内毒素的测定
内毒素检测方法
内毒素检测方法内毒素是一种存在于细菌细胞壁内的毒素，它们可以引起严重的免疫反应和炎症反应，对人体健康造成严重危害。
因此，及早检测和监测内毒素的水平对于预防和治疗相关疾病至关重要。
本文将介绍一些常见的内毒素检测方法，希望能为相关领域的研究人员提供帮助。
首先，内毒素检测的常用方法之一是内毒素生物学活性检测法。
这种方法利用动物模型或细胞培养来检测样品中的内毒素活性。
常见的动物模型包括大鼠、小鼠和兔子等，而细胞培养则是利用哺乳动物细胞来检测内毒素的活性。
这种方法的优势在于可以直接测量内毒素的生物学活性，但缺点是需要使用动物或细胞，操作复杂且耗时。
其次，内毒素检测的另一种常见方法是内毒素结构化学检测法。
这种方法利用色谱、质谱等技术来检测样品中内毒素的化学结构。
通过分析内毒素的化学成分和结构，可以快速准确地确定样品中内毒素的含量和种类。
这种方法的优势在于操作简单、快速高效，但需要专业的仪器设备和技术支持。
此外，内毒素检测的第三种常见方法是内毒素生物化学检测法。
这种方法利用生物化学反应来检测样品中的内毒素含量。
常见的生物化学检测方法包括内毒素酶联免疫吸附测定法（ELISA）、内毒素凝集酶试剂盒法等。
这些方法操作简单、快速，且灵敏度高，能够准确测定样品中的内毒素含量。
最后，内毒素检测的新兴方法之一是内毒素生物传感器检测法。
这种方法利用生物传感器来检测样品中的内毒素含量，具有操作简单、快速高效的特点。
生物传感器可以利用生物体内的生物反应来检测内毒素的含量，具有高灵敏度和快速反应的优势。
综上所述，内毒素检测方法包括内毒素生物学活性检测法、内毒素结构化学检测法、内毒素生物化学检测法和内毒素生物传感器检测法等。
每种方法都有其独特的优势和适用范围，研究人员可以根据实际需求选择合适的方法进行内毒素检测。
希望本文所介绍的内毒素检测方法能够为相关领域的研究工作提供一定的参考和帮助。
内毒素检测标准和正常值
内毒素检测标准和正常值内毒素检测是一种常用的方法，用于评估人体内是否存在细菌或真菌产生的内毒素，并且可以检测内毒素的水平是否超过正常范围。
内毒素是一种典型的生物碱，它能够引起炎症反应和组织损伤，因此内毒素的水平对于判断疾病的发展和预后具有重要的临床意义。
内毒素的检测标准主要包括两个方面：一是检测内毒素的种类和水平，二是判断内毒素水平是否超过正常范围。
在内毒素检测中，常用的方法包括细菌培养、PCR技术、酶联免疫吸附测定法（ELISA）等。
这些方法可以通过检测血液、尿液、皮肤划痕液等样本中的生物标志物来评估内毒素的水平。
其中，细菌培养是一种常用的方法，它可以通过培养人体样本中的细菌，然后检测培养液中是否存在内毒素。
PCR技术则可以直接检测细菌或真菌的DNA，从而间接评估内毒素的水平。
ELISA方法则是通过检测抗原-抗体反应来定量内毒素的浓度。
在判断内毒素的水平是否超过正常范围时，需要参考一些参考值。
这些参考值通常是通过多个研究人群的内毒素水平数据进行统计得出的。
例如，欧洲免疫学学会（ESI）曾对1200名健康人群进行了内毒素水平的研究，得出了正常范围为0.1-1.0 EU/mL的参考值。
此外，根据不同的内毒素种类和检测方法，不同实验室也会有一些特定的正常值范围。
然而，需要注意的是，内毒素的正常值范围并不是完全固定的，会受到多种因素的影响，如个体差异、环境因素等。
因此，在使用内毒素检测结果时，应结合具体疾病的临床表现以及其他相关检测结果进行综合评估。
总之，内毒素检测是评估内源性炎症反应和疾病严重程度的重要方法。
通过检测内毒素的种类和水平，并且参考正常范围，可以帮助医生判断疾病的发展和预后，进而制定适当的治疗方案。
细菌内毒素测定技术—细菌内毒素检查方法
知识点：光度测定法
四、结果判断 若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释
倍数后小于规定的内毒素限值，判定供试品符合规定；若 大于或等于规定的内毒素限值，判定供试品不符合规定。
注：本检查法中，“管”的意思包括其他任何反应容 器，如微孔板中的孔。
技能点：凝胶限度试验操作规程
检验供试品中的内毒素含量是否小于限值的定性方法，按下表制 备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供 试品溶液来制备溶液A 和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
3、如果供试品溶液的所有平行管均为阳性，应记为内 毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。
4、若内毒素浓度小于规定的限值，判定供试品符合规 定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判定供试品不 符合规定。
知识点：光度测定法
一、方法
光度测定法分为浊度法和显色基质法。 浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度 变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，可分为终 点浊度法和动态浊度法。 显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产 生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素 含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色 法。
试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品 符合规定；否则判定供试品不符合规定。
技能点：凝胶限度试验操作规程
4、阳性对照结果出现阴性，可能是由于内毒素工作品效价标 示不准确或效价衰退或失败；稀释内毒素没有使用旋涡混合器或 稀释操作不当；鲎试剂效价标示不准确或效价衰退或失效；反应 试管放入水浴保温前试管中内容物没有摇匀造成。阴性对照出现 阳性结果可能是由于鲎试剂或者水污染，试验器具污染，试验过 程操作不当污染造成。
A：没有超过MVD并且通过干扰试验的供试品系列稀释液。 B：供试品阳性对照。（为确证不存在干扰作用） C：标准内毒素系列。（为确证本次试验的操作和环境都符合要求。）D：阴性对照。
中华人民共和国国家标准细菌内毒素检测方法
医用输液、输血、注射器具细菌内毒素检验方法中华人民共和国国家标准 GB/T14233.2—93 1993-03-16发布一、定义及适用范围:本法系列用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中内毒素限量是否符合规定的一种方法。
用以代替家兔法对供试品进行热原初试。
本法仅适用于一次性使用输液器、输血器。
其他产品可参照使用。
二、主要设备:超净工作台、电热干燥箱、恒温水浴。
三、试剂 1、细菌内毒素国家标准品：用于仲裁鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。
2、细菌内毒素工作标准品：用于标定鲎试剂灵敏度和试验中阳性对照。
3、鲎试剂：灵敏度为0.25EU/ml，规格为0.5ml。
4、无热原水：内毒素含量小于0.05EU/ml。
四、试验前准备1、器具除热原:与试验液接触的所有器具均应除热原。
玻璃器具置电热干燥箱内250℃干烤至少60min；塑料器具置30%双氧水中浸泡4h，再用无热原水冲洗后于60℃烘干备用。
2、鲎试剂灵敏度测定（1）试验前应核对使用批号鲎试剂的灵敏度，应符合规定。
（2）灵敏度测定：根据标示的灵敏度范围，将细菌内毒素工作标准品用无热原水以1→2等比稀释，选择能出现阳性和阴性结果的4个连续稀释液。
取同一批号鲎试剂若干支，分别按标示量加入无热原水溶解为鲎试剂溶解液。
取10mm×75mm试管若干支，分别加入0.1ml鲎试剂溶解液，加入内毒素稀释液0.1ml，每一稀释液平行操作4管，轻轻振动试管混匀内容物，封闭管口，置37±1℃恒温水浴中保温60±2min观察结果。
最高浓度的4管应均为阳性，最低浓度的4管应为阴性。
五、试验方法1、供试品数量 :同一批号至少3个单位供试品。
2、浸提介质:无热原水。
3、供试液制备:在无菌条件下，每套输液器内腔注入10ml，输血器内腔注入15ml浸提介质，反复荡洗5次后两端密封，置37±1℃恒温箱中保温2h，取出后将供试液汇集至一无热原具塞玻璃容器内。
中国药典第二部分细菌内毒素检验方法
中国药典第二部分细菌内毒素检验方法
中国药典第二部分对细菌内毒素的检验方法主要包括以下几个方面：
1. 细菌内毒素的生物学活性测定：采用小鼠、兔等动物模型，通过观察动物的反应和生存情况来评价细菌内毒素的生物学活性。
2. 免疫学方法：利用抗体与内毒素结合反应，通过免疫沉淀、凝胶免疫扩散、酶联免疫吸附试验、放射免疫分析等方法来定量或定性检测细菌内毒素。
3. 生理检验：通过动物模型中的生理变化来判断细菌内毒素的存在与活性。
比如利用皮肤红斑反应、大鼠血压升高、家兔体温升高等指标。
4. 生化检验：采用染色反应、化学方法、酶活测定等手段来检测细菌内毒素的存在与活性。
比如利用抗原-抗体反应进行凝集、沉淀、免疫层析等实验。
以上这些方法都是中国药典第二部分中针对细菌内毒素的常用检验方法。
不同的方法适用于不同的细菌内毒素类型和浓度范围，综合运用可以提高检测的灵敏度和准确性。
内毒素含量测定方法
内毒素含量测定方法
首先，巴氏法是一种常用的内毒素测定方法，它是利用内毒素对家兔或小鼠产生发热反应的原理进行测定。
通过将待测样品与动物体内注射，观察动物是否出现发热反应来确定内毒素的含量。
这种方法的优点是操作简单，结果可靠，但缺点是需要动物实验，且耗时较长。
其次，凝血酶原时间法是通过测定内毒素对凝血酶原的影响来确定内毒素含量的方法。
内毒素能够激活凝血酶原，导致凝血酶原时间延长，通过测定延长的时间来计算内毒素的含量。
这种方法的优点是结果快速，但需要高度纯化的内毒素标准品进行比较，且对实验操作者的技术要求较高。
另外，内毒素结合试验是一种体外测定内毒素含量的方法，通过将内毒素与其结合蛋白结合后加入特定细胞，观察细胞是否发生溶解来确定内毒素的含量。
这种方法的优点是无需动物实验，结果快速，但需要高度纯化的内毒素和结合蛋白。
除了上述方法外，近年来还出现了一些新的内毒素含量测定方法，如基于免疫学原理的快速检测方法和基于生物传感器的测定方
法等，这些方法在操作简便、结果快速等方面有着一定的优势。
总的来说，内毒素含量的测定方法多种多样，每种方法都有其
适用的场景和局限性。
在选择合适的测定方法时，需要根据具体的
实验要求和条件进行综合考虑，以确保测定结果的准确性和可靠性。
光度法内毒素操作规程
光度法内毒素操作规程1. 背景介绍内毒素是一种常见的细菌产生的有毒分子，常见于细菌培养过程中的细胞壁释放物。
内毒素的存在会对生物体产生一定的毒性作用，因此在实验室中进行内毒素的检测和处理非常重要。
光度法是一种常用于内毒素检测的方法，通过测定溶液中光吸光度的变化来间接判断内毒素的含量。
本文档旨在规范光度法内毒素的操作流程，确保实验的准确性和安全性。
2. 实验材料和仪器•内毒素标准溶液•纯水•紫外可见分光光度计•塑料试管•称量器具•移液器3. 实验步骤3.1 样品制备1.将内毒素标准溶液稀释为适当浓度。
2.准备一个空白对照组，使用纯水替代内毒素标准溶液。
3.2 光度法测量1.将准备好的内毒素标准溶液和空白对照组分别倒入两个塑料试管中，每组至少三个重复样品。
2.使用紫外可见分光光度计设置波长为合适的吸光波长。
（根据标准溶液的特性和仪器的要求选择波长）3.在纯水中调零仪器，并将光路调整为最佳状态。
4.依次将样品放入光度计，记录各样品的吸光度值。
5.计算各样品的平均吸光度值并计算差值，以得到内毒素的含量。
3.3 数据处理和分析1.将各样品的吸光度值平均后的数据整理成表格或图解形式。
2.使用合适的统计方法进行数据分析，如方差分析或t检验等。
3.根据分析结果判断内毒素含量的差异是否显著。
4. 安全注意事项•实验过程中需佩戴实验手套和防护眼镜，避免内毒素对人体的直接接触。
•各种试剂和溶液应妥善保存，防止误用和污染。
•实验过程中如有意外溅洒等情况发生，应立即用大量清水冲洗受影响的部位，并寻求医疗帮助。
5. 结论本文档按照光度法的操作规程，介绍了光度法内毒素的实验步骤和安全注意事项。
通过标准溶液的测量和数据分析，可以得到准确的内毒素含量。
在进行实验过程中，实验人员应严格遵守操作规程，并做好必要的安全措施，以确保实验结果的准确性和人员的安全。
同位素标记法测定内毒素的原理
同位素标记法测定内毒素的原理
同位素标记法是一种用于测定内毒素的原理。
内毒素是一种细菌产生的毒素，它可以导致严重的炎症反应和休克。
同位素标记法利用同位素的放射性特性来追踪内毒素在生物体内的代谢和清除过程。
具体而言，同位素标记法测定内毒素的原理是利用放射性同位素标记内毒素分子，通常使用放射性碳（如^14C）或放射性氘（如^3H）来进行标记。
一旦内毒素分子被标记，它们就可以被追踪其在生物体内的行为。
标记的内毒素被引入实验对象的体内，然后通过不同的方法（如血液样本、尿液样本等）收集样本，通过测定样本中放射性同位素的浓度变化，可以推断内毒素的代谢速率、清除速率以及在体内的分布情况。
这种方法的优势在于可以提供对内毒素在体内动力学行为的直接测定，能够更准确地了解内毒素的代谢途径、半衰期以及清除途径。
同时，通过同位素标记法还可以研究内毒素与其他生物分子的相互作用，从而更深入地了解内毒素的生物学特性。
然而，需要注意的是，同位素标记法需要使用放射性同位素，因此在实验操作和废弃物处理上需要严格遵守放射性安全规定，以确保实验人员和环境的安全。
同时，对于使用同位素标记法测定内毒素的研究，也需要进行伦理审查和合规管理，确保实验过程符合伦理标准和法律法规要求。
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辅助方法：临床表现，免疫学，病 理学，影像学检查等 1.G试验：通过检测(1-3)-β -D-葡 聚糖的含量，判断是否有真菌感染 2.GM试验：曲霉属半乳甘露聚糖抗 原检测。判断是否曲霉属真菌感染
非传 统 检查
3.PCR技术：真菌的抗原、抗体及代 用于实验室检测，已成为这一 谢产物的血清学检查和真菌核酸检 领域研究的热点 测
内毒素检测的参考值
检测值﹤10pg/ml,阴性。 检测值介于10～20pg/ml之间，临床观察期， 建议动态采血检测。 检测值﹥20pg/ml，阳性，建议再次采血以确诊 。 肝炎 败血症 肿瘤 内毒素浓度 50-320 20-1000 20-700
检测样本的采集及影响因素
检测样本：血液 采集要求：采样过程要求无菌操作，用专用的无热原真空采 血管。常规病人早上用药治疗前空腹采血/取样（血透患 者透析前采血）。 样本保存：样本采集后应在3000转/分进行离心，若不能及 时检测，应将血浆转移至无热原转移管内，在-30℃冰箱 中冷冻保存，一周内使用。 特殊标本处理 ：对一般黄疸、溶血、乳糜血标本，稀释2~5 倍后进行检测 ；对于严重的黄疸、溶血、乳糜血标本， 应重新采血。
“G”试验缘何而来？
1-3-β-D-葡聚糖可特异性激活鲎变形细胞裂解 物中的G因子，引起裂解物凝固，故称G试验。
试验反应机理图：
（1-3）-D-Glucan LAL-RM(反应物) G因子 凝固酶 凝固蛋白原 凝固蛋白（凝胶）
活化G因子 凝固酶原
内毒素与β -葡聚糖的检测比较 已知能与鲎试剂发生反应的物质有 细菌内毒素和β -葡聚糖，但它们的
几丁质 麦角固 醇
羊毛固醇C－14去甲基化酶 14位还原和7－8位异构酶 角鲨烯环氧化酶
1-3-β-D-葡聚糖本质及特点
1
2 3
真菌细胞壁成分，占50%以上 其他微生物、动物及人的细胞不含该成分 用于侵袭性真菌感染的早期诊断
(1-3)-β-D-葡聚糖特性
1. 2.
3.
对热极为稳定，高压
121℃并不能使其灭活。
G试验检测评价
BG值在IFI临床表现出现之前就已经高于正常值
Pazos等报道5例确诊IFI及3例临床诊断的IFI患者，发现
BG值升高出现在发热、咳嗽、胸痛等症状和肺部HRCT检
查发现以前 。
• 平均早于发热5 d • 早于呼吸道症状平均10.7 d
J Clin Microbiol，2005，43(1)：299—305
侵袭性真菌感染的特点
1. 不产生内毒 素和外毒素 致病机理不明 2. 致病力一般 较弱，机体免 疫低下时发生
3. 感染菌种变化， 白色念珠菌感染下 降，曲霉菌感染增 长趋势上升明显
4. 早期症状无特异性， 往往被原发病掩盖，病 程长，发现较晚，死亡 率高
侵袭性真菌感染（IFI）现状
IFI发生率不断增加；
其原理是利用鲎的变形细胞与微量内毒
素产生凝集反应的现象，作为判断试品
中细菌内毒素含量的一种方法。
背面观
就像是古代武士的心甲
腹面观 腹部基本呈六角形， 还可以看到它发达的附肢
内毒素的检测原理
革兰阴性菌脂多糖（内毒素）检测原
理：革兰阴性菌脂多糖（内毒素）激 活酶反应主剂中的相应因子后形成凝 固蛋白， 根据其引起的浊度变化对革 兰氏阴性菌脂多糖（内毒素）浓度进 行定量测定。
在念珠菌和曲霉菌细胞 壁中含量较多，对G 试验灵敏。
当真菌进入人体血 液或深部组织后， 经吞噬细胞的吞噬 、消化等处理后， (1-3)-β-D-葡聚糖可 从胞壁中释放出来 ，从而使血液及其 它体液中含量增高 。当真菌在体内含 量减少时，机体免 疫系统可将其清除 。
在浅部真菌感染 中，(1-3)-β-D葡聚糖未被释放 出来，故其在体 液中的量不增高。
高达30% ～80% 。
侵袭性肺部真菌感染
临床表现：缺乏特异性,多表现为发热、咳
嗽、咳痰、咯血、胸闷、呼吸困难等。
现 状：两高两低一快
高院内感染率和病死率 低临床和实验室诊断率 患者病情恶化快
检测方法相对滞后,早期诊断和治疗仍存在困难,副作用小的 新型抗真菌药物价格昂贵,导致病死率高。
ICU诊断延迟时间与死亡率的关系
在胰腺疾病中的应用
在溃疡性结肠炎中的应用 在全身性细菌感染中的应用 在不明原因发热中的应用
6
内毒素检测在医院中的应用
1 2 3 4
在医院灭菌制剂检验中应用
对注射器、输液器等医疗器械的内毒素检测
在透析站和血站中的应用
在临床医学研究中的应用
内毒素的检测方法
鲎试验是1968年由Levin和Bang建立。
41
死亡率(%)30
25 20 15 延迟1天 延迟2天 延迟3天及以上 24
诊断延迟时间(d)
Garey KW et al. Clin Infect Dis 2006, 43:25–31 .
真菌细胞膜、壁结构
mannoproteins
β1,3 1,6 葡聚糖 磷脂 双分 子层
1,3葡聚糖 合成酶
糖尿病
胃癌，肝 癌，肝内 胆管癌， 肺癌，多 发性骨髓 瘤，白血 病，恶性 淋巴瘤
侵袭性肺部真菌感染
侵袭性真菌感染( invasive fungal infection, IFI)的发病
率逐年上升,其中又以侵袭性肺部真菌感染( invasive
pulmonary fungal infection, IPF I) 最常见,大约占50% ～60%。未经及时治疗的肺部真菌感染患者的病死率可
内毒素和1，3-β-D-葡聚糖检 测的临床应用
主要内容
内毒素的来源及结构 内毒素的生物学活性
内毒素检测的临床应用
内毒素的检测方法及参考范围
检测样本的采集及影响因素
内毒素概述
内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁结 构中的脂多糖（LPS），这些成分只 在细菌死亡裂解后才释放到菌体外或 活菌以发泡形式将其释出。
内毒素的检测原理
G G
内毒素的检测方法
鲎试剂（Limulus amebocyte lysate LAL)
1 2 3 4 5 6
凝胶法——0.03EU/ml范围内半定量 浊度法——0.006-300EU/ml,检测范围大
比色法——0.006-15EU/ml范围内定量
ELISA——0.1pg/ml
流式细胞术——测内毒素的量而不是活性 化学发光测定法
影响结果的因素
产生假阳性的原因有：操作环境及操作过 程中污染，应用某些抗生素类如-酰胺内酯 类、喹喏酮类等患者。
MB-80微生物快速动态检测系统
(1-3)--D-葡聚糖
侵袭性真菌感染的定义
定义: 指致病性真菌侵犯皮 下组织、黏膜、肌肉 和内脏器官等所引起 的真菌感染性疾病， 危害性较大。 条件致病性真菌 念珠菌属 曲霉属 其他
30 35 33 35
死亡率(%)
30 25 20 15 10 11
诊断延迟 时间 (h)
12 h
12-24 h
24-48 h
48 h
Morrell M et al. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49:3640–3645.
美国四大医疗中心做的一项回顾性研究
45 40 35 36
感染人数
80 70 60 50 40 30 20 10 0 1981-1986 1986-1991 1991-1996 1996-2001 18 26 26 75
刘正印等，中华医学杂志2003,83(5):399-402
国内侵袭性真菌感染不容忽视
感染率(%)
50 40 30 20 10 0 13.9 17.1 24.4
镰刀菌属 播散性接 赛多孢菌 感染 合菌病 属感染 83% 96% 58%
系列1
中国感染与化疗杂志2008 年7 月20 日第 8 卷第4 期
IFI诊断困难及漏诊情况严重
尸检研究发现，75%的侵袭性真菌感染病例在生前漏诊 诊断困难的主要原因：
--- 临床表现不典型，易被基础疾病所掩盖
--- 确诊常需侵入性手段获得组织标本，侵入性操作常因患者
内毒素的结构
外层 菌体多糖（O抗 原），与细菌侵 袭力有关。
中层 同一种属之间是相 同的。
内层 特殊的糖磷脂，起 毒性作用，而无种 属特异性。
特异性多糖
核心多糖
类脂A
内毒素的生物学活性
1 2
发热反应 激活血管活性物质的释放 激活凝血和纤溶系统
3
内毒素的生物学活性
4
激活补体 直接或间接损害肝脏 激活白三烯、前列腺素及单核巨噬系统
1993-1996
1998-1999
1999-2000
临床药物治疗杂志 2007年第5卷第1期
各种真菌感染的病死率
100.00% 73.50% 80.00% 58% 60.00% 40.00% 20.00% 0.00% 29.50% 90% 83% 96%
粒细胞缺 侵袭性念 侵袭性曲 乏患者曲 珠菌病 霉菌病 霉菌感染 29.50% 73.50% 90%
反应曲线不一样。内毒素反应曲线
为S型特征曲线，而β -葡聚糖反应 曲线为经过0点的斜线。
内毒素和β -葡聚糖与鲎试剂反应的特征曲线
侵袭性真菌感染的临床检测方法对比
方 传 统 检 查
直接培养真菌法
法
特
点
敏感性低，耗时长, 培养阳性 率低。培养结果是定性的，有 些标本采集困难 观察期不确定，费时费力，特 征性不明显并对医师的专业水 平要求高 耗时短，灵敏度高，特异性强， 定量检测可判断感染严重程度 对儿童及接受造血干细胞移植 患者、ICU患者不适用