硫酸苯酚法测多糖含量

硫酸－苯酚法测多糖含量

1．目的要求

测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量，如1型。

2．方法原理

糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。

3．主要实验仪器及材料

浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。

４．掌握要点

硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。

５．试剂配制

1）葡萄糖标准液的配制

准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，用蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。2）90%苯酚液的配制

准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存可达半年。

3）6%苯酚液的配制

将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。

6. 实验步骤

表1 标准曲线的制作步骤

管号0 1 2 3 4 5 6 7

葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0

苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0

取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。用exceL软件求得回归方程

2）待测样品多糖的测定与计算

将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意

乘换算系数。