2010食品酶工程复习思考题(1)

食品酶工程复习思考题第一节酶工程概论1.明确概念：酶、酶活力、比活力、酶的活性中心、酶工程；酶：是由生物细胞合成的以蛋白质为主要成分，对底物起高效催化作用的生物催化剂(biocatalyst)。

其中包括具有催化作用的核酸-核酶（ribozyme）。

酶活力：酶催化某一化学反应的能力。

比活力：每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位数（U/mg蛋白）。

酶的活性中心：酶分子中直接结合底物，并催化底物化学反应的小区域。

酶工程：酶的生产与应用，它的近期目标是将基因工程、分子生物学成果用于酶的应用，进一步开发固定化酶技术与酶反应器。

2.了解酶工程的分类和发展历史；发展历史1、从动物、植物、微生物组织和细胞中提取酶2、微生物液体深层发酵生产酶3、提高酶的稳定性和使用效率4、基因工程生产酶5、蛋白质工程定向改造酶3、认识酶与一般催化剂的相同点和不同点。

酶与一般催化剂的共性：1量少催化效率高2不改变化学反应的平衡点3 降低反应活化能不同于一般催化剂的特性：1催化的高效性2作用的专一性（特异性、选择性）第二节酶的生产1．目前酶有哪三种生产方式？各有何优缺点？怎样应用？提取法，化学合成法，发酵法。

1.1提取法：用各种提取、分离技术从动物、植物或微生物细胞或组织中将酶提取分离出来的方法。

优:方法简单方便，在动植物资源丰富的地区，有其使用价值。

Eg 木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶等的生产。

缺:受到气候、地理环境的影响；还涉及技术上、经济上、以及伦理上的问题，酶源有限。

1.2化学合成法: 在生物体外，人工合成具有生物活性的蛋白质（酶）。

难点:1.氨基酸单体的纯度要求很高2.合成成本高3.只能合成化学结构已研究清楚的酶。

Eg.牛胰岛素,核糖核酸酶.1.3发酵法: 利用细胞，主要是微生物细胞的生命活动而获得人们所需的酶。

特点:1）微生物生长繁殖快，生活周期短，产量高，单位干重产物的酶比活很高。

2）微生物培养方法简单，所用的原料大都为农副产品，来源丰富，价格低廉，机械化程度高，经济效益高。

3）微生物菌株种类繁多，酶的品种齐全。

4）微生物有较强的适应性和应变能力，可以通过适应、诱导、诱变及基因工程等方法培育出新的产酶量高的菌种。

*人们偏好于使用长期以来在食品和饮料工业上用作生产菌的微生物。

因为要使用未经检验的微生物进行生产，就必须获得法定机构的许可，而获准前必须先进行产品毒性与安全性的估价。

2．酶的发酵生产有哪三种方法？各有何优缺点？怎样应用？1>固体发酵.( 主要是用于真菌来源的商业酶生产.)优：设备简单，操作方便，麦曲中酶浓度高，特别适用于各种老菌的培养和发酵产酶。

缺：劳动强度大,原料利用率较低,生产周期较长。

2>液体深层发酵。

（微生物细胞;植物细胞;动物细胞的悬浮培养和发酵。

）优点:液体深层发酵的机械化程度较高，技术管理较严，酶产率较高，质量较好，产品回收率较高，可实现连续化生产。

3>固定化细胞发酵。

（指固定在水不溶性载体上，在一定的空间范围内进行生命活动的细胞。

）优：1）细胞密度较高，反应器水平的生产强度较大，可提高生产能力；2）发酵稳定性好，可以反复使用或连续使用较长的时间，易于连续化、自动化生产。

3）细胞固定在载体上，流失较少，可在高稀释率的情况下连续发酵，大大提高设备利用率；4）发酵液中含菌体较少，利于产品分离纯化，提高产品质量等。

缺：技术要求高，需特殊的固定化细胞反应器，目前只适用于胞外酶的生产。

3.酶的发酵生产对菌种有何要求？特别是安全性方面FAO/WHO有哪三点基本要求？1）酶的产量高：繁殖快，产酶量高，有利于缩短生产周期。

2）容易培养和管理：能在便宜的底物上生长良好。

3）产酶性能稳定，菌株不易退化。

4）利于酶的分离纯化。

5）安全可靠：不是致病菌及产生有毒物质或其他生理活性物质的微生物，确保酶生产和应用的安全。

安全性: 1、凡从动植物可食部分的组织，或从食品加工传统使用菌种生产的酶，可作为食品对待，无需进行毒物学研究，而只需建立详细的有关酶化学与微生物学的详细说明即可；2、凡由非致病性的一般食品污染微生物提取的酶须进行短期毒性试验；3、对于非常见微生物制得之酶，则需作广泛毒性试验，包括慢性中毒。

4.提高酶产量的措施有哪些？其机理何在？4.1.控制发酵条件（成分，温度，pH，溶氧，搅拌）4.2.添加诱导物（作用底物，底物类似物，反应产物）4.3. 降低阻遏物浓度（代谢末端产物的阻遏，分解代谢物阻遏的调节）4.4.添加表面活性剂非离子型的表面活性剂：吐温、特里顿等；机理：1.积聚在细胞膜上，增加细胞的通透性，有利于酶的分泌；2. 有些表面活性剂对酶分子有一定的稳定作用4.5. 添加产酶促进剂（激活剂，稳定剂）第三节1．酶的分离纯化酶制剂制备的基本步骤有哪些？其各有何方法？原理何在？步骤：破碎细胞---溶剂抽提---离心过滤---浓缩---干燥---结晶破碎：a）机械破碎法：捣碎法，研磨法，匀浆法b）物理破碎法：温度差破碎法压力差破碎法（渗透压差法超声波破碎法）c）化学破碎法：应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构改变或破坏的方法c1.有机溶剂处理，c2.表面活性剂处理d）酶法破碎：外加酶处理，自溶法溶剂抽提：a）盐溶液提取b）酸碱溶液提取c）有机溶剂提取分离：a)离心分离b）过滤与膜分离c）沉淀分离：c1.盐析沉淀，c2.有机溶剂沉淀，c3.复合沉淀，c4.吸附层系分离浓缩：从低浓度酶溶液中除去部分的水或其他溶剂而成为高浓度溶液的过程 a）蒸发浓缩 b）真空浓缩干燥：真空干燥冷冻干燥喷雾干燥结晶：盐析结晶有机溶剂结晶透析平衡结晶等电点结晶2．课堂上主要介绍了哪些酶纯化与精制方法？其原理何在？凝胶过滤：又叫分子筛层析，是以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。

等电聚焦电泳（等电点沉淀）：利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的酶具有不同等电点这一特性进行分离纯化的方法。

亲和层析：利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化的技术3．酶分离提取过程中怎样判定酶的纯度？酶纯化过程中的每一个步骤都须进行酶活性及比活性的测定。

这样才能知道所需的酶是在哪一个部分，才可以用来比较酶的纯度。

酶的纯度可用酶的比活力来衡量。

4．酶应怎样保存？第四节酶分子的修饰与改造1．目前酶分子修饰与改造主要有哪二条途径？(1) 通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的结构。

(2) 通过生物工程方法改造编码酶分子的基因从而达到改造酶的目的。

2．酶分子修饰有哪几种方法？其原理何在？怎样应用？1 金属离子置换修饰改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法称为金属离子置换修饰。

简称为离子置换法用于修饰的金属离子钙、镁、锌、铜等二价金属离子。

适用的酶类结构中含有金属离子的酶。

2 大分子结合修饰利用水溶性大分子与酶结合，使酶的分子结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法大分子结合修饰是目前应用最广的酶分子修饰方法。

经过此法修饰的酶可显著提高酶活力，增加稳定性或降低抗原性。

3 肽链有限水解修饰在限定的肽键上进行肽链的水解，称为肽链有限水解。

选用肽链的有限水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有限水解修饰。

对酶进行肽链有限水解，通常使用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂。

此外也可采用其他方法使肽链部分水解，达到修饰目的。

4 酶蛋白侧链基团修饰组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。

主要有氨基、羧基、巯基、咪唑基等。

这些基团可组成各种副键，对于蛋白质空间结构的形成和稳定起着重要作用。

5 氨基酸置换修饰将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的某些改变，从而改变酶的某些特性和功能，这种修饰方法，称为氨基酸置换修饰。

氨基酸置换修饰可以用化学方法进行。

但现发展到用蛋白质工程来实现6 物理修饰通过各种物理方法，使酶分子的空间构象发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法称为物理修饰。

物理修饰的特点：不改变酶的组分和基团;酶分子中的共价键不发生改变;副键发生某些变化和重排3．酶分子修饰后性质有何改变？⑴酶活力提高使酶活性中心更有利于和底物结合，并形成准确的催化部位，从而提高酶活。

⑵酶的稳定性增加使酶与其它大分子结合，形成复合物，就可起到保护酶的天然构象的作用，从而增加酶的稳定性。

⑶酶的抗原性消除或降低当外源蛋白非经口进入人或动物体内后，体内血清就可能出现与此外源蛋白特异结合的抗体，能引起体内产生抗体的物质称为抗原，如精氨酸酶经聚乙二醇结合修饰后，其抗原性显著降低；用聚乙二醇对色氨酸酶进行修饰，可完全消除该酶的抗原性。

第五节生物催化剂的固定化1．明确概念：固定化酶、酶反应器、酶传感器、酶电极；固定化酶（immobilized enzyme）不溶于水的酶。

是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。

酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。

酶反应器——以酶为催化剂进行反应所需要的设备酶传感器——是以固定化酶作为感受器，以基础电极作为换能器的生物传感器。

酶电极——是应用最广泛的一种酶传感器。

酶电极用于样品组分的分析检测，有快速、方便、灵敏、精确的特点。

2．酶/细胞固定化的方法有哪几类？各有哪些具体方法？其优缺点如何？怎样应用？细胞的固定化方法：1包埋法2、吸附法酶固定的方法：物理吸附法：优点：操作简单，反应条件温和，可反复使用，经济，酶在固定化过程中变性的可能性小。

缺点：非特异性吸附，结合力弱，酶易解吸并污染产品方法：以固体表面物理吸附为依据，使酶与水不溶性载体相接触而达到酶吸附的目的离子吸附法：优点：操作简便，反应条件温和，制备出的固定化酶活性高，固定化酶容易回收再生。

缺点：载体与酶分子之间的结合仍不够牢固，当使用高浓度底物、高离子强度或pH值发生变化时酶容易脱落方法：通过离子效应，将酶分子固定到含有离子交换基团的固相载体上。

共价结合法：缺点：与吸附法相比，其反应条件苛刻，操作复杂，且由于采用了比较激烈的反应条件，容易使酶的高级结构发生变化而导致酶失活，有时也会使底物的专一性发生变化；优点：酶与载体结合牢固，一般不会因为底物浓度过高或存在的盐类等原因而轻易脱落。

方法：通过酶分子上的功能团，与载体表面上的反应基团发生化学反应形成共价键的一种固定化方法。

共价交联法：缺点：反应条件比较激烈，固定化酶的回收率低，包埋法：包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基起结合反应，较少改变酶的高级结构，酶的回收率较高。

仅适用于小分子底物和产物的酶，因为只有小分子物质才能扩散进入高分子凝胶的网格，并且这种扩散阻力还会导致固定化酶动力学行为的改变和活力的降低。