真核细胞常见表达载体
真核细胞常见的表达载体及真核细胞表达外源基因的调控(精)
真核细胞常见表达载体1. pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1。
Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+Nhe1 Age13. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
pmv261载体质粒过表达蛋白条件
pmv261载体质粒过表达蛋白条件一、概述pmv261载体是一种广泛用于真核重组蛋白表达的质粒载体，其具有高转染效率和稳定性，适用于真核细胞中的高效表达。
Pmv261载体质粒过表达蛋白条件是指在真核细胞中使用pmv261载体质粒过表达目的蛋白时，需要考虑的背景条件和表达条件。
二、背景条件1. 细胞系pmv261载体质粒过表达蛋白的条件需要考虑所选择的真核细胞系。
常用的细胞系包括HEK293、CHO、SF9等，不同细胞系具有不同的转染效率和蛋白表达水平，因此需要根据具体实验要求选择合适的细胞系。
2. 质粒构建质粒的构建和序列设计对于pmv261载体质粒过表达蛋白条件也至关重要。
需要考虑目的蛋白的大小、结构和亲水性等因素，以及信使RNA的序列和启动子的活性，以确保质粒能够高效表达目的蛋白。
三、表达条件1. 转染条件过表达条件的第一步是将构建好的pmv261载体质粒转染入选定的真核细胞系中。
转染条件需要考虑转染剂的选择、转染时间和细胞的状态等因素，以确保质粒能够高效进入细胞内并稳定表达。
2. 表达时间表达时间是指在转染后需要给予细胞一定的时间来表达目的蛋白。
对于pmv261载体质粒过表达蛋白条件，需要根据目的蛋白的稳定性和表达水平来确定合适的表达时间，以确保蛋白能够高效表达并保持稳定性。
3. 表达介导为了提高目的蛋白的表达水平，可以采用介导蛋白或者其它表达增强因子来辅助pmv261载体质粒表达目的蛋白。
在确定介导蛋白的使用条件时，需要考虑其在细胞内的活性和相互作用以及对目的蛋白表达的影响。
四、实验技术1. 转染技术在pmv261载体质粒过表达蛋白条件下，转染技术是非常关键的步骤。
常用的转染技术包括磷脂体转染、钙磷酸盐共沉淀转染、电穿孔转染等，需要根据细胞系的特点选择合适的转染技术。
2. 免疫印迹技术免疫印迹技术是用来检测目的蛋白在真核细胞中表达水平的关键技术。
在pmv261载体质粒过表达蛋白条件下，需采用恰当的抗体和检测方法对目的蛋白进行定量和定性分析。
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体
真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统摘要 : 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。
原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。
自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。
并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。
随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。
在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。
该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。
其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。
但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。
为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是：①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制;②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及;③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。
昆虫表达系统
昆虫杆状病毒表达系统的分子基础
• 目前已知基因组全序列的杆状病毒有苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒 (Ac MNPV)、 家蚕核多角体病毒(BmNPV)、 黄杉毒蛾多核衣壳核多角体病毒 (OpMNPV)、 舞毒蛾多核衣壳核多角体病毒( Ld MNPV)、 甜菜夜蛾多核衣壳 核多角体病毒( Se MNPV)、 棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)以及斜纹夜蛾核 型多角体病毒( SplM t NPV) 杆状病毒在其生活史中共有两种形式的表型存在,在感染的初期( 0~ 24h), 主 要以细胞释放型病毒粒子( cell-released virus , CRV)为主, 也称为胞外型病毒 ( extracel lular vir us , ECV)或出芽型病毒 ( Budded vir us , BV); 在感染的晚 期主要以包埋型病毒( occlude d vir us , OV)的形式存在。杆状病毒的这两种 表型的形态、 蛋白组成、 病毒囊膜的来源、 感染组织特异性以及病毒入侵 宿主细胞的方式都不相同。 由于两种表型的病毒在结构组成上的差异, 所以杆状病毒在不同的时期需要表 达不同类型的蛋白来满足病毒颗粒不同形式的组装。昆虫杆状病毒的基因表 达共分为 4个时期: 极早期、 早期、 晚期、 迟晚期。4个时期的基因一环扣 一环,按时间先后, 以级联方式严格制约。早期表达的基因有 ie- 1、 me53、 pe38、 ie- 2等, 晚期表达的基因有 vp39 、vp80、 polh、 p10等, 这些不同的 基因所表达的蛋白各自具有不同的功能, 有些表达产物具有调控的功能, 而有 些仅仅只具有结构蛋白的作用。 在杆状病毒所表达的一系列蛋白中,有一类蛋白具有较高的表达量,并且均为病 毒基因组复制所非必需, 其中最具代表性的有多角体蛋白与 P10蛋白, 均属于 晚期表达的蛋白,受晚期启动子的调控。昆虫的杆状病毒表达系统正是利用了 这类蛋白的优点, 从而提供了外源 DNA插入座位。
真核表达载体
真核细胞常见表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
载体选择
1、pCMVp-NEO-BAN载体特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
几种表达载体
表达载体一、原核细胞表达载体1. pBAD载体:特点; 该表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的P BAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC，具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。
请注意:1. 当要扦入其他信号肽片段，改建此载体时，请不要利用该载体上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和 Pst1位点，以免造成重组困难，因为前述内切酶在此载体上均有二个位点，最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。
同时记住，如在不含任何信号肽的P BAD表达质粒扦入信号肽，其非编码N-末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。
2在使用含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒时，请应用Omp A分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点，这些在载体序列上都是单个酶切位点。
本公司目前有含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种P BAD表达质粒，其多克隆位点区域图谱如下:(a)、含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域SDP BAD….TACCCGTTT TTTTCC….GCTAG CAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGTA M A E LTTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CTC GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNco1 Sac1 Kpn1 Smal1 BamH1 Pst1 Hind111(b)、不含分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域EcoR1 Kpn1 BamH1 Pst1P BAD….TACCCGTTTTTTTGG….GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTTNde1 Sac1 Smal 1 Hind111下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果:pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞Origami(DE3)内高效表达2. pCAl-n & pCAl-pelB载体特点: 该原核细胞表达载体是来源于以T7 RNA聚合酶为基础的pET载体，含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。
真核细胞常见表达载体复习过程
真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN 载体特点：该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔B -球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo 基因以及pBR322 骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sall、BamHI和EcoRI位点。
注意在此载体中有二个EcoRI 位点存在。
2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点： pEGFP 表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV 启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo 抗性盒由SV40 早期启动子、Tn5 的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK 基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin 抗性基因在大肠杆菌中的表达。
用途：该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。
亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV 启动子,Acet1-Nhe1) 。
3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆B -肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin 使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。
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真核细胞罕有表达载体
真核细胞, 表达载体
1.pCMVp-NEO-BAN载体
特色:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对,重要由CMVp启动子.兔β-球蛋白基因内含子.聚腺嘌呤.氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成,在大多半真核细胞内都能高水安稳固地表达外源目标基因.更重要的是,因为该真核细胞表达载体中抗neo基因消失,转染细胞后,用G418筛选,可树立稳固的.高表达目标基因的细胞株.
拔出外源基因的克隆位点包含Sal1.BamH1和EcoR1位点.留意在此载体中有二个EcoR1位点消失.
2.pEGFP, 加强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector)
特色: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高程度表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子.Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤旌旗灯号构成,能应用G418筛选稳固转染的真核细胞株.此外, 载体中的pUC origin 能包管该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达.
用处: 该表达载体EGFP上游有Nde1.Eco47111和Age1克隆位点,
将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融会基因. 借此可肯定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位.
亦可用于检测克隆的启动子活性(代替CMV启动子,Acet1-Nhe1). 3.pEGFT-Actin, 加强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体
特色:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因,在PCMV启动子驱动下,在真核细胞中高程度表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制.Neo抗性盒由SV40早期启动子.Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤旌旗灯号构成,能应用G418筛选稳固转染的真核细胞株.此外, 载体中的pUC origin 能包管该载体在大肠杆菌中的复制,而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达.
用处: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融会蛋白,该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白,因而在活细胞和固定细胞中不雅察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞构造.
4.pSV2表达载体
特色：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目标基因进行表达的,克隆位点为Hind111.SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性.此载体不含neo基因,故不克不及用来筛选.树立稳固的表达细胞株.
5.CMV4 表达载体
特色:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动,多克隆区域酶切位点选择性较多.含有氨苄青霉素抗性基因和发展基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点.但值得留意的是,该表达载体不含有neo基因,转染細胞后不克不及用G418筛选稳固的表达细胞株. 其他经常应用克隆Vector：pBluscript II KS DNA 15 ug
pUC18 DNA 25 ug
pUC19 DNA 25 ug
解释: pBluescript II kS.pUC18 &Puc19载体合适于DNA片段的克隆.DNA测序和对外源基因进行表达等.这些载体因为在lacZ基因中含有多克隆位点,当外源DNA片段扦入,转化lacZ基因缺少细胞,并在含有IPTG和X-gal的造就基上造就时,含有外源DNA载体的细胞将为白色菌落,而无外源DNA片段载体的细胞则为兰色菌落,由此易于筛选有无外源DNA片段的载体.此外,这些载体中有便于测序的M13.T7和T3的通用引物进行DNA测序. 保管液: TE Buffer
TE Buffer构成: 10mM Tris.HCL(Ph 8.0) 1mM EDTA
用处:
克隆外源DNA片段. 进行基因表达. 应用M13.T7和T3引物进行测序. 消失的问题细胞的性命运动是一个庞杂的调控进程,有些性命运动的机理还不完整清楚,因为插人的目标基因不合,载体构建栗用的顺式组件不合,组装的空间地位不合,采取的表达体系不合,目标基因表达水温和阳性克隆筛选率都邑有很大差别.别的,因为所有的顺式元件消失种属和组织特异性,所构建的高效表达载体不一定在所有细胞株中均高效表达.再者,细胞发展状况的差别,转染办法的不合造就时阉的长短,筛选药物浓度的高下,对表达量都有很大影响.所以,须要分解评价一个表达载体和表达体系,消除一些不定身分,筛选出最佳组合真核表达载体趋势于既有利于扩增目标基因又有利于筛选阳性克隆的载体的构建.很多有用的应用范围广的强启动子和加强子被人发明并应用于载体中,大大进步了目标基因的表达量,别的一些强的构成型启动子,如 SV40早期启动子+PHTLv,已应用于大范围临盆的细胞系中. 应用以GS为筛选标记的表达载体可兼有筛选和扩增目标基因两种功效,是今朝研讨的重点.以IRES衔接的双顺反子表达载体已成为核表达载体的主体.在统一启动子把持下,筛选基因或陈述基因与目标基因转录在统一mRNA上经由过程IRES的感化,表达出两种蛋
白,因而在理论上可以为,经由过程了筛选或表达了陈述基因的克隆必为阳性克隆,即表达目标基因的克隆,有报导说这种双顺反子的共表达率为90％.这就大大进步了筛选率,简化了试验进程. 将强启动子.加强子和可扩增的筛选标记组装在统一载体上,构建高效表达和筛选的表达载体并将其应用于最合适的表达体系中,是当今真核表达载体构建研讨成长偏向.。