人脂联素基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达
人TLR4胞外段真核表达质粒的构建及其在HEK293 细胞中的表达
人TLR4胞外段真核表达质粒的构建及其在HEK293 细胞中的表达陈伟;史忠【期刊名称】《中国急救医学》【年(卷),期】2005(025)012【摘要】目的构建人Toll-like receptor 4(TLR4)胞外段真核表达质粒并观察其表达.方法通过PCR扩增人TLR4胞外段基因,将其克隆入真核表达质粒pcDNA3.1(+),重组质粒pcDNA3.1(+)-eTLR4转染入人胚肾293细胞(HEK293细胞)中,RT-PCR检测TLR4胞外段的表达.结果测序结果表明,成功构建人TLR4胞外段真核表达质粒pcDNA3.1(+)-eTLR4,并在HELK293细胞中获得表达.结论TLR4胞外段能在HEK293细胞中获得正确表达,为TLR4信号通路的进一步研究打下了基础.【总页数】3页(P899-901)【作者】陈伟;史忠【作者单位】中国人民解放军第三军医大学新桥医院急救部,重庆,400037;中国人民解放军第三军医大学新桥医院急救部,重庆,400037【正文语种】中文【中图分类】Q503【相关文献】1.人TLR4胞外段的克隆、表达及功能活性分析 [J], 王凡平;王明永;孙瑞利;郭庆合;张婧婧;杨景瑞;张新富;段巨洪2.脂质体包裹人促甲状腺激素受体胞外段基因真核表达质粒的构建 [J], 杨于力;罗清礼;吕红彬3.人HCN4基因真核表达质粒构建及在HEK293细胞中的表达 [J], 谢向荣;杨玉雯;汤圣兴;左广锋;程浪;汪茗;曹蘅;汪和贵;蔚有权;杨浩;芮世宝4.带有HA标签的HBc蛋白真核表达质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达[J], 章广玲;袁丽杰;王芳;汤华;张银;张淑杰5.真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达 [J], 王海红;董为人;张琳;晏芳;刘忠英;李妍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Mef2c真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达
Mef2c真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达温见燕;于长安;杨鹏;阴彬;李耿;柯元南;廖文强【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2009(49)4【摘要】目的构建小鼠Mef2c基因真核表达质粒并转染HEK293T细胞.方法采用RT-PCR方法从小鼠心脏组织的总cDNA中扩增出小鼠的Mef2c的基因,采用基因重组技术将Mef2c的cDNA片段插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建小鼠Mef2c真核表达质粒,脂质体转染HEK293T细胞进行表达.结果酶切和测序结果证实Mef2c真核表达质粒构建成功,经脂质体转染293T细胞后,Western blot 检测证明Mef2c蛋白在真核细胞中成功表达.结论成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Mef2c,为进一步研究小鼠Mef2c在心肌分化过程中的作用及其调控机制奠定了实验基础.【总页数】3页(P15-17)【作者】温见燕;于长安;杨鹏;阴彬;李耿;柯元南;廖文强【作者单位】中日友好医院,全国中西医结合心血管病中心,北京100029;中日友好医院,全国中西医结合心血管病中心,北京100029;中日友好医院,全国中西医结合心血管病中心,北京100029;中国医学科学院,北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室;中日友好医院,全国中西医结合心血管病中心,北京100029;中日友好医院,全国中西医结合心血管病中心,北京100029;中日友好医院,全国中西医结合心血管病中心,北京100029【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1的构建及其在HEK293T细胞中的表达[J], 陈杰;高下;朱敏生;张文程;麻晓峰;顾香芳2.犬β防御素-1真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达 [J], 靳慧君;仲飞;吴凌娟;解民;王微;韩冬梅3.结核分枝杆菌38kD蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的分泌性表达 [J], 白娜;毛莹莹;颜仁和;林明;陈兴露;李青青;陈惠莹;刘军;李红卫4.SIRPα-GFP真核表达载体构建及其在HEK293T细胞中的表达 [J], 王明月;王浩;王冬梅;杨泽斌;崔梅英;刘宁;黄莉莉;关新刚5.人TLR9真核表达载体在HEK293T细胞中的表达 [J], 丁国富;吴翀;蒋为薇;李军;罗平;周红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人DNA聚合酶δ2真核载体的构建及在HEK293细胞中的表达
人DNA聚合酶δ2真核载体的构建及在HEK293细胞中的表达白书媛;王培昌【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2013(42)13【摘要】目的构建人DNA聚合酶δ2(DNA Polδ2)真核表达载体,转染人胚胎肾细胞(HEK293)并观察其表达水平.方法用逆转录PCR(RT-PCR)方法从人胚肺成纤维细胞(WI38细胞)扩增目的基因DNA Polδ2 cDNA片段,与pMD18T载体连接,构建质粒pMD-18T-Polδ2；将目的片段DNA Polδ2从质粒pMD-18T-Polδ2切下,与真核表达载体pcDNA 3.1(+)连接,构建正义及反义真核表达载体pcDNA 3.1-Polδ2.应用脂质体转染试剂,分别将正义、反义真表达载体pcDNA 3.1-Polδ2,空载体pcDNA3.1(+)转染至HEK293细胞,同时设置阴性对照；用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因DNA Polδ2 mRNA及蛋白表达水平.结果正义和反义DNA Polδ2真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2中插入的目的片段与GENEBANK上DN A Polδ2 cDNA序列完全一致.RT-PCR方法显示正义及反义真核表达载体转染组细胞的目的基因DNA Polδ2 mRNA表达均明显高于空载体转染组及阴性对照组；Western blot显示正义真核表达载体转染组细胞DNAPolδ2蛋白表达明显增强,反义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达阴性.结论人DNA Polδ2正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2构建成功.【总页数】4页(P1499-1501,1505)【作者】白书媛;王培昌【作者单位】首都医科大学宣武医院检验科,北京100053;北京市宣武区疾病预防控制中心,北京100053;首都医科大学宣武医院检验科,北京100053【正文语种】中文【相关文献】1.人p75 NTR荧光真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 [J], 鲁秀敏;朱枫;黄鹏;余瑛;王永堂2.突变型DNA聚合酶β真核表达载体的构建及其表达 [J], 赵四敏;陈旭东;赵国强;董子明3.人DNA聚合酶β全长cDNA的克隆、鉴定及真核表达载体的构建 [J], 杜柳涛;庄志雄;高昆;杨杏芬;何云;徐雷;魏青4.巢式逆转录-聚合酶链反应扩增人骨形成蛋白2全长cDNA及其真核表达载体的构建 [J], 俞莉敏;党耕町;杨吉成;郑祖根5.人STAT4基因真核表达载体构建和在HEK293细胞中表达 [J], 李轩岸;黄玉梅;姚芳玲;范洁琳;雷光华;黎明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
真核表达载体pIRES—EGFP—PDGF—B的构建及在293T细胞中的表达
ｔｅｄ ｖｌｐ ｅ ｔｏ ｉ ｒｃｎ ｅ ［］ ＪＬ ｂＣｉ ｄ，０ ６ １７ ｈ ｅｅｏ ｍ ｎ ｆｌ ｅ ａｃｒ Ｊ ． ａ ｌ Ｍｅ ２ ０ ，４ ｖ ｎ （ ） ５ － ６ ２ ：８ ６ ．
［ ］ 宋 霆婷 ， 玉华 ， ４ 姜 李妙玉 ， Ｍ Ｐ 等． Ａ Ｋ反义寡核 苷酸对肝 癌细胞恶 性 表型的逆转作用［］ Ｊ． 实用医学杂志 ， ０ ，１ １ ） ２ １— ｌ８ ２ ５ ２ （９ ：ｌ６ ２ １． ０ ［ ］ 王顺祥 ， 晓慧 ，周少英 ， ． ５ 吴 等 乙酰 肝素酶 反义 寡核苷 酸对 人肝 癌 细胞 株 乙酰 肝素 酶 表达 的影 响 ｆ ］ 实用 医学杂 志 ，０ ５ ２ Ｊ． ２０ ，１
LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达
LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达张大伟;胡蕴玉;李立文;白文涛;杨香菊;李文献;白建萍【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2007(007)006【摘要】为构建人LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达及定位,通过基因重组的方法构建LMP3/pEGFP-N3重组真核表达载体,并通过酶切和基因测序鉴定.脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位.经酶切和基因测序鉴定LMP3/pEGFP-N3重组真核表达载体构建成功.转染HEK293细胞后,荧光显微镜检测显示融合蛋白仅在细胞浆中表达.说明基因重组技术可成功构建LMP3/pEGFP-N3重组体真核表达载体,重组表达的融合蛋白仅存在于细胞浆内.【总页数】4页(P972-975)【作者】张大伟;胡蕴玉;李立文;白文涛;杨香菊;李文献;白建萍【作者单位】第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安,710032;第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安,710032;西北大学生命科学院生物科学系,西安,710069;第四军医大学微生物学教研室,西安,7100321;第四军医大学口腔医院正畸科,西安,710032;第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安,710032;第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安,710032【正文语种】中文【中图分类】Q5【相关文献】1.遗传学：LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293 细胞中的表达 [J], 张大伟2.SK2和 JPH2双基因重组真核表达载体的构建及在 HEK293细胞中的表达 [J], 罗天霞;樊红琨;芮丹丹;孙佳翕;马小芳;章茜3.牛乳状瘤病毒13型pEGFP-E5-N1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 [J], 庞峰;史巧芸;朱华培;徐开莲;赵天靖;李亚颖;彭冬梅;李国华;周海龙4.水牛髓样分化因子88融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 [J], 匡文华;王凤阳;张晓茹;成鹰;杜丽;雷明;焦寒伟;张冬琳;郝永昌;祁超5.pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞系中的表达 [J], 徐婧;侯赋园;王德彬;李竣;胡鑫;杨光忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人cbl基因真核表达载体的构建及表达
人cbl 基因真核表达载体的构建及表达【Abstract】AIM： To construct the eukaryotic expressing vector of human cbl and test its expression in African green monkey kidney cell line COS7. METHODS: Human cbl gene tagged with flag was amplified from pEFHAcbl plasmid by PCR. The product was cloned into pGEMT easy, sequenced and then subcloned into eukaryotic expressing vector pcDNA3.1(+). The recombined vector was then transfected into COS7 cells with lipofectin and the expression of cbl gene was detected by Western blot. RESULTS: The eukaryotic expressing vector encoding human cbl was successfully constructed and its expression in COS7 cells could be detected. CONCLUSION: The eukaryotic expressing vector encoding human cbl is constructed and it expresses flagcbl fused protein correctly in COS-7 cells.【Keywords】 cbl; polymerase chain reaction; cloning, molecular; gene expression【摘要】目的：构建带有flag标签的人cbl 基因真核表达载体，并检测其在真核细胞中的表达.方法：以含有人全长cbl cDNA 的质粒pEFHAcbl 为模板，采用PCR方法扩增cbl基因，并在其N末端带上含24 bp的flag标签，克隆到pGEMT easy载体并测序，再亚克隆至真核表达载体pcDNA31(+)，酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染COS7细胞，Western blot检测flagcbl在细胞中的表达. 结果：测序证实以pEFHAcbl 为模板获得的flagcbl融合基因的序列以及读框全部正确；重组质粒pcDNA31(+)flagcbl经酶切后产生与理论预期长度相符的片段；脂质体法转染COS7后检测到预期目的蛋白的表达.结论：成功构建了N末端带flag标签的cbl真核表达载体，并使其在真核细胞COS7中表达.【关键词】 cbl; 聚合酶链反应; 克隆，分子; 基因表达0引言Cbl (casitas Blineage lymphoma,简称Cbl)是一类广泛分布的细胞内蛋白，在哺乳类中有Cbl、Cblb和Cbl3 3种.Cbl分子中含有多个不同的结构域，可以介导与不同的细胞内分子结合，在细胞活化过程中可作为接头分子或支架分子参与信号转导；同时该分子中的RING结构域能够与泛素结合酶E2结合,作为泛素连接酶E3促进其结合的靶分子发生泛素化－蛋白酶体降解，因此参与细胞内信号转导的负调控机制［1］.近年来的研究表明，突变的Cbl可成为癌基因［2］；而许多肿瘤细胞内与增殖有关的分子（如受体型蛋白酪氨酸激酶，RTK）发生突变后则不再受Cbl的负调控［3］.我们成功构建了N－末端融合有flag标签的cbl 基因的真核表达载体，并采用脂质体法转染培养的COS7细胞，检测其是否正确表达，为进一步研究cbl 对肿瘤细胞生长的影响奠定基础.1材料和方法11材料大肠杆菌菌株DH5α、pcDNA31(+)真核表达载体、COS7细胞由本室保存；含人全长cbl cDNA的质粒由美国La Jolla变态反应与免疫学研究所保存；pGEMT easy购自Promega公司；dNTP、dATP、pyrobest高保真聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、DL2000 DNA Marker购自Takara公司；1640培养基购自Gibico 公司；LipofectamineTM2000购自invitrogen公司；抗flag M2 mAb和抗ACTIN抗体、HRP标记的羊抗鼠、兔第二抗体分别购自Sigma公司和博士德公司；Western blot 所用发光底物为pierce公司产品；用于PCR 反应的引物由上海生物工程公司合成；质粒提取和DNA 回收试剂盒由杭州维特洁公司提供.12方法121引物设计上游引物序列： 5′GGT ACC ATG GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC AAG ATG GCC GGC AAC GTG AAG AAG AGC3′，其中GGT ACC为KpnI酶切位点.下划线部分为编码flag标签的核苷酸序列；下游引物序列： 5′ CTC GAG CTA GGT AGC TAC ATG GGC AGG AGA AGA AAT GG 3′，其中CTC GAG为XhoI酶切位点.122PCR扩增flagcbl基因及产物修饰在25反应体系中加入25 μL 10×反应缓冲液，20 μL dNTP，pEFHAcbl 质粒模板10 μL，上下游引物各10 μL，pyrobest高保真酶025 μL，补水至25 μL.扩增条件为94℃ 5 min，94℃ 45 s，62℃ 1 min，72℃ 2 min，35 cycles.扩增产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行分离；回收后溶于35 μL去离子水中，并进行加“A”反应： 50 μL 反应体系中加入5 μL 10×反应缓冲液，4 μL dATP，3 μL MgCl2，扩增产物30 μL，rTaq 酶05 μL，补水至50 μL，72℃ 40 min.123PCR产物克隆及序列测定上述加“A”后的PCR产物回收，回收片段克隆到pGEMT easy载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行酶切鉴定及测序.124pcDNA31(+)flagcbl真核表达载体的构建用BglI先将pGEMT easy酶切成小片段，因flagcbl内部无BglI酶切位点，故包含在酶切后产生的最大片段内，将该片段回收后再用KpnⅠ/XhoⅠ将flagcbl切出，插入pcDNA31(+)真核表达载体中，构建出重组表达载体pcDNA31(+)flagcbl.125基因转染COS7细胞在含100 mL/L新生小牛血清的1640 培养基中，于37℃，50 mL/L CO2饱和湿度下培养，80%汇合时按照LipofectamineTM2000说明书进行空质粒和重组表达质粒的转染. 126Western blot检测转染后细胞中转入基因的表达分别于转染后24，48 h收细胞并裂解细胞内总蛋白，取20 μg处理后的蛋白样品进行SDSPAGE电泳并电转移至NC膜，5 g/L脱脂奶封闭1 h，分别与适当稀释后的一抗孵育1 h、PBST洗膜，然后与1∶4000二抗孵育1 h，PBST洗膜后加入发光底物孵育1 min，暗室中用X光片曝光，显影，定影.2结果21人cbl基因的克隆及序列测定用PCR技术以pEFHAcbl 质粒为模板扩增得到2737 bp片段（Fig 1），加“A”后克隆到pGEMT easy 载体中，EcoRI/XhoI酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示切出大小为450、1190和3000 bp的几种片段（Fig 2），表明系阳性克隆，测序结果表明，所克隆的人cbl基因序列以及flagcbl融合基因的读框完全正确.22真核表达载体pcDNA31(+)flagcbl的构建利用酶切后产生的载体和片段之间互补的黏性末端进行亚克隆.构建成功的pGEMT easy flagcbl先用BglⅠ将pGEMT easy酶切成小片段，而flagcbl 内部无BglⅠ酶切位点，包含在最大片段内，将该片段回收后再用KpnI/XhoⅠ双酶切将flagcbl切出，插入pcDNA31(+)真核表达载体.KpnⅠ/XhoⅠ双酶切和EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定均表明pcDNA31(+)flagcbl表达载体构建成功（Fig 3）.23真核表达载体pcDNA31(+)flagcbl在COS7细胞中的表达构建成功的pcDNA31(+)flagcbl和空质粒pcDNA31(+)分别瞬时转染COS7细胞，转染后24 h和48 h antiflag抗体均检测到flagcbl在蛋白水平的表达，Mr约为120×103；而对照的空质粒转染后则没有相应的条带（Fig 4）.表明所构建的真核表达载体pcDNA31(+)flagcbl 可以在真核细胞内正确表达.3讨论Cbl家族蛋白属于泛素连接酶E3家族的一大类，这类分子中具有RING结构域，又称为RING型E3 .遗传和进化研究显示，Cbl家族蛋白是一类保守的蛋白酪氨酸激酶（PTK）信号通路的负调控因素.这一现象最早是在对C. elegans研究中发现的，功能缺失的Cbl同源分子Sli1可以恢复EGFR同源分子Let23的信号转导，而增加Sli1基因的拷贝数则可抑制此通路［4］；对Drosphila的研究也发现DCbl 同样可负调控EGFR介导的信号通路［5］.此后，越来越多的研究表明，CCbl可以促进多种受体型蛋白酪氨酸激酶（RTK）如EGFR、PDGFRα、β［6］、CSF1R［7］等发生配体诱导的泛素化和随后的蛋白酶体降解.Cbl的这种负调控RTK作用对于维持正常细胞内稳机制具有重要意义.而上述分子很多在肿瘤的发生和发展过程中具有重要作用，有些是癌基因的产物；并且许多肿瘤细胞内与增殖有关的RTK发生突变后则不再受Cbl的负调控［3］.这就提示，加强Cbl分子的负调控作用机制，下调某些肿瘤细胞内过度活化或发生突变的RTK可能会抑制相应肿瘤的恶性增殖.已有研究表明CCbl不仅可以使细胞表面的Neu迅速泛素化、下调，并抑制其下游信号通路，而且可以抑制转染了Neu的神经母细胞瘤在小鼠体内的生长［8］.与此相一致，Klapper等认为HER2单抗Heceptin的抗癌机制与Cbl结合并促使HER2泛素化、降解有关［9］.另外，膜锚定的Cbl可以逆转由Hck导致的鼠成纤维细胞恶性转化，表现为细胞形态的改变以及锚着非依赖性生长受抑［10］.在鼠NIH3T3细胞中过表达Cbl可抑制PDGFα和PDGFβ诱导的细胞增殖及抵抗凋亡［6］.这些研究结果强烈地提示： Cbl可能能够抑制各种增殖性疾病（包括肿瘤在内）的细胞内多条信号通路，有可能将其作为与异常活化PTK相关疾病的治疗手段.我们以pEFHAcbl 质粒为模板，通过PCR法获得了N－末端融合有flag标签的人cbl基因，并构建了的flagcbl基因的真核表达载体，该表达载体在真核细胞COS7中能够正确表达.这为我们进一步研究cbl对肿瘤细胞生长的影响，探讨一种肿瘤治疗的新思路奠定了基础.【参考文献】［1］ Joazeiro C, Wing S, Huang H, et al. The tyrosine kinase negative regulator cCbl as a RINGtype, E2dependent ubiquitinprotein ligase ［J］. Science, 1999 ;286(5438):309-312.［2］ Thien CB, Langdon WY. Cbl: Many adaptations to regulate protein tyrosine kinases［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2001;2(4):294-307.［3］Peschard P, Park M. Escape from Cblmediated downregulation: A recurrent theme for oncogenic deregulation of receptor tyrosine kinases［J］. Cancer Cell, 2003 ;3(6):519-523.［4］ Jongeward GD, Clandinin TR, Sternberg PW. Sli1, a negative regulator of let23mediated signaling in C. elegans ［J］. Genetics, 1995;139(4):1553-1566.［5］ Pai LM, Barcelo G, Schupbach T. Dcbl, a negative regulator of the Egfr pathway, is required for dorsoventral patterning in Drosophila oogenesis［J］. Cell, 2000;103(1):51-61.［6］ Miyake S, MullaneRobinson KP, Lill NL, et al. Cblmediated negative regulation of plateletderived growth factor receptordependent cell proliferation. A critical role for Cbl tyrosine kinasebinding domain［J］. J Biol Chem, 1999;274(23):16619-16628.［7］ Lee PS, Wang Y, Dominguez MG, et al.The Cbl protooncoprotein stimulates CSF1 receptor multiubiquitination and endocytosis, and attenuates macrophage proliferation［J］. EMBO J, 1999;18(13):3616-3628.［8］ Levkowitz G, Oved S, Klapper LN, et al. cCbl is a suppressor of the neuoncogene［J］. J Biol Chem, 2000;275(45):35532-35539.［9］Klapper LN, Waterman H, Sela M, et al. Tumorinhibitory antibodies to HER2/ErbB2 may act by recruiting cCbl and enhancing ubiquitination of HER2［J］. Cancer Res, 2000;60(13):3384-3388.［10］ Howlett CJ, Robbins SM. Membraneanchored Cblsuppresses Hck proteintyrosine kinase mediated cellular transformation［J］. Oncogene, 2002;21(11):1707-1716.。
PinX1基因真核表达载体的构建及其在Hek293细胞中的表达
PinX1基因真核表达载体的构建及其在Hek293细胞中的表达孙文旦【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2009(27)6【摘要】目的确定PinX1在转染该基因的真核细胞Hek293内的表达定位.方法采用RT-PCR技术从HepG2中扩增Pinx1,克隆入真核表达栽体pcDNA3-vsv,重组质粒转染Hek293细胞,免疫细胞化学法检测蛋白质的表达.结果从HepG2细胞中获得Pinx1基因,成功构建真核表达载体pcDNA3-Pinx1-vsv,将其转染Hek293细胞后,免疫细胞化学法检测结果表明PinX1在细胞核内表达.结论成功获得PinX1基因,转染后在Hek293细胞核内表达,为探索Pinx1在端粒、端粒酶调控中的作用机制奠定基础.【总页数】3页(P445-447)【作者】孙文旦【作者单位】无锡市第二人民医院检验科,江苏无锡,214002【正文语种】中文【中图分类】O78【相关文献】1.Salusin-a基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达 [J], 游莎;曾和松2.AR-GFP融合基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达 [J], 刘建伟;叶玲;刘静;牛东滨;杜明梅;高宇红3.SK2和 JPH2双基因重组真核表达载体的构建及在 HEK293细胞中的表达 [J], 罗天霞;樊红琨;芮丹丹;孙佳翕;马小芳;章茜4.人STAT4基因真核表达载体构建和在HEK293细胞中表达 [J], 李轩岸;黄玉梅;姚芳玲;范洁琳;雷光华;黎明5.小鼠FasL基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达 [J], 何霞;汪杨;何善阳;王铸;冯发深;关琳琳;罗燕芬;潘金成;曹开源;徐霖因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
成纤维细胞生长因子受体fgfr1真核表达质粒的构建及其在hek293t细胞的表达
Amplification of Human FGFR1 Gene and Its High-level Expression in HEK293T Cells
JIN Jin-Hua ，LI Ke-yan，ZHANG Ling，WANG Yu-hui，DENG Xiao-ming （Dept. of A nesthesiology，Plastic Surgery Hospital，Chinese A cademy of Medical Sciences and Peking Union
Medical College，Beijing 100144，China）
［Abstract］ Objective To establish an efficient FGFR1 expression system. Methods Human FGFR1 cDNA was amplified by RT-PCR and then inserted into pcDNA3.1 expression vector to construct the pcDNA3.1-FGFR1 recombinant plasmid. The pcDNA3.1-FGFR1 plasmids were transfected into HEK293T cells and the expressed FGFR1 protein was detected by Western blot and Immunofluorescence. Results The results showed that the sequence of FGFR1 cDNA amplified was consistent with that previously reported. The highly efficient expression of FGFR1 in HEK293T cells was achieved after transfection. Conclusion Human FGFR1 cDNA was amplified and the high-level expression of FGFR1 in HEK293T ce lls was achieved.
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ＡＰＭ】是单拷贝基因，长约１７ ｋｂ，由３个外显子 和２个内含子组成。３个外显子分别长１８、２２２和 ４ ２７７ ｂｐ，其上含有可识别的剪切位点；２个内含子分 别长约０．８和１２ ｋｂ。人体内的脂联素由２４４个氨基 酸组成，相对分子质量为３０ ０００，共有３个区域：氨基 端信号肽序列（ａａ ｌ—１８）、胶原样结构域（ａａ １９—１０７）和 羧基末端的球形结构域（ａａ １０８—２４４）。人脂联素基因 定位于３ｑ２７，全基因组扫描显示该区域存在２型糖尿 病和代谢综合征的易感位点，也是冠状动脉疾病的候 选位点。脂联素的水平降低与多种动脉硬化相关性疾 病或综合征有关，如糖尿病、血脂紊乱、内皮细胞功能 障碍、高血压和肥胖。２型糖尿病患者血中脂联素水 平低于有动脉粥样硬化危险的因素（如肥胖、高血压、 年龄、家族史、吸烟、脂代谢紊乱）但未患糖尿病的患 者。控制良好的糖尿病患者血中脂联素水平高于控制 不佳的患者，因此，脂联素可作为具有动脉粥样硬化高 危险因素的患者代谢控制的一个指标。７１。
图１
Ｆｉｇ ｌ
质粒与插入片段连接处的测序图谱
Ｐａｒｔ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｐＣＤＥＦ—ＡＰＭｌ
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
六、ｐＣＤＥＦ－ＡＰＭｌ转染ＨＥＫ２９３细胞 用含１０％ＦＢｓ的ＤＭＥＭ高糖培养基培养ＨＥＫ２９３ 细胞，让其生长良好。按１×１０５个细胞／孑Ｌ接种于无 菌６孑Ｌ板中，在转染前１ ｄ换液，加入２ ｍｌ培养基，待 细胞生长至６０％～７０％融合时。按试剂盒推荐的优 化条件进行转染，２４ ｈ后加入２ ｍ１培养基（含Ｏ．５％ ＦＢｓ），４８ ｈ后检测转染效率，收集细胞上清。 七、ＥＬＩＳＡ法检测脂联素表达水平
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ｃＣＴ。以ｐＧＥＭ—Ｔ—ＡＰＭｌ质粒为模板进行ＰｃＲ反应， 目标产物为两端带有Ｓ６ Ｉ酶切位点的全长型人脂联 素基因。反应体系（５０¨１）：１０×缓冲液（５斗１）；４× ｄＮＴＰ（２卜Ｌ１）；ａｍｐｌｆ（１０斗ｍｏｌ／Ｌ）２斗ｌ；ａｍｐｌ ｒ（１０斗ｍｏＬ／ Ｌ）２斗ｌ；ｄｄＨ２０ ３８．５斗ｌ；模板５０ ｎｇ；Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶５ ｕ。反应条件：９５℃预变性５ ｍｉｎ；然后９５℃变性３０ ｓ， ５８℃退火４５ ｓ，７２℃延伸２ ｍｉｎ，反应２５个循环；最后 ７２℃再延伸ｌｏ ｍｉｎ。ＰｃＲ产物经１．ｏ％琼脂糖凝胶电 泳分析后，用ＰＣＲ纯化试剂盒进行纯化、回收。
结果
用所设计合成的一对引物从质粒ｐＧＥＭ．Ｔ·ＡＰＭｌ 上成功扩增出７５０ ｂｐ左右的两端带有ｓ６ Ｉ酶切位点 的ＡＰＭｌ片段，与理论值相符。ＰｃＲ产物用ＰｃＲ纯化
万方数据
图３ ｐＣＤＥＦ．ＡＰＭｌ转染ＨＥｌ（２９３细胞（生长良好） Ｆｉｇ ３ ＨＥＩ（２９３ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｐｃＤＥＦ／ＡＰＭｌ（ｇｒｏｗ ｗｅｌｌ）
ＤＮＡ ｒｅｃｏＨ幽ｎ粕ｔ ｍｅｔｈｏｄ．Ｅｘｐ陀ｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ＤＣＤＥＦ．ＡＰＭｌ
ｉｎｔｏ ＨＥＫ２９３ ｃｅｕｓ
ｒｅａ鼯ｎｔ．Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｈｕＩｎａｎ ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｐｅｍ砒ａｎｔ ｏｆ ｃｅＵ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｏｕｂｌｅ
基金项目：国家自然科学基金（３０３７０６７０，３００７０３５６） 作者单位：４０００１６重庆医科大学附属第一医院 通讯作者：邓华聪，Ｅｍａｉｌ：ｄｅ“ｇ－ｈｕａｃｏｎｇ＠ｙ８Ｉ１００．ｃｏｍ．ｃｎ
材料和方法
一、主要试剂 ｐＧＥＭ—Ｔ－ＡＰＭｌ质粒的构建由本课题组完成，测序 结果与ＧｅｎＢａｎｋ发表的资料一致；ＤＨ５仪菌和ＨＥＩ（２９３ 细胞由第三军医大学野战外科研究所七室保存。ＰＣＲ 引物（Ｔａｋａｒａ）；Ｔ载体和ＰＣＲ酶（Ｐｒｏｍｅｇａ）；胶回收试 剂盒（ＱＩＡＧＥＮ）；Ｓｆｉ Ｉ限制性内切酶（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）；快速连接试剂盒（Ｆｅｎｎｅｎｔａｓ）；胎牛血清 （ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ）；ＤＭＥＭ高糖培养基（Ｇｉｂｃｏ）；高纯度质 粒抽提试剂盒（Ｐｒｏｍｅｇａ）；ＰｃＲ产物纯化试剂盒 （Ｏｍｅｇａ）；转染试剂（ＱＩＡＧＥＮ）；人脂联素ＥＬＩＳＡ检测 试剂盒（Ｒ＆Ｄ）；ｐＣＤＥＦ质粒（上海交通大学生命科学 技术学院）；序列分析（上海鼎安生物科技有限公司）。 二、ＰＣＲ扩增ＡＰＭｌ
三、ＰＣＲ产物亚克隆到Ｔ载体 将纯化的ＰＣＲ产物与Ｔ载体用快速连接试剂盒
试剂盒纯化后，连接到Ｔ载体，通过蓝白斑筛选出阳 性克隆。含有ＡＰＭｌ的Ｔ载体和空载体ｐｃＤＥＦ一起 用ｓ６ Ｉ酶切后获得７５０ ｂｐ左右的ＡＰＭｌ片段和大于 ５ ｋｂ左右的ｐＣＤＥＦ片段，与理论值相符。挑取的４个 克隆抽提质粒后，ＰｃＲ均扩增出７５０ ｂｐ左右的ＡＰＭｌ 片段，与理论值相符，而对照质粒则只扩增出了引物二 聚体，提示挑取的４个克隆均为阳性克隆。双向测序 结果表明送测的两个质粒序列完全正确，与ＧｅｎＢａｎｋ 报道的ＡＰＭｌ（ＧＩ：８７１８８６）序列一致，质粒与插入片段 连接处的测序图谱见图ｌ，显示阅读框正确。
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·基础研究·
人脂联素基因真核表达载体的构建 及在ＨＥＫ２９３细胞中的表达
李丙蓉邓华聪 兰丽珍郑宏庭刘金波
【摘要】 目的构建人脂联素（ＡＰＭｌ）基因真核表达载体，并检测其在ＨＥｌ（２９３细胞中的表达水平。 方法用ＰｃＲ法从测序正确的ｐＧＥＭ—Ｔ．ＡＰＭｌ质粒上，扩增出两端带有踮Ｉ酶切位点的人脂联素基因， 再将扩增出的片段亚克隆到Ｔ载体上，用踮Ｉ酶切Ｔ载体和ｐｃＤＥＦ空载体，将酶切后的片段进行连接、 转化、筛选、鉴定、测序。将成功构建的ｐｃＤＥＦ—ＡＰＭｌ质粒转染ＨＥＫ２９３细胞，ＥｕｓＡ检测培养上清中脂联 素的水平。结果 构建的ｐｃＤＥＦ．ＡＰＭｌ质粒能有效转染ＨＥＫ２９３细胞，并在培养上清中检测到较高水平 的脂联素蛋白。结论成功地构建了人脂联素基因的真核表达载体，并在ＨＥＫ２９３细胞中获得高效表达。
哺乳动物的脂联素一旦合成，经过翻译后羟基化 和糖基化修饰形成８种亚型。其中６种亚型是糖基化 的，胶原结构域内的６８、７ｌ、８０和１０４位的赖氨酸残 基，９４位的脯氨酸残基是氧连接的糖基化位点¨ｏ。糖 基化的脂联素作为胰岛素增敏剂的效应远远强于细菌 合成的非糖基化的脂联素，提示脂联素翻译后的修饰 对其发挥最佳的生物学活性是必需的。由于哺乳动物 细胞可以对表达的真核蛋白进行翻译后加工修饰，包 括：二硫键形成，多聚化，蛋白酶加工，适当的糖基化以 及在分子伴侣的作用下正确折叠。因而，构建真核表 达载体，并在真核系统中表达人脂联素蛋白，将为进行 脂联素蛋白的纯化、鉴定和制备，以及鉴定单克隆抗体 和进行脂联素的功能研究奠定基础。
ｔｍｎｓｆｅｃｔｅｄ’１，ｉｔｈ ｐＣＤＥＦ．ＡＰＭｌ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ；ｃｌｏｎｉｎｇ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ；Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｕｓ
（劬ｉｎ．，Ｅ蒯。硎加Ｚ胁￡０６。２００６．２２：４６４＿４６６）
２９３ ｃｅＵｓ
Ⅱ
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【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ７ｒｏ ｃ０Ｉｌｓｔｍｃｔ ａｎ ｅｕｋ８ｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｈｕｍ蛐８ｄｉｐｏｓｅ ｍｏｓｔ ａｂｕｎｄａｎｔ
用蹦ｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软件设计两端带有ｓ６ Ｉ酶
万方数据
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切位点的ＡＰＭｌ上下游引物：印ｍｌｆ：ｇｅｇｇｃｃａａｔｃｃｇｇｃ—
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进行连接，取连接反应产物３斗ｌ转化感受态细胞 ＤＨ５仪，并和ＩＰＴＧ、ｘ—Ｇａｌ一起混合涂布在氨苄青霉素 抗性的ＬＢ平板上，３７℃培养过夜。分别挑５个白色 单菌落到５支５ ｍ１氨苄青霉素抗性的培养管中３７℃ 摇床过夜培养。用０ｍｅｇａ质粒抽提试剂盒提取质粒。
四、酶切、连接 含有ＡＰＭｌ的Ｔ载体和载体ｐｃＤＥＦ一起用ｓｆｉ Ｉ 酶切。电泳后用ＱＩＡＧＥＮ胶回收试剂盒回收ＡＰＭｌ和 ｐｃＤＥＦ载体，连接并转化到ＤＨ５仅感受态细胞涂板 （氨苄青霉素抗性）培养。 五、特异性ＰＣＲ鉴定阳性克隆 挑取４个克隆和一个阴性对照克隆（来源于载体 自连板），加入ＬＢ培养基培养。用基因特异的５’端引 物和载体特异的３ ７端引物ＰｃＲ鉴定挑取的克隆。取 其中两个阳性克隆抽提质粒送测序。
【关键词】脂联素；克隆，分子；基因表达；真核细胞
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ｏｆ Ａ肼Ｍ１ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒ鹤ｓｉｏｎ
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ＨＥＫ２９３细胞的转染效率约为６０％，对照质粒转 染ＨＥＫ２９３细胞后表达荧光蛋白的情况见图２。 ｐｃＤＥＦ—ＡＰＭｌ转染ＨＥＫ２９３细胞后，细胞生长良好，见 图３。
ＥＬＩｓＡ法检测结果显示，转染真核表达载体 ｐｃＤＥＦ／ＡＰＭｌ的ＨＥＫ２９３细胞上清液中人脂联素蛋 白质浓度为（１５０±１２）¨∥Ｌ，而其余对照组均未检测 到脂联素蛋白。
Ｆｉｇ ２
图２表达ＧＦＰ的对照质粒转染ＨＥｌ＜２９３细胞