水产品中孔雀石绿的测定
水产品中孔雀石绿的测定
6.2.8.标准贮备溶液:准确称量孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫各10mg，用乙睛分别定容于100mL容量瓶中，配制成100μg/mL的标准贮备液。
6.2.9.混合标准溶液:用流动相稀释标准贮备溶液，配制成孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫均为10μg/mL的混合标准溶液。0℃～4℃避光保存。
5.3.仪器和设备
5.3.1.酶标仪：配备450 nm滤光片。
5.3.2.分析天平：感量0.001g，感量0.0001g。
5.3.3.恒温培养箱。
5.3.4.均质器。
5.3.5.旋涡振荡器。
5.3.6.离心机：离心力≥4000g。
5.3.7.氮吹仪
5.3.8.微量单道/多道移液器：10μL～100μL；100μL～1000μL； 50μL～300μL。
5.7.1.检出限
本方法孔雀石绿及其代谢残留物的检出限为0.2μg/kg。
5.7.2.回收率
在样品中添加0.1μg/kg～4μg/kg浓度水平时，回收率为70％～120％。
5.7.3.重复性
本方法的批内变异系数≤10％，批间变异系数≤10％。
5.8.结果表述
当所对应的样品的测定值小于其检出限时，报告为孔雀石绿未检出。当测定值大于检出限时，报告为孔雀石绿检出。
水产品中孔雀石绿和结品紫及其代谢产物的快速测定方法SN/T 1768-2006
水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法GB/T 20361-2006
4.概述
孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，既是杀真菌剂，又是染料。长期以来，渔民都用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。研究显示，孔雀石绿在鱼体内残留时间长，且具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用。
水产品中残留孔雀石绿的毒性与检测方法
I he『esea rch『eviewed水产品中残留孔雀石绿的毒性与检测方法王邦国(靖远县农产品质量安全检验检测管理站730699)摘要：作为一种带有金属光泽绿色结晶体的孔雀石绿,在化学界中被称为四甲基代二氨基三苯甲烷,其在戊醇、乙醇、甲醇以及水中易于溶解,水溶液呈现蓝绿色,抗菌效力在药物染料中较强，可作为驱虫剂或杀菌剂，属于三苯甲烷类染料。
下面本文章将对水产品残留孔雀石绿的研究进展加以分析。
关键词:水产品;残留物质；孔雀石绿；研究进展在养殖过程中，我国曾以孔雀石绿作为清塘杀菌剂，同时，也常将孔雀石绿使用在存放池内和运输过程中，它们在鱼体内可分别代谢为无色结晶紫与无色孔雀石绿，因为其母体化合物与代谢物质存在较大的副作用，极易致突变、致畸、致癌，至此多数国家已经在20世纪90年代将孔雀石绿列为水产养殖禁用药用。
但是现阶段仍有一些渔民在违规使用,主要是因为孔雀石绿价格便宜,抗菌效果较好,所以有效监测孔雀石绿残留物质是至关重要的遥1孔雀石绿的分布与代谢情况进入机体后的孔雀石绿通常会经过生物转化，变成无色孔雀石绿，属于脂溶性的衍生物,极易残留在组织中。
一些业界人士发现，在鱼体内残留的孔雀石绿物质比水体中孔雀石绿的浓度明显要高,主要分布在内脏器官、皮肤、肌肉、肝脏、肾脏以及血浆中,同时体内也会蓄积孔雀石绿，特别是含有较多脂肪的组织中浓度水平更高。
在清除体内的孔雀石绿过程中，除脂肪含量影响与自身解毒能力外，还会受到环境因素的影响，如PH值和温度等。
在体内孔雀石绿的代谢方式有两条:首先，在还原酶的催化作用下,孔雀石绿可降解成无色孔雀石绿;其次，经N-脫甲基作用,在细胞色素催化下,生成次级或初级代谢产物芳香胺。
另外,无色孔雀石绿也有两条代谢方式:首先,基于氧化酶作用下,无色孔雀石绿会被重新氧化成孔雀石绿;其次,无色孔雀石绿经N-脫甲基作用，在催化作用下，酯化后与DNA形成DNA加合物。
2孔雀石绿的毒性与致毒机制据大量研究证实,在水产品中，孔雀石绿对动物的毒性较强,导致鱼皮肤和鳃上皮细胞轻度炎症,扩大肾小管壁细胞的胞核,使肾管腔有轻度扩张，甚至会影响鱼的生长与摄食,减少鱼肠中酶的分泌量。
KJ2017001水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法
KJ2017001水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法水产品中孔雀石绿的快速检测胶体金免疫层析法（KJ201701）1 范围本方法规定了水产品及其养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的胶体金免疫层析快速检测方法。
本方法适用于鱼肉及养殖用水中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量的快速测定。
2 原理样品中孔雀石绿、隐色孔雀石绿经有机试剂提取，吸附剂净化，正己烷除脂后，加入氧化剂将隐色孔雀石绿氧化成为孔雀石绿，经浓缩复溶后，孔雀石绿与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制抗体和检测卡中检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。
通过检测线与控制线（C线）颜色深浅比较，对样品中孔雀石绿和隐色孔雀石绿总量进行定性判定。
3 试剂和材料除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。
3.1 试剂3.1.1 正己烷。
3.1.2 乙腈。
3.1.3 冰乙酸。
3.1.4 盐酸。
3.1.5 吐温-20。
3.1.6 氯化钠。
3.1.7 对-甲苯磺酸。
3.1.8 无水乙酸钠。
3.1.9 盐酸羟胺。
3.1.10 无水硫酸钠。
3.1.11 中性氧化铝：层析用，100目~200目。
3.1.12 二氯二氰基苯醌。
3.1.13 氯化钾。
3.1.14 磷酸二氢钾。
3.1.15 十二水合磷酸氢二钠。
3.1.16 饱和氯化钠溶液：称取氯化钠（3.1.6）200g，加水500mL，超声使其充分溶解。
3.1.17盐酸羟胺溶液（0.25g/mL）：称取2.5g盐酸羟胺（3.1.9），用水溶解并稀释至10mL，混匀。
3.1.18 乙酸盐缓冲液：称取4.95g无水乙酸钠（3.1.8）及0.95g 对-甲苯磺酸（3.1.7）溶解于950mL水中，用冰乙酸（3.1.3）调节溶液pH为4.5，用水稀释至1L，混匀。
3.1.19 二氯二氰基苯醌溶液（0.001mol/L）：称取0.0227g二氯二氰基苯醌（3.1.12）置于100mL棕色容量瓶中，用乙腈（3.1.2）溶解并稀释至刻度，混匀。
孔雀石绿检测步骤
水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法的改进与实践心得1范围本标准规定了水产品中孔雀石绿及其代谢产物隐性孔雀石绿残留总量、结晶紫及其代谢产物隐性结晶紫残留量的高效液相色谱荧光测定方法。
2规范性引用文件本文主要参考了GB20361-2006水产品中的孔雀石绿和结晶紫残留量的测定高效液相色谱荧光检测法以及Determination of Malachite Green and Leucomalachite Green in Salmon with In-Situ Oxidation and Liquid Chromatography with Visible Detedction并结合实践进行报告。
3原理样品中残留的孔雀石绿或结晶紫用硼氢化钾还原为其相应的代谢产物隐性孔雀石绿或隐性结晶紫，乙腈-乙酸铵缓冲溶液混合提取，二氯甲烷溶液液萃取，固相萃取柱净化，反相色谱柱分离，荧光检测器检测，外标法定量。
4试剂除另有规定外，所有的试剂均为分析纯，实验用水应为二级水。
4.1 乙腈：色谱纯。
4.2 二氯甲烷：色谱纯。
4.3 酸性氧化铝：分析纯，粒度0.071mm-0.150mm。
4.4 二甘醇。
4.5 硼氢化钾。
4.6 无水乙酸铵。
4.7 冰乙酸。
4.8 氨水。
4.10 硼氢化钾溶液（0.2mol/L）：称取0.27g硼氢化钾于烧杯中，加入25mL水溶解，现配现用。
4.11 20%盐酸羟胺溶液：溶解12.5盐酸羟胺在50ml水中。
4.12 对甲苯磺酸（0.05mol/L）：称取0.95g对甲苯磺酸，用水稀释至100mL容量瓶中。
4.13 乙酸铵缓冲溶液（0.1mol/L）：称取7.71g无水乙酸铵溶于1000mL水中，氨水调pH 到10.0。
4.14 乙酸铵缓冲溶液（0.125mol/L）：称取9.64g无水乙酸铵溶解于1000mL水中，用冰乙酸调pH到4.5。
4.15 酸性氧化铝固相萃取柱：500mg，3mL。
水产品有机有害物的检测—孔雀石绿的测定
定量方法
四
内标法：
① 实验过程采用同位素内标法。 ② 内标物为：同位素内标氘代孔雀石绿(D5-MG)、
同位素内标氘代隐色孔雀石绿(D6-LMG)，纯度 大于98%。
检测原理
二
提取原理
试样中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶 紫、隐色结晶紫残留用乙腈提取，中性氧 化铝和阳离子交换固相萃取柱净化。
定量方法
1.液相色谱串联质谱测定 2.内标法定量。
三
1.提取过程：
提取步骤
称取5g样品于50 mL塑料离心管中； 加入20 μL内标标准工作液,加人10 mL乙腈； 匀浆2 min(l0000 r/min)； 超声提取10 min,离心3 min(3000 r/min)； 取上清液再加人10 mL乙腈,重复提取一次；
提取步骤
三
2.净化过程：
活化：5 mL乙腈。 上样：准确吸取5mL过固相萃取柱。 洗脱：用4 mL乙腈淋洗收集。 浓缩：洗脱液氮吹至0.5mL(≤45℃)。 复容：1.0 mL乙腈溶解，再加入1mL 乙酸铵溶液，过0.45 μm滤膜测定。
检测范围
四
种类及项目参数：
① 鱼、虾、蟹、贝、鱼粉、植物源性饲 料、浓缩饲料、配合饲料、饲料添加 剂、精料补充料。
检测原理 提取步骤 检测范围
孔雀石绿 简介
一
孔雀石绿室一种带有金属光泽的绿色结晶体，易 溶于水，水溶液呈蓝绿色。曾经作为杀菌剂，杀虫剂， 消毒剂 广泛应用于养殖业中，预防水产品水霉病、 鳃霉病和寄生虫病等，也用于水产品的运输和存放过 程中消毒并延长鱼类的生存时间，经研究表明孔雀石 绿进入人体或动物体后，代谢产物有高毒性、高残留 具有致畸 致癌 致突变风险严重危害人体或水产品安 全，因此我国已将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。
水产品中孔雀石绿快速检测方法
水产品中孔雀石绿快速检测方法
组织检测步骤：
鱼虾等去皮、脂肪，用均质器均质样本，称取2±0.05g均质物于15ml离心管；加入1瓶去脂试剂，振荡2min，室温4000rpm，离心3min。
倒掉上清液，把肉样弄松散（若要做添加实验，请在此刻加入添加物）；加入1瓶提取剂A，立即摇匀，然后加入1瓶提取剂B，充分振荡混合5min，室温4000rpm，离心5min；取上层有机层4ml到15ml离心管中，加入20ul衍生化试剂，涡旋1min，加入4ml净化剂，颠倒混匀1min，静置1min；取下层（溶液显紫红色）2ml，55℃下使用便携式空气吹干仪吹干；然后加入0.5ml缓冲液剧烈涡旋2min，待检。
检测:从包装中取出微孔，用移液器吸取待检液体80ul至微孔中充分吸打均匀，然后全部滴加至检测卡加样孔（检测卡平放），静置8-15分钟，根据示意图判读结果（见彩图）水样检测步骤：
①用移液器吸取80µl样本液至样品孔中。
②静置5-8分钟，根据示意图判读结果。
结果判定及示意图：
在试纸卡的中央判读区喷有2条线，上面一条为对照线(C线)，下面一条为测试线(T线)。
若样品液中孔雀石绿的浓度小于检测限时，则T线显色比C线强，或显色与C线相近；若样品液中孔雀石绿的浓度大于检测限时，则T线显色比C线浅很多或T线显绿色。
实验设备：
1、孔雀石绿快速检测卡；
2、PRO-12L空气吹干仪;
3、HH-1水浴锅；
4、80-2离心机；
5、均质器；
6、掌上电子天平。
水产品中孔雀石绿的常规检测方法
142实验研究引言我国有着非常丰富的水产资源，在世界上属于水产养殖大国。
水产品作为我国城乡居民摄入动物蛋白的主要来源之一，在居民的生产生活中占据着极其重要的地位。
随着我国科学技术的进步，经济的快速发展，人民生活水平不断提高，对水产品的需求量也不断增长。
在养殖过程中，为降低生产成本，使用含有激素或者发生霉变的饲料，滥用抗生素、激素等渔用药物防治水产动物疾病，导致水产品药物残留超标，严重危害人类健康。
加强水产品中的渔药检测就显得尤为重要，本文阐述及归纳了水产品中孔雀石绿检测的常用方法，为水产品药物残留检测提供重要依据，对保障人类食品安全具有一定的意义。
1.孔雀石绿的常规检测方法1.1前处理方法1.1.1液液萃取液液萃取也称溶剂萃取或抽提，是指利用在溶液系统中两种或多种物质组分溶解度或分配系数不同的原理，使溶质物质从其中一种溶剂中转移到另一溶剂中提取方法。
通过静置过程，将出现分层现象的两种互不相容的物质进行分离的操作，叫做分液。
提取孔雀石绿的过程中常用的萃取溶液是二氯甲烷和无水乙醇。
它的优点是可以在常温条件下进行，操作较为方便，不需要特殊的实验装置和操作技术；缺点是有机溶剂的消耗量较大，挥发性较强的溶剂应尽量在通风橱内操作并做好个人防护工作。
1.1.2固相萃取固相萃取是于20世纪80年代发展起来的一种样品前处理技术，通常与液相色谱技术相结合，主要用于样品前处理的分离、提纯和浓缩过程。
它的原理是通过固相萃取小柱中的固体吸附剂吸附液体中的目标化合物，将样品的基质与干扰物有效的分离，再用洗脱液进行洗脱或者通过加热过程使目标化合物解吸附，最后经过氮吹或者旋蒸，达到浓缩与富集目标化合物的目的。
固相萃取的优点是操作简单，分离时间短，试剂消耗量少，可有效提高被测样品的回收率，对于痕量分析物有较为出色的检测能力；缺点是成本较高，属于一次性使用的实验耗材，同时需要专业人员进行方法开发。
1.1.3分散固相萃取净化技术分散固相萃取净化技术也称为QuEChERS技术，是2003年由美国农业部Anastassiades等人开发，提出之后又经过多次验证和方法改进正式确立。
孔雀石绿的测定
孔雀石绿的测定本实验主要目标是通过酶标仪测定水产品中的孔雀石绿以及其衍生物的含量1 试验试剂：乙腈，试剂A，试剂B，酶标记浓缩物，酶标记稀释液，孔雀石绿样品稀释液，孔雀石绿100ppb标准液，氧化铝，底物溶液，停止液，蒸馏水2 实验仪器分析天平，组织粉碎机，精密移液器，50ml离心管,均质振荡器，通风柜，离心机，10ml塑料蓝盖试管，2ml 带塞小试管，水浴锅，氮气机，微孔计数板，酶标仪3 实验步骤1 先将所有试验试剂从冰箱中拿出来，于25-28度室温中放置1到2个小时后待用2 样品处理：将所测水产品去头去尾，去皮去骨取可吃部位，称20克左右，放入组织粉碎机充分粉碎后待用3 样品前处理：用分析天平称取5克样品，准确到0.0001克，放至50ml试管内，在通风柜内打开通风柜后。
用精密移液器使用5ml 一次性塑料移液管移取共10ml的乙腈到样品试管，用均质振荡器震荡10分钟，使样品鱼肉和乙腈充分混合。
再通过离心机（4200转/分钟）离心5分钟，（注意：使用离心机的时候，需要再加多一个离心管装水10ml保持离心机平衡，以免损坏离心机）4 精确称取3克中性氧化铝，准确到0.0001克，加入离心好的样品试管，再用离心机进行离心5分钟5 离心后的样品溶液取上层清液2ml到新的10ml蓝盖试管中，打开氮气机，当水浴锅温度设置在68度，放入试管，用氮气将样液吹干为止6 试剂A配制用2ml的带塞小试管配制，先移0.5ml 的试剂A入带塞小试管，再加入1.5ml乙腈，比例为1:3配制7将配制好1:3的试剂A移0.5ml至吹干的样品试管中，用振荡器混合三秒，静置30分钟8 称0.1克的试剂B加入静置30分钟后的样品试管，再静置10分钟9 从加入试剂B静置10分钟后的样品试管中，移取50ul(微升)上清液到10ml 带塞试管后再加入0.95ml 样品稀释液10 酶标记物配制：先移2.9ml酶标记物至10ml带塞试管后再加入0.1ml酶标记浓缩物即可11 取5个10ml带塞分别用笔0.405,0.135,0.045,0.015,0.0 05数字(a) 配制0.405ppb溶液：3.69ml标准稀释液到试管后再移取15ul（微升）100ppb孔雀石绿标准溶液混合即可配制完成(b)配制0.135ppb溶液：先移1ml标准稀释液到10ml 试管，再加入配制好的0.405ml溶液0.5ml混合即可成为0.135ppb溶液(c) 配制0.015ml溶液：先移1ml标准溶液到10ml试管，再加入配制好的0.135 ml溶液0.5ml混合即可成为0.015 ppb溶液（d）配制0.005 ml溶液: 先移1ml标准溶液到10ml 试管，再加入配制好的0.015ml溶液0.5ml混合即可成为0.005 ppb溶液12 取出混合板后，按0.405,0.135,0.045,0.015,0.0 05数字从小到大顺序分别移120ul（微升）到混合孔，最后移取样品液共6个孔，再加入120ul（微升）酶标记物溶液混合，轻轻震荡10秒13 从铝箔袋中拿出新的两条微孔条（注意：铝箔袋装的微孔条应避光收藏），再从混合板中移取200ul（微升）到微孔条的测试孔中，25-28摄氏度避光孵育30分钟14 孵育后，将微孔条的测试孔中溶液倒到水槽中，再用多管移液器移蒸馏水到各个孔眼中，震荡后倒掉，重复三次，总共四次洗板后，再在吸水纸上拍打微孔条，尽量将水拍干15 拍干水后，在各个孔眼中加入100ul（微升）底物溶液，在5-28摄氏度避光孵育30分钟16 孵育好的测试孔加入100ul（微升）停止液即可进行读数17 酶标仪先提早预热半个小时，再把样板微孔条放入酶标仪测试平台，再按下PLATE键送至酶标仪机内，打开电脑点击酶标仪桌面图标—点击登录—点击新建文件夹---出现新建程序---点击光度测量---选择上次测定数据（6孔眼的为孔雀石绿测定，7孔目为兽药测定）---点击运行---出现数据---记录数据---复制至另外文件夹附：通风柜的遥控器操作，A开关机 B 通风C 调风D 开关灯。
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标
题：水产品中孔雀石绿的测定
颁布日期：014 年 月 日
6.2.3. 冰乙酸:色谱纯。 6.2.4. 异丙醇。 6.2.5. 对-甲苯磺酸。 6.2.6. 乙酸盐缓冲液:称取 4.950g 无水乙酸钠及 0.950g 对-甲苯磺酸，溶解于 950 mL 水中，用 冰乙酸调节溶液 pH 到 4.5，最后用水定容到 1000mL。 6.2.7. 标准品:孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫纯度大于 98%。 6.2.8. 标准贮备溶液:准确称量孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫各 10mg，用乙睛 分别定容于 100mL 容量瓶中，配制成 100μ g/mL 的标准贮备液。 6.2.9. 混合标准溶液:用流动相稀释标准贮备溶液，配制成孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、 隐色结晶紫均为 10μ g/mL 的混合标准溶液。0℃～4℃避光保存。 6.2.10. 孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒。 6.3. 仪器和设备 6.3.1. 高效液相色谱仪:配紫外-可见光可变波长检测器；检测波长时间程序可控。 6.3.2. 匀浆机。 6.3.3. 旋转蒸发仪。 6.3.4. 离心机:4000r/min,8000r/min。 6.3.5. 振荡器。 6.3.6. 超声波水浴。 6.3.7. 聚四氟乙烯离心管:2.5mL,50mL，具塞。 6.3.8. 微孔滤膜:0.45μ m。 6.4. 测定步骤 6.4.1. 提取、净化 准确称取已捣碎的样品 5.00g 于 50mL 离心管中，先加入孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理 试剂盒中的提取剂(液体 20.0mL)、用匀浆机以 8OOOr/min 的速度均质 30s， 再加入提取剂 2(固体 粉末)，振荡 1min,4000r/min 离心 5min，取上清液 10.0mL 于鸡心瓶中再加入异丙醇 10mL50℃～ 55℃水浴旋转蒸干。残留物用 1.0mL 流动相溶解，溶解液放人 2.5mL 离心管中，8000r/min 离心 5min 后，用微孔滤膜过滤，滤液供仪器测定。 6.4.2. 绘制标准工作曲线 移取孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结品紫混合标准溶液，用流动相稀释成 2 ng/mL、
6. 液相色谱法
6.1. 原理 试样中的残留的孔雀石绿、结晶紫及其代谢物用孔雀石绿、结晶紫快速检测前处理试剂盒提 供的试剂提取、浓缩后用液相色谱进行检测，外标法定量。 6.2. 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为重蒸馏水。 6.2.1. 乙腈:色谱纯。 6.2.2. 无水乙酸钠。
作业指导书
50ng/mL、250ng/mL、500ng/mL 标准工作溶液，用高效液相色谱仪测定，得出标准工作曲线。 6.4.3. 测定 6.4.3.1. 液相色谱条件 a) 色谱往:C18 柱，250mm×4.6 mm(内径)，粒度 5μ m； b) 流动相:乙腈+乙酸盐缓冲液（80+20，体积分数); c) 流速：1.0mL/min； d) 柱温：室温； e) 检测波长时间程序 :0min ～ 5.0min,618nm;0min ～ 12min,588nm;12min ～ 18min,267nm; 孔 雀石绿的检测波长为 618nm，结晶紫的检测波长为 588nm,隐色孔雀石绿和隐色结晶紫的 检测波长为 267nm。 f) 进样量：50μ L。 6.4.3.2. 色谱测定 根据样液中孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫的含量情况，选定峰面积相近的标 准工作溶液。标准工作溶液和样液中孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫的响应值均应 在仪器的检测线性范围内。在上述色谱条件下，孔雀石绿、隐色孔雀绿、结晶紫、隐色结晶紫的 保留时间约为孔雀石绿 4.0min,隐色孔雀石绿 13.6min、结晶紫 5.4min 和隐色结晶紫 14.7min。 标准品色谱图参见附录 A 中图 A.1。 6.4.4. 空白实验 除不加试样外，按上述测定步骤进行。 6.5. 结果计算 用色谱数据处理机或按下式分别计算供试样品中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色 结晶紫残留量。 w= 式中: w — 水产品中孔雀石绿、 隐色孔雀石绿、 结晶紫和隐色结晶紫残留量， 单位为微克每千克(μ g/kg)； ci — 标准曲线上查出试样溶液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫和隐色结晶紫标准工作 溶液的浓度，单位为微克每升(μ g/L)； V — 最终定容体积数，单位为毫升(mL)； 2 — 换算常数; m — 供试试料样品质量，单位为克(g)。 本方法分别计算孔雀石绿及代谢产物隐色孔雀石绿，并分别报告孔雀石绿及代谢产物隐色孔 雀石绿结果。 2 × ci × V m
5.1. 原理 本孔雀石绿类酶联免疫检验试剂，主要是利用还原剂将样品中的孔雀石绿还原成隐性孔雀石 绿后，利用抗原与抗体之特异性免疫化学反应的基本原理来进行的，换句话说，就是利用酶标记 物与样品中之隐性孔雀石绿对微孔中之抗体来进行竞争反应。 在整个反应当中，如果样品中之隐性孔雀石绿残留的越多，相对地就会竞争掉越多的抗体， 使得结合了与微孔盘上包被的抗原结合抗体的二次抗体相对地就会减少。因此，反应中之酶标记 物结合体-底物溶液之呈色就会很淡，甚至几乎没有颜色，此即为阳性反应。反之，若样品中没 有含隐性孔雀石绿，则呈色会比较深，与阴性标准品呈色几乎是一样的，此即为阴性反应。 5.2. 试剂和材料 5.2.1. 实验室用试剂：所用试剂除另有规定外，均为分析纯。水为符合 GB/T 6682 规定的二级 水。
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题：水产品中孔雀石绿的测定
颁布日期：2014 年 月 日
层，待玻璃管冷却至室温后再次以离心机离心 1700×g(约 3500rpm) 10 分钟。用吸管吸去上层液 (正己烷)，再吸取下层液(水层)备用 稀释倍数：1 5.5. 酶联免疫测定 5.5.1. 使用前将试剂盒置于室温(20-25℃)平衡 30min 以上， 注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 取出需要数量的酶标板微孔条插入框架中，将不用的微孔条放入自封袋， 保存于 2-8℃不要冷冻; 5.5.2. 于适当微孔分别加入 100μ L 隐性孔雀石绿标准液。 5.5.3. 在另外的微孔加入 100μ L 已完成前处理之样品溶液。 5.5.4. 再于每一微孔另再加入 100μ L 的 1 倍隐性孔雀石绿抗体。 5.5.5. 轻敲盘子四周，使其充分混合后室温下反应 30 分钟。 5.5.6. 将微孔中之反应液甩掉，再将 300μ L 的 1 倍清洗液加满每一微孔后甩掉，重复此步骤洗 3 次。 5.5.7. 最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。 5.5.8. 于每一微孔加入 100μ L 的 1 倍二次抗体。 5.5.9. 轻敲盘子四周，使其充分混合后室温下反应 30 分钟。 5.5.10. 将微孔中之反应液甩掉， 再将 300μ L 的 1 倍清洗液加满每一微孔后甩掉， 重复此步骤洗 3 次。 5.5.11. 最后一次甩掉后，在吸水纸上拍干。 5.5.12. 于每一微孔加入底物溶液 100μ L。 5.5.13. 轻敲盘子四周，使其充分混合后室温卜反应 20 分钟。 5.5.14. 加入反应终止液，每一微孔加入 100μ L。 5.5.15. 酶标仪以单波长 450 nm 或双波长 450 nm/650 nm 判读。 5.6. 结果判定 5.6.1. 定性判定 用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含孔雀石绿浓度范围(ng/ml)。假设样 品 1 的吸光度值为 0.313，样品 2 的吸光度值为 1.032，标准液吸光度值分别是:0ppb 为 1.892； 0.025ppb 为 1.501；0.05ppb 为 1.175；0.1ppb 为 0.751；0.3ppb 为 0.421；0.6ppb 为 0.198。 则样品 1 的浓度范围 0.3ppb-0.6ppb;样品 2 的浓度范围 0.05ppb-0.lppb。(再乘以相应的稀释倍 数)
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题：水产品中孔雀石绿的测定
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5.2.2. 乙酸乙酯。 5.2.3. 正己烷。 5.2.4. 12N 盐酸溶液 5.2.5. 孔雀石绿酶联免疫试剂盒 5.3. 仪器和设备 5.3.1. 酶标仪：配备 450 nm 滤光片。 5.3.2. 分析天平：感量 0.001g，感量 0.0001g。 5.3.3. 恒温培养箱。 5.3.4. 均质器。 5.3.5. 旋涡振荡器。 5.3.6. 离心机：离心力≥4000g。 5.3.7. 氮吹仪 5.3.8. 微量单道/多道移液器：10μ L～100μ L；100μ L～1000μ L； 50μ L～300μ L。 5.3.9. 水浴锅。 5.3.10. 聚四氟乙烯离心管：5mL，50mL，具塞。 5.4. 样品处理 5.4.1. 将 2 克已均质之样品放入 15mL 离心管中，加入 0.4%还原剂 3mL 后立刻震荡 1 分钟使成肉 浆状。 5.4.2. 静置 30 分钟。 5.4.3. 再加入 6mL 0.002N 盐酸-乙酸乙酯，震荡 1 分钟。 5.4.4. 以离心机离心 1700×g(约 3500rpm)10 分钟。 5.4.5. 离心后若于上层有机层内观察到白色胶状物时， 用竹棒或移液枪头搅拌上层有机层后再次 以 1700×g(约 3500rpm)离心 10 分钟。 5.4.6. 取 3mL 上层液(盐酸-乙酸乙酯)至 10mL 玻璃管中，于 60℃下，利用氮气将有机溶剂吹干。 5.4.7. 于此玻璃管中加入正己烷 1mL ,剧烈震荡将残余物完全溶解(若氮吹后的管内有很多油脂 时，可将正己烷加入量改为 2mL。)。 5.4.8. 缓缓加入 1mL 样品稀释液，轻柔混合震荡(vortex) 1 分钟。 5.4.9. 以离心机离心 1700×g(约 3500rpm) 10 分钟。 5.4.10. 若离心后不能确实分层而在两层问出现乳化层时，请置于沸水中隔水加热至上下确实分
4. 概述
孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，既是杀真菌剂，又是染料。长期以来，渔民都 用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中 和存放池内，也常使用孔雀石绿。研究显示，孔雀石绿在鱼体内残留时间长，且具有高毒性、高 残留和致癌、致畸、致突变等副作用。