western-blot实验报告
免疫印迹实验报告
免疫印迹实验报告一、实验目的免疫印迹（Western blotting）是一种广泛应用于分子生物学、生物化学和免疫学等领域的技术，用于检测和定量特定蛋白质在样品中的表达水平。
本次实验的目的是通过免疫印迹技术检测目标蛋白在不同样品中的表达情况，以验证实验假设并为进一步的研究提供数据支持。
二、实验原理免疫印迹实验基于抗原抗体特异性结合的原理。
首先，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）将蛋白质样品按照分子量大小分离。
然后，将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜）上。
接着，膜与特异性抗体进行孵育，使抗体与目标蛋白结合。
最后，通过检测抗体的存在来确定目标蛋白的表达水平。
检测抗体的方法通常包括使用酶标记的二抗结合底物产生显色或发光信号，或者使用荧光标记的二抗通过荧光检测系统进行检测。
三、实验材料和设备1、材料细胞裂解液蛋白酶抑制剂蛋白标准品一抗（特异性针对目标蛋白）二抗（酶标记或荧光标记）化学发光底物（或荧光检测试剂）预染蛋白分子量标准硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜电泳缓冲液转膜缓冲液封闭液（如脱脂奶粉或牛血清白蛋白溶液）洗涤液（含吐温 20 的磷酸盐缓冲液）2、设备电泳仪和电泳槽转膜装置摇床冰箱酶标仪（或荧光检测仪器）四、实验步骤1、蛋白样品制备收集细胞或组织样本，加入适量的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，在冰上裂解一定时间。
离心收集上清液，即为蛋白样品。
2、 SDSPAGE 电泳制备 SDSPAGE 凝胶，根据目标蛋白的分子量选择合适的分离胶浓度。
将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性。
上样，进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部。
3、转膜电泳结束后，将凝胶浸泡在转膜缓冲液中平衡。
按照“三明治”结构组装转膜装置，依次为阴极、滤纸、凝胶、膜、滤纸、阳极。
在冰浴或冷室中进行转膜，根据蛋白分子量和转膜条件确定转膜时间。
4、封闭转膜结束后，将膜放入封闭液中，在摇床上孵育一定时间，以封闭非特异性结合位点。
免疫印迹实验报告——westerblot
免疫印迹实验报告——westerblotWestern blot实验报告摘要：目的：学习并掌握western blot分离蛋白及观察方法方法：western blot结果：见后文结论：western blot能很好地分离蛋白关键词：western blot、分离、小鼠组织、蛋白Western blot test reportAbstract: objective: Learn and master the western blot protein isolated and observation method Methods: western blot：,sds-page and electric transferResults: see belowKey words: Western blot、separate、mouse tissues、protein 前言:免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
蛋白印迹实验报告
蛋白印迹实验报告篇一：实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验目的1.了解Western blot的原理及其意义，掌握Western blot的操作方法；2.应用Western blot 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。
实验原理Western印迹法简称蛋白质印迹法。
蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定住蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记或同位素标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，或通过放射自显影显出谱带，即可检测出样品中的特异蛋白组分。
试剂与器材试剂1.转移缓冲液：甘氨酸（39 mmol/L），Tris 碱（48mmol/L），SDS （%），200ml 甲醇（20%），定容至1,000mL；2.封闭液：5% 脱脂奶粉，% 叠氮钠，溶于PBST溶液中；3.丽春红S（Ponceaus）染液：丽春红S溶于1mL 冰乙酸中，加水至100mL；洗膜液：PBS 缓冲液含% Tween 20；5．DAB浓缩显色液（50X）：DAB （二氨基联苯胺）是根过氧化物酶的底物之一，临用前稀释。
6．5 x PBS：在1600mL蒸馏水中溶解Na 2HPO4 , Na H2PO4, 40g Na Cl,用/L NaOH调pH至，加水定容至2升。
高压灭菌20 分钟，室温保存。
用前稀释至1x 。
7．SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。
器材电泳装置一套;2.电转移膜装置3.抗体-酶反应摇床操作方法〈一〉电转移1．将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳（1）。
2．载手套切6-8张定性滤纸和一张尼龙膜，它们的大小应与凝胶的大小相同。
在尼龙膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海棉（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。
免疫印迹技术实验报告
免疫印迹技术实验报告一、引言免疫印迹技术（Western Blotting）是一种用于检测特定蛋白质的定性和定量分析方法。
它基于免疫学原理，通过将待测蛋白质进行电泳分离，并利用抗体与目标蛋白质特异性结合的原理，最终实现对目标蛋白质的检测和定量分析。
本实验旨在通过免疫印迹技术检测目标蛋白质在不同样本中的表达水平，并观察其变化情况，以深入了解该蛋白质的功能和作用机制。
二、实验步骤1. 样本制备首先，我们需要准备样本。
样本可以是细胞或组织。
在实验中，我们选择了A 细胞和B细胞作为样本，分别进行后续实验。
2. 蛋白质提取将A细胞和B细胞分别加入适量的细胞裂解缓冲液，通过离心等操作将细胞裂解并获取蛋白质提取物。
3. SDS-PAGE电泳分离将蛋白质提取物加入SDS-PAGE凝胶中，进行电泳分离。
电泳时间和电压根据实验需要来确定。
4. 转膜将电泳分离后的蛋白质从凝胶中转移到聚丙烯酰胺膜上。
转膜可以通过湿法或半湿法等方法实现。
5. 阻断将转膜后的聚丙烯酰胺膜放入阻断液中，在室温下进行阻断。
阻断的目的是防止非特异性结合。
6. 一抗处理将目标蛋白质的一抗加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在一抗液中，进行一抗处理。
一抗的选择根据目标蛋白质的特异性来确定。
7. 洗涤将转膜的聚丙烯酰胺膜从一抗液中取出，进行洗涤。
洗涤的目的是去除非特异性结合的抗体。
8. 二抗处理将与目标蛋白质一抗结合的二抗加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在二抗液中，进行二抗处理。
9. 洗涤将转膜的聚丙烯酰胺膜从二抗液中取出，再次进行洗涤，确保清洗干净。
10. 显色将合适的显色剂加入到含有阻断液的培养皿中，将转膜的聚丙烯酰胺膜放置在显色剂中，进行显色反应。
显色剂的选择根据实验需要和目标蛋白质的特性来确定。
11. 照相观察显色结果，并使用相机拍摄转膜的聚丙烯酰胺膜，记录实验结果。
三、结果与讨论根据实验步骤，我们成功地使用免疫印迹技术检测了A细胞和B细胞中目标蛋白质的表达情况。
蛋白质印迹法实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质印迹法的基本原理和操作步骤。
2. 学习如何利用蛋白质印迹法检测目标蛋白的表达水平。
3. 掌握蛋白质印迹法的实验操作技巧，为后续相关实验奠定基础。
二、实验原理蛋白质印迹法（Western Blot）是一种常用的蛋白质检测技术，通过特异性抗体与待测蛋白结合，实现对目标蛋白的高灵敏度和高特异性检测。
实验原理如下：1. 蛋白质提取：从组织、细胞或体液中提取总蛋白质，避免蛋白质的降解和失活。
2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：将提取的蛋白质进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子量大小进行分离。
3. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相载体（如硝酸纤维素膜或PVDF膜）上。
4. 免疫反应：用特异性抗体与转移至固相载体上的目标蛋白结合，然后与酶或同位素标记的第二抗体发生反应。
5. 显色或放射自显影：通过底物显色或放射自显影等手段，实现对目标蛋白的检测和定量。
三、实验材料1. 细胞株：大鼠原代脊髓星形胶质细胞2. 主要试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清、裂解液、PBS、NaCl、SDS、聚丙烯酰胺凝胶、硝酸纤维素膜、PVDF膜、特异性抗体、酶联第二抗体、底物、显影液等。
3. 仪器：玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、-20低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床等。
四、实验步骤1. 细胞培养：将大鼠原代脊髓星形胶质细胞在DMEM/F12培养基和胎牛血清的条件下培养，直至达到实验所需状态。
2. 蛋白质提取：用裂解液提取细胞总蛋白质，并进行蛋白质浓度测定。
3. SDS-PAGE：将提取的蛋白质进行SDS-PAGE，根据蛋白质分子量大小进行分离。
4. 蛋白质转移：将分离后的蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜或PVDF膜上。
5. 免疫反应：将转膜后的膜与特异性抗体进行孵育，然后用酶联第二抗体进行孵育。
6. 显色：加入底物，观察目标蛋白条带的出现，并通过扫描成像系统进行定量分析。
免疫印迹实验报告
免疫印迹实验报告免疫印迹实验报告免疫印迹（Western blot）是一种常用的生物学实验技术，用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达水平，以及研究其功能和相互作用。
本实验旨在通过免疫印迹技术，探究细胞中特定蛋白质的表达情况，为进一步的研究提供基础数据。
实验材料与方法：材料：1. 细胞或组织样本2. 细胞裂解液3. 蛋白质电泳样品缓冲液4. 聚丙烯酰胺凝胶5. 转印膜6. 蛋白质标记物7. 抗体8. 酶联免疫检测试剂盒方法：1. 提取细胞或组织中的蛋白质，制备细胞裂解液。
2. 将蛋白质样品与电泳样品缓冲液混合，进行电泳分离。
3. 将分离后的蛋白质转移到转印膜上。
4. 在转印膜上进行阻断，以防止非特异性结合。
5. 添加特异性抗体，与目标蛋白质结合。
6. 使用酶联免疫检测试剂盒，检测抗体与蛋白质结合的信号。
7. 分析实验结果，得出结论。
实验结果与讨论：通过免疫印迹实验，我们成功检测到目标蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
实验结果显示，在细胞裂解液中，目标蛋白质呈现出明显的条带，证明其在细胞中存在且可被提取。
进一步分析实验结果，我们可以得出以下结论：1. 目标蛋白质在不同组织中的表达水平存在差异。
通过比较不同组织样本中目标蛋白质的表达情况，我们发现其表达水平在不同组织中存在差异。
这可能与细胞功能的差异以及组织特异性基因的调控有关。
2. 目标蛋白质在细胞发育过程中的变化。
通过对细胞或组织样本在不同发育阶段进行免疫印迹实验，我们可以观察到目标蛋白质在细胞发育过程中的表达变化。
这些变化可能与细胞分化、增殖以及功能转变等过程密切相关。
3. 目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用。
通过免疫印迹实验，我们可以进一步研究目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用。
通过添加不同抗体，我们可以检测到目标蛋白质与其他蛋白质的结合情况，揭示其在细胞信号传导和调控网络中的功能。
总结：免疫印迹实验是一种非常有用的生物学实验技术，可以用于检测特定蛋白质的表达水平以及研究其功能和相互作用。
免疫印迹 实验报告
免疫印迹实验报告免疫印迹实验报告免疫印迹（Western blot）是一种常用的蛋白质检测技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本实验旨在通过免疫印迹技术检测目标蛋白的表达情况，并探究其在细胞信号转导中的作用。
实验材料和方法：材料：1. 细胞培养基和培养器具2. 细胞裂解液3. 蛋白质电泳胶和电泳仪4. 蛋白转印膜和转印仪5. 抗体：一抗和二抗6. ECL检测试剂盒方法：1. 培养细胞并进行处理，如添加特定药物或刺激剂。
2. 收集细胞并用细胞裂解液裂解蛋白。
3. 通过SDS-PAGE电泳将蛋白质分离。
4. 将分离的蛋白转移到蛋白转印膜上。
5. 进行膜上抗原的非特异性结合位点的阻断。
6. 使用一抗与目标蛋白特异性结合。
7. 清洗膜，并使用二抗与一抗结合。
8. 再次清洗膜，并使用ECL检测试剂盒进行显色。
9. 使用图像分析软件分析结果。
结果与讨论：通过免疫印迹实验，我们成功检测到目标蛋白的表达情况。
在实验中，我们选择了细胞中一个重要的信号转导蛋白作为目标蛋白，以探究其在细胞内的作用和调控机制。
首先，我们培养了细胞并进行了不同处理。
通过细胞裂解液裂解蛋白，我们成功地提取了目标蛋白。
接下来，我们使用SDS-PAGE电泳将蛋白质分离，并将其转移到蛋白转印膜上。
通过这一步骤，我们可以将蛋白在膜上固定，并便于后续的抗体结合。
在进行免疫印迹之前，我们需要对膜进行阻断，以防止非特异性结合。
通过使用牛血清白蛋白或非脂性奶粉等物质，我们可以有效地阻断膜上的非特异性结合位点。
在阻断后，我们使用一抗与目标蛋白特异性结合。
一抗的选择对于实验结果的准确性至关重要，因此我们在实验前进行了充分的文献调研和试验优化。
在与一抗结合后，我们进行了膜的清洗，以去除未结合的抗体。
接下来，我们使用二抗与一抗结合，并再次清洗膜。
二抗通常被标记有荧光素或酶，以便于后续的信号检测。
最后，我们使用ECL检测试剂盒进行显色。
ECL技术利用酶的催化作用产生荧光或发光信号，从而检测目标蛋白的表达情况。
生化实验九 Western_blot的原理、操作
实验九 Western blot的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）A：实际操作1.做胶前的准备1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子。
2)检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。
3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。
2.制胶，电泳1）装好架子。
2)按照下面配方配制分离胶。
(单位：ml，Total： 8ml)在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。
3)4)待胶凝集好后，上样，电泳。
上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V 电压。
一般电泳时间在1.5小时左右。
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一、实验目的1.掌握Western-blot实验原理及方法应用2.巩固SDS-PAGE电泳相关操作3.学习PVDF转膜以及ECL显影技术二、实验原理Western-blot，中文为蛋白免疫印迹，其原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
三、实验材料试剂：纯水、琼脂糖、TEMED、30%丙烯酰胺、pH8.8 Tris-HCl、pH6.8Tris-HCl、10%SDS、10%APS、转膜缓冲液、10×TBS、10×蛋白电泳缓冲液、TBST、脱色液、显色试剂A、B，显影液、定影液器材：台式离心机、玻璃板、微波炉、滤纸、PVDF膜、手套、转膜槽、海绵垫、玻璃棒、保鲜膜、胶片、摇床等。
四、实验步骤1、样品制备取相应组织，加入135 μl 无SDS的匀浆缓冲液，于冰浴中，匀浆器15 秒一次，匀两次，再加入15 μl 10%的SDS。
95°C水浴5分钟。
10000 g离心30分钟，取上清。
每管20 μl 分装。
组织与匀浆液的比例= 1:5-1:102、清洗玻璃板3、灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶(操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶)。
(2)配12%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到离玻璃板3cm即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
(灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型)。
(3)当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等20 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)按前面方法配5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
待到浓缩胶凝固后( 20 min )，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
(5)将其放入电泳槽中。
(小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。
若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。
)(6)加足够的电泳液后开始准备上样(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板)。
用移液器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。
将移液器插至加样孔中缓慢加入样品。
4、电泳电泳时间一般4～5h，电压为80V，1h；也可用120V，1.5h。
电泳至溴酚兰至浓缩胶下3cm可终止电泳，进行转膜。
5、转膜(1)转一张膜需准备6张7.0～8.3cm的滤纸和1张7.3～8.6cm的PVDF膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。
将切好的PVDF膜用甲醇浸泡15s，再用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里。
在托盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
(2)将夹子打开使黑的一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动)。
在垫子上垫三层滤纸(可三张纸先叠在一起在垫于垫子上)，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
(3)用尺子跑后的胶撬开，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板(撬时一定要小心，玻板很易裂)。
除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作)，要避免把分离胶刮破。
小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。
将PVDF膜盖于胶上，要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。
在膜上盖3张滤纸并除去气泡。
最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。
整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡(操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通)。
(4)将夹子放入转膜槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。
电转移时会产热，将转移槽埋于冰水混合物中来降温。
转膜(30V，12h)。
6、免疫反应(1)将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。
封闭液为5%的脱脂牛奶，质量体积比，溶剂为TBS。
(2)将一抗用TBST稀释至适当浓度(在15 ml离心管中)；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次10min。
(3)同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，重复步骤(2)中最后一步，进行化学发光反应。
7、ECL显影。
采用化学发光法显影(1)分别取300μl A和B两种试剂，混匀。
将PVDF膜放在保鲜膜(面朝上)，加入AB混合液，用保鲜膜包好，放入X-光片夹中。
(2)在暗室中，将1×显影液和定影液分别倒入塑料盘中；在红灯下取出X光片，剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大1cm)；打开X光片夹，把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。
显影时间一般为1～2min(20～25℃)，温度过低时(低于16℃)需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10 min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
(注意：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响)。
五、实验结果SDS-PAGE电泳结果显示(图1)：本次电泳结果并不理想，条带拖尾且歪斜，同时存在非特异性条带或弥散条带，没有单一的目的蛋白条带，无法根据结果准确判断β-actin 蛋白与PKC目的蛋白的分子量大小。
图1SDS-PAGE电泳结果A：凝胶成像系统拍摄；B：手机自然光下拍摄M：marker；1：健康组织样品(对照组)；2：患病组织样品(实验组) 转膜结果显示(图2)：除Marker有条带，其余未出现条带，且Marker条带略微倾斜图2 PVDF转膜结果图M：Marker；1：健康组织样品(对照组)；2：患病组织样品(实验组) 本组实验结果(图3A)：显影结果表明只有Marker部分显影，且β-actin组中出现了细微的条带，但无法具体判断其蛋白分子量大小，目的蛋白条带未显现。
为更好分析实验结果，总结失败原因，我们借用了1班第四组的实验结果(图3B)进行分析：对照组的内参蛋白β-actin的蛋白分子量大小为40 kDa，目的蛋白PKC的蛋白分子量大小为58 kDa，而患病组织及实验组相较于健康组织目的蛋白PKC的蛋白分子量明显减少。
图3 Western 印迹测定细胞中PKC蛋白表达水平A：本组实验结果图；B:1班第4组结果图M:Marker；1：健康组织样品(对照组)；2：患病组织(实验组) 六、实验分析由于对该实验原理方法掌握以及结果分析上均存在一点困难，我在写这份实验报告时，尽量查询资料列举了可能造成实验失败的原因，并结合本次实验操作进行选择与摒弃，以帮助自己更好地理解掌握这项技术，也为下次进行相关实验能取得更好的实验效果。
下面是我的相关资料查询与结果分析和解决方案：(1) SDS-PAGE电泳：a条带拖尾：①样品溶解不好；加样前离心，优化蛋白提取方法，寻找合适大的裂解液②电泳缓冲液重复利用次数过多，本次实验所使用的缓冲液确实已使用过很多次，但由于当时未能找到新鲜的缓冲液，便将就使用，为更好的实验结果，电泳缓冲液以及转膜液可现用现配；③分离胶浓度过大，根据蛋白分子量大小选择合适的分离胶浓度b条带歪斜：①电泳温度过高。
造成产热过多，分离胶变形；②胶的浓度不均一，配胶过程中，一定要将所有的成分充分混合，本组在混匀时只是待全部加样完成后，即在加入TEMED后用手摇晃烧杯几下来以示混匀后便直接倒入玻璃板内，但正确操作应该每加一个样后便用玻璃棒混匀，吸取教训；③在转膜时，胶和膜没有压紧，留有空隙导致蛋白从中间的空隙转走，可以适当加一块滤纸或者海绵；④样本中可能存在细胞碎片或DNA，增加超声破碎步骤，延长加热时间，离心；⑤上样buffer不新鲜或者含有太多的盐分。
c非特异性条带或弥散性条带：①抗体浓度过高；②二抗引起的非特异性条带：样本中含有大量的类似球蛋白的抗原，容易和二抗引起反应，尤其是在变性情况下，在满足敏感性要求的前提下，荧光标记一抗，酶标兔抗荧光就可以解决该问题；③上样量过大，应根据梳子大小选择合适的上样体积；④样品降解出现其他分子结合膜上造成非特异性条带，因此选择新鲜制备的样品或加入蛋白酶抑制剂；⑤蛋白存在二聚体或不同亚型，上样前应充分煮样使蛋白充分解聚，可能煮样时间不够。
对于亚型造成的非特异性条带是不可避免的，可查阅相关文献或根据抗体说明书来寻找目的蛋白所在的确切位置；⑥迁移过快，电泳温度过高：本次实验中，电泳均在两板旁加了冰且即使更换，故可适当降低电泳速度。
d Marker未完全迁移分离电泳时间不够，因受PPT影响，认为电泳至溴酚兰至浓缩胶下3 cm可终止电泳，但其实这个所带来的后果便是Marker都未完全跑开，最终导致无法对目的蛋白分子量进行分析。
这同样给了我们一个经验教训：要学会思考，学会随机应变，而不是盲目地按照课本或者PPT。
(2)虽然本次实验我们组是失败的，但在观察了大部分其余组的结果发现，SDS-PAGE中，有待电泳跑至溴酚蓝3cm左右才停止电泳的，但结果图中亦存在条带拖尾及弥散性条带等，无法辨清目的蛋白，从多组结果的一个分析得出，极有可能是样品存在的问题①如未完全溶解或含有可溶性颗粒；②制样过程中超声破碎时间太长，样品未一直置于冰上，导致温度过高，样品中蛋白质降解，或者离心不完全，目的蛋白处于上清液中被吸走；③也有可能样品本身未降解，但由于放置时间太长，蛋白质沉积在EP管底部，电泳样品上样过程中可能虽然吹打了但没有完全混匀。
但由于制备样品过程并未参与，故具体原因尚不清楚。
(3)显影结果可以大概看到目的蛋白条带，但存在众多弥散性地连续性条带，即高背景。
可能原因分析:①抗体浓度过高，过高的一抗或者二抗浓度都会引起背景过高，可稀释抗体或采用dot blot 筛选抗体最适浓度；②膜被污染，但由于实验过程中，我们均佩戴了乳胶手套且镊子直取了膜的一个小边角，故该原因可能影响不是很大；③转膜液污染，转膜液配置应选择蒸馏水或者更高纯度的水，且应过滤。
④封闭不完全，本次封闭液采用的是5%的脱脂牛奶，在冰箱中封闭了12个小时以上，按理说应该封闭较为完全；⑤曝光过度，曝光时间控制在15s左右，如果曝光时间不能再缩短，应降低一抗浓度；(4)内参蛋白的选择本次选择的为β-actin，目的蛋白PKA的分子量为58 kDa，而β-actin蛋白的分子量为40 kDa。