的尿液样品，加入适量的三氯乙酸，使尿液中的尿素脱氢酶等酶失活。
2. 加入适量的二乙酰一肟试剂，与尿素发生反应生成氨基脲。
二乙酰一肟试剂的作用是使尿素与一肟酯发生酰化反应，生成稳定的酰尿素化合物。
3. 反应结束后，在碱性条件下，氨基脲水解，生成氨气。
可以利用此氨气的生成量来测定尿素的含量。
4. 使用比色法或者气相色谱法等进行测定，根据标准曲线计算出尿液中的尿素含量。
二乙酰一肟法测尿素的原理主要基于尿素与二乙酰一肟反应生成酰尿素的特性。
此反应是一个酯化反应，发生在酸性条件下。
二乙酰一肟试剂作为试剂，可反应生成具有稳定性和可检测性的酰尿素化合物。
此后，在碱性条件下，酰尿素水解生成氨气。
为了提高测定的准确性，二乙酰一肟法还可以结合其他方法进行测定。
例如，可以在水解反应结束后，用酚酞指示剂测定氨气生成量的酸度滴定法，或者使用离子选择电极进行电位测定。
这些方法可以更加准确地测定尿素的含量。
总结起来，二乙酰一肟法是通过尿素与二乙酰一肟试剂发生酰化反应生成氨基脲，再经过水解反应生成氨气来测定尿素含量的一种方法。
这种方法简单、灵敏且准确，因此被广泛应用于尿液中尿素含量的测定。
二乙酰一肟法测定血清尿素(精)
3) 肾后性疾病：所有使尿路阻塞的因素都可引起血液中尿 素含量增高，如前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱 肿瘤致使尿道受压等。
2．血尿素浓度降低除婴儿、孕妇以及低蛋白高糖饮食者 外，常见于肝功能衰竭患者。
【注意事项】
1．试剂中加入氨基硫脲和镉离子，可增进显色强度和色泽 稳定性，但仍有轻度褪色现象，(每小时小于5%)。煮沸显色 经冷却后，应及时比色。
2．尿液中尿素也可用此法测定，但因浓度高，需先用去离 子水作50倍以上稀释。
3．尿素浓度以前习惯用尿素氮mg/dl表示，因为一个尿素分 子中有2个氮原子，所以1mmol尿素相当于28mg尿素氮 (1mmol/L尿素相当于2.8mg/dL尿素氮)；另外还有以尿素氮 mmol/L表示，则1mmol/L尿素＝2mmol/L尿素氮。世界卫生 组织推荐尿素用mmol/L表示，我国卫生部临检中心也已规 定一律使用此表示方法，不再用尿素氮一词。
【原理】本实验采用二乙酰一肟法测定血清尿素氮。二乙酰 一肟法系根据双乙酰与尿素形成二嗪衍生物的有色复合物 的显色反应。由于双乙酰本身不稳定，故用二乙酰一肟来 代替，其反应式如下：
二乙酰在强酸条件下与尿素缩合成红色的4，5-二甲基-2氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰 不稳定，故由试剂中二乙酰一肟与强酸作用产生二乙酰。
3．二乙酰一肟法的主要干扰来自血清中存在的含氮化合物。很多其它 化合物在结构中会有尿素的残基，如瓜氨酸、四氧嘧啶和尿囊素，虽然 也会产生一种带颜色的产物，但这些化合物在血清中浓度很低，故很少 引起明显的干扰。另一些其它的化合物在血清中浓度高，但这些色素的 最大吸收峰不同，因此不产生明显干扰。胆红素达171μmol/L、血红蛋 白达10g/L入物(ml) 空白管 标准管 测定管 基础管 回收管
测血清尿素含量实验报告
一、实验目的1. 掌握血清尿素含量测定的原理和方法；2. 熟悉实验操作步骤，提高实验技能；3. 了解血清尿素在临床医学中的意义。
二、实验原理血清尿素含量测定采用二乙酰-肟法，其原理如下：在强酸条件下，二乙酰与尿素发生缩合反应，生成红色的4,5-二甲基-2-氧咪唑化合物。
该化合物的颜色深浅与尿素的含量成正比。
通过比色法，可以计算出血清中尿素的含量。
三、实验材料1. 试剂：二乙酰-肟试剂、血清、盐酸、氢氧化钠、蒸馏水等；2. 仪器：紫外可见分光光度计、移液器、试管、试管架等。
四、实验步骤1. 标准曲线绘制：（1）取6支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的标准尿素溶液；（2）向各试管加入2ml的二乙酰-肟试剂，充分混匀；（3）将试管置于60℃水浴中反应30分钟；（4）取出试管，用蒸馏水定容至5ml；（5）以蒸馏水为空白，在波长540nm处测定各管的光密度（OD）；（6）以尿素浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 血清尿素含量测定：（1）取6支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml的血清样本；（2）按照标准曲线绘制步骤中的操作，进行反应和测定；（3）以蒸馏水为空白，在波长540nm处测定各管的光密度（OD）；（4）根据标准曲线，计算血清中尿素的含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：绘制标准曲线，结果显示尿素浓度与光密度呈线性关系，相关系数R²=0.998。
2. 血清尿素含量测定：根据标准曲线，计算各血清样本中尿素的含量，结果如下：样本1：尿素含量为5.2mmol/L；样本2：尿素含量为6.8mmol/L；样本3：尿素含量为7.4mmol/L；样本4：尿素含量为8.2mmol/L；样本5：尿素含量为9.0mmol/L；样本6：尿素含量为10.0mmol/L。
六、实验讨论1. 实验过程中，二乙酰-肟试剂的浓度、反应时间、温度等因素对实验结果有较大影响，应严格控制实验条件，以保证结果的准确性。
实验五血清尿素氮的测定
血清尿素氮的测定一.实验原理血清中尿素在氨基硫脲存在下，与二乙酰一肟在强酸溶液中共煮时，可生成双乙酰和尿素形成的红色复合物(二嗪衍生物)，其颜色深浅与尿素含量成正比，与同样处理的尿素标准液比色。
即可求得血清中尿素的含量。
由于反应在强酸中进行，所产生的羟胺是干挠物质，所以必须用氧化剂将其氧化除去。
在呈色反应中产生的有色复合物对光不稳定．加入氨基硫脲可增加其稳定性，还可提高尿素与双乙酰反应的灵敏度。
二.实验操作取试管3支，注明空白管、标准管、测定管，按下表操作540nm比色，以空白管调零，测定各管吸光度值。
三.计算血清尿素氮（mmol / L ）=——————— X 17.85 测定管吸光度标准管吸光度正常值参考范围3．57～14．28mmol ／L四.临床意义血液中非蛋白含氮化合物包括尿素、尿酸、肌酸、肌酐、 胆红素及氨等。
其中尿素含量约占l ／3～1／2。
尿素是蛋白质代谢的产物．通过肾脏排出，故测血清尿素氮可作为检测肾脏功能的试验，并且其增高程度与病变的严重程度呈平行关系。
五.试剂1.尿素氮试剂：蒸馏水lOOml ，浓硫酸44ml ，85％磷酸66ml ，冷却至室温后，加氨基硫脲50mg ，硫酸镉(3CdSO ４·8H 2O)2g ，溶解后稀释至1000ml 。
2.20g ／L 二乙酰一肟试剂：称取二乙酰一肟20g ，加入蒸馏水约900ml ，溶解后稀释至1000ml.３.尿素氮标准贮存液(357mmol ／L)：称取尿素1.072g 溶解于蒸馏水中定容至1000ml 。
４.尿素氮标准应用液(17.85mmol ／L)；取贮存液5ml ，加蒸馏水至100ml 。
血清尿素含量实验报告
一、实验目的1. 掌握血清尿素测定的原理和方法。
2. 熟悉生物化学实验的基本操作。
3. 了解二乙酰-肟法在血清尿素测定中的应用。
二、实验原理尿素是人体代谢过程中产生的废物，主要通过肾脏排泄。
血清尿素含量是反映肾功能和蛋白质代谢状况的重要指标。
本实验采用二乙酰-肟法测定血清尿素含量，该方法原理为：在强酸条件下，二乙酰与尿素缩合成红色的4,5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。
三、实验材料1. 实验试剂：二乙酰、浓硫酸、盐酸、尿素标准品、血清样品等。
2. 实验仪器：分光光度计、移液器、离心机、恒温水浴锅等。
四、实验方法1. 标准曲线绘制（1）准确称取尿素标准品，用去离子水配制成浓度为0.1mg/ml的标准储备液。
（2）取不同体积的标准储备液，分别加入一定量的二乙酰和浓硫酸，混匀，于60℃水浴中反应10分钟。
（3）取出反应液，冷却至室温，用盐酸调pH至5.0。
（4）在540nm波长下，用分光光度计测定吸光度。
（5）以尿素浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 血清尿素含量测定（1）取血清样品，用去离子水稀释至一定浓度。
（2）按照标准曲线绘制方法，测定稀释后血清样品的吸光度。
（3）根据标准曲线，计算血清尿素含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制通过绘制标准曲线，得到线性回归方程：y = 0.0127x + 0.0125（R²=0.9987），其中y为吸光度，x为尿素浓度。
2. 血清尿素含量测定测定某血清样品的吸光度为0.685，根据标准曲线计算得到尿素浓度为：0.685 = 0.0127x + 0.0125，解得x ≈ 50.2mg/dl。
因此，该血清样品的尿素含量为50.2mg/dl。
六、实验讨论1. 本实验采用二乙酰-肟法测定血清尿素含量，操作简便，结果准确。
2. 实验过程中，应注意二乙酰、浓硫酸等试剂的腐蚀性，佩戴防护用品。
3. 实验结果受血清样品、试剂质量、操作技巧等因素影响，应尽量减少误差。
血清尿素测定(精)
样本（微升） 校准液（微升） 蒸馏水（微升） 试剂R1（微升） 试剂R3（微升）
测定 10
50 1000
混匀，置37摄氏度水浴恒温5分钟 试剂R4（微升） 1000
校准 10 50 1000
1000
空白
10 50 1000
1000
混匀，置37摄氏度水浴恒温5分钟，600纳米波长，以空白管调零，测定 各管吸光度值。
血清尿素测定
尿素的测定方法
尿素（urea）是氨基酸分解代谢的最 终产物，在肝脏合成，通过血液运至肾 脏，从尿中排除。检测尿素的方法有二 乙酰一肟法和酶法。二乙酰一肟法操作 简便，仍为大多数基层医疗单位所采用。
脲酶波氏法是我们今天实验课所选用的 酶法。
பைடு நூலகம்
实验原理
脲酶水解样本中的尿素，产生两分子氨和一分 子的二氧化碳。氨在碱性条件下与酚及次氯酸 反应，在亚硝基铁氰化钠催化作用下生成蓝色 化合物，与经过同样处理的校准液进行比较， 即可计算出样本中尿素的含量。（终点法）
方法局限性
1.尿液尿素也可用此法测定，但因浓度 高（超过28mmol/L），需先用去离子 水稀释。
再乘以稀释倍数。 2.试剂变混浊或空白吸光度大于0.150，
将不能使用，应弃去。 3.所用试验器材必须清洁，避免氨污染。 4.试剂含化学成分，应避免氨污染。
环功能不全、心功能不全，休克等引起肾血流 量减少，肾小球滤过率减低而使血中尿素潴留； ②肾性：急性肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能 衰竭、慢性肾盂肾炎及中毒性肾炎都可出现血 中尿素含量增高。③肾后性疾患：如前列腺肿 大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道 受压等都可能使尿路阻塞引起血液中尿素含量 增加。 2.血清尿素减少 较少见，尿素减少表示严重 肝病，如肝炎合并广泛性肝坏死。
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二乙酰一肟显色法测定血清尿素氮
【目的】
1. 掌握二乙酰一肟显色法测定血清尿素氮的实验方法。
2. 熟悉二乙酰一肟显色法测定血清尿素氮的实验原理。
3. 了解血清尿素氮测定的临床意义。
【原理】
在酸性条件下加热，稳定的二乙酰一肟水解成不稳定的二乙酰，后者与血清中的尿素反应合成红色的二嗪化合物，其颜色深浅与尿素含量成正比。
与同样处理的尿素标准液比色可求得血清中的尿素含量。
其反应式如下：
【器材】
1 ．血清；
2 ．微量移液器；
3 ．刻度吸量管；
4. 沸水浴；
5. 分光光度计。
【试剂】
1 ．血清
新鲜人或动物血清，无溶血。
2 ．酸性试剂（或称尿素氮试剂）
在三角烧瓶中加蒸馏水约 100ml ，再加浓硫酸 4ml 及 85% 磷酸 66ml 。
冷至室温，加入氨基硫脲 50mg 及硫酸镉（CdSO 4 ·8H 2 O ） 2g （提高尿素与二乙酰反应灵敏度），溶解后用蒸馏水稀释至 1L 。
置棕色瓶在冰箱保存。
可稳定半年。
3 ．二乙酰一肟溶液
称取二乙酰一肟 20g 。
加蒸馏水约 900ml ，溶解后，再用蒸馏水稀释至 1L 。
置棕色瓶中，贮放冰箱内可保存半年不变。
4 ．尿素氮标准液（ 14mmol/L ， 19.6mg/dl ）
称取干燥纯尿素 4 2mg ，加少量蒸馏水溶解后，移入 100ml 容量瓶，加氯仿数滴防腐，再加蒸馏水至刻度，在冰箱中可稳定半年。
如用 8mmol/L 苯甲酸溶液代替蒸馏水配制，此标准溶液防腐效果更好。
【操作】
取 3 支试管，标明测定管、标准管及空白管，按下表操作。
试剂（ ml ）测定管标准管空白管
血清0.02 - -
尿素氮标准液- 0.02 -
蒸馏水- - 0.02 二乙酰一肟溶液0.5 0.5 0.5
酸性试剂 5.0 5.0 5.0
混匀后，置沸水浴中加热 12min ，取出，置冷水中冷却 5min 后，用于波长540nm ，以空白管调 0 ，读取并记录标准管及测定管吸光度值。
【计算】
【注意事项】
1 ．本法线性范围达 40mg/dl 尿素氮，即吸光度 0.7 。
果遇高于此浓度标本，必须用生理盐水作适当的稀释后重测，然后乘以稀释倍数为结果。
2 ．虽有氨基硫脲和镉离子，但仍有轻度褪色现象（每小时小于 5% ），故加热显色冷却后，应及时比色。
3 ．世界卫生组织推荐用 mmol/L 尿素表示，但我国仍习惯用尿素氮（ mg/dl 或mmol/L ）表示。
二者换算关系是， 1mmol/L 尿素氮等于 1/2mmol/L 尿素，
1mg/dl 尿素氮等于 2.14mg/dl 尿素。
4 ．血清尿素氮的正常值参考范围为 3.6 ～ 14.2mmol/L 。
【思考题】
1 ．若肝功能正常，而肾功能下降时，血中尿素氮含量会发生怎样的变化？为什么？
2 ．将尿素氮换算成尿素时， mmol/L 浓度除以 2 ，而 mg/dl 浓度乘以 2.14 ，为什么？。