实验室分子生物学实验基本操作要求规范及注意事项
分子生物学技术的使用注意事项
分子生物学技术的使用注意事项随着人类对生物学的认识不断深入，分子生物学技术也得到了广泛应用。
这些技术为我们研究细胞、基因和蛋白质的结构与功能提供了有力的工具。
然而，分子生物学技术的使用需要非常慎重，因为错误的应用可能导致严重的后果。
在进行任何分子生物学实验之前，研究人员应该遵循一系列的注意事项，以确保实验的准确性和安全性。
本文将针对分子生物学技术的使用注意事项进行详细讲解。
首先，准确的实验设计是确保实验成功的关键。
在进行实验之前，研究人员应该对实验目的、方法和预期结果有清晰的了解。
他们应该仔细选择合适的试剂和仪器，并根据实验的要求进行合理的样品准备。
此外，研究人员还应该制定实验的控制组和实验组，以确保实验结果的可比性和可靠性。
其次，实验操作时的实验室安全是至关重要的。
研究人员应该正确佩戴个人防护装备，包括实验室外套、手套、护目镜等，并遵守实验室的安全操作规程。
分子生物学实验通常涉及到对生物材料（如细胞、核酸和蛋白质）的处理，这些材料可能存在潜在的危险，例如病原微生物或有害化学物质。
因此，研究人员在进行实验时必须严格控制实验室环境，避免与其他实验室成员或实验室周围的环境发生交叉污染。
在分子生物学实验中，实验对照组的设置和样品处理的规范也是非常重要的。
实验对照组是用于比较实验组结果的参照标准，帮助我们确定实验数据的可靠性和解释实验结果。
而样品处理的规范则要求研究人员在每个实验步骤中严格遵循相同的操作过程，以减小实验误差的可能性。
此外，在进行分子生物学实验时，需要严格控制实验试剂的质量和纯度，以确保实验结果的可靠性。
选择符合标准的实验试剂供应商是非常重要的。
实验数据的分析与解读也需要谨慎对待。
研究人员应该使用合适的统计方法分析实验数据，并据此作出准确的结论。
在解释实验结果时，研究人员应该考虑实验操作过程中的潜在误差，并确定实验结果的可重复性和可靠性。
此外，研究人员应该对实验结果进行充分的讨论，提出合理的解释和假设，并指出可能的局限性和不确定性。
分子生物学检测实验室技术要求与质量控制
案例分析：乙型 肝炎病毒核酸检
测
遗传性疾病：由基因突变或染色体异常引起的疾病
诊断方法：分子生物学检测技术，如基因测序、基因芯片等
应用案例：遗传性疾病的诊断，如唐氏综合征、地中海贫血等
质量控制：确保检测结果的准确性和可靠性，如样本采集、处理、检测等环节的质量控 制
个体化医疗：根据患者的基因、环境和生活方式等因素制定个性化的治疗方案 精准医学：通过分子生物学检测技术，精确诊断疾病，制定个性化的治疗方案 案例分析：分子生物学检测技术在癌症、遗传病等疾病诊断中的应用 技术要求：分子生物学检测实验室的技术要求，包括设备、试剂、人员等
PART SIX
实验室生物安全是实 验室工作的重要组成 部分，需要严格遵守 相关法律法规和标准。
实验室生物安全包括 生物安全柜、生物安 全实验室、生物安全 防护设备等设施设备 的使用和管理。
实验室生物安全还包 括实验室人员的培训 和考核，确保实验室 人员具备必要的生物 安全知识和技能。
实验室生物安全还需 要建立完善的生物安 全管理制度和应急预 案，确保实验室生物 安全的有效实施。
应用：研究基 因表达调控、 疾病诊断、药 物研发等领域
质量控制：包括 样本采集、RNA 提取、构建、 测序和数据分析 等环节的质量控
制
蛋白质组学：研究蛋白质在细 胞、组织或生物体中的表达、 修饰、相互作用和功能
蛋白质组学检测技术：包括质 谱分析、蛋白质芯片、蛋白质 相互作用分析等
质谱分析：通过测量蛋白质的 质量和电荷，确定蛋白质的种 类和数量
实验动物福利：确保实验动物的健 康和福利，遵循3R原则（替代、减 少、优化）
实验动物使用：实验动物必须经过 适当的训练和适应，确保实验结果 的准确性
分子生物学操作手册
分子生物学操作手册一、引言分子生物学是研究生物体分子结构、功能和相互作用的一门学科。
操作手册旨在提供分子生物学实验的详细步骤，并帮助读者准确、高效地进行实验操作。
本文将介绍PCR扩增、DNA电泳、亚克隆和蛋白质表达等实验步骤，并提供一些常用操作的技巧和注意事项。
二、PCR扩增PCR扩增是分子生物学实验中常用的技术，用于扩增特定区域的DNA片段。
以下是PCR扩增的基本步骤：1. 准备PCR反应体系：根据实验需要，配置PCR反应液，包括DNA模板、引物、酶、缓冲液和dNTPs等。
2. 设定PCR程序：根据模板序列的长度和引物的特性，设定合适的PCR程序，包括变性、退火和延伸等步骤。
3. PCR反应：将PCR反应体系置于热循环仪中，按照设定的程序进行PCR反应。
4. 结果分析：利用DNA电泳等技术，分析PCR反应产物的大小和纯度。
三、DNA电泳DNA电泳是一种常用的DNA分析技术，用于确定DNA片段的大小和纯度。
以下是DNA电泳的基本步骤：1. 制备琼脂糖凝胶：根据需要，配制适当浓度的琼脂糖凝胶，并倒入凝胶槽中，形成凝胶床。
2. 加载样品：将PCR扩增产物或其他DNA样品与DNA标记物混合，加入琼脂糖凝胶孔中。
3. 进行电泳：将凝胶槽放入电泳仪中，进行电泳操作，根据需要设置适当的电压和时间。
4. 结果分析：利用紫外线透射仪观察凝胶上DNA迁移的情况，测量DNA片段的大小。
四、亚克隆亚克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，通常用于构建重组DNA或进行基因克隆。
以下是亚克隆的基本步骤：1. 准备载体和DNA片段：准备含有目标基因的DNA片段和经酶切的载体DNA。
2. 消化与连接：将DNA片段与载体DNA进行连接反应，通常使用DNA连接酶。
3. 转化：将亚克隆反应产物转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。
4. 筛选与鉴定：通过筛选培养基和PCR等技术，鉴定含有目标基因的克隆。
五、蛋白质表达蛋白质表达是将目标蛋白质在细胞内大量合成的过程，利用该技术可以生产重组蛋白以供研究和应用。
分子生物学实验的注意事项
分子生物学实验的注意事项分子生物学实验是研究生物体分子结构、功能和相互作用的重要手段。
在进行分子生物学实验时，需要注意一些重要事项，以确保实验的准确性和可靠性。
本文将从实验前的准备工作、实验操作的注意事项以及实验后的数据分析等方面进行探讨。
一、实验前的准备工作在进行分子生物学实验之前，实验者需要进行充分的准备工作。
首先，要仔细阅读实验方案和相关文献，了解实验的目的、原理和步骤。
其次，要准备好所需的试剂和仪器设备，并检查其完整性和有效性。
同时，要保证实验环境的清洁和卫生，防止外源性污染对实验结果的影响。
二、实验操作的注意事项在进行分子生物学实验的操作过程中，需要注意以下几点。
首先，要严格控制实验条件的一致性，包括温度、湿度、光照等因素。
这样可以减小实验误差，提高实验的可重复性。
其次，要注意实验操作的精确性和细致性。
例如，在取样、称量试剂和配制溶液时要准确无误，避免因操作不当而引入误差。
此外，要注意实验操作的卫生和安全，佩戴实验服、手套和口罩，避免对实验者和环境造成伤害。
三、实验后的数据分析在分子生物学实验完成后，需要对实验结果进行准确的数据分析。
首先，要对实验数据进行统计和整理，计算平均值、标准差等统计指标，以评估实验结果的可靠性和显著性。
其次，要进行数据的图形化展示，使用适当的图表和图像来直观地表达实验结果。
此外，要进行结果的比较和解释，结合相关文献和理论知识，分析实验结果的意义和可能的机制。
四、实验中的常见问题及解决方法在进行分子生物学实验时，常常会遇到一些问题。
例如，实验结果不稳定、试剂污染、实验操作失误等。
针对这些问题，可以采取一些解决方法。
首先，可以优化实验条件，调整温度、pH值等因素，以提高实验结果的稳定性。
其次，可以进行试剂的质量控制，使用高纯度的试剂，并进行必要的质检。
此外，要加强实验操作的培训和规范，提高实验者的操作技巧和经验。
总结起来，分子生物学实验是一项复杂而精细的工作，需要实验者具备扎实的理论基础和严谨的实验态度。
实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项
实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项一、酶与载体的分装酶类与载体：T载体(50 ng/μl)用灭菌水稀释4倍（12.5 ng/μl）后分装成10 μl或20 μl；连接酶（solutionΙ）按5 μl分装；dNTP（10 mM）分装成50 μl；无菌水分装成1 ml；注意：（1）所有分装都必须用已灭菌的管。
（2）所有工具酶和载体的使用过程均在冰浴中进行。
（3）工具酶、载体以及试剂盒等实验室共用物品，用完后必须及时放回原处，以免耽误他人使用。
（4）当你发现你使用的是最后一管（盒）公用物品时，请马上告知负责人购买，以免耽误使用。
（5）感受态，氨苄青霉素和IPTG由研究生轮流负责制备。
每人负责六个月。
其他试剂则由第一位使用新包装的同学分装。
由于分子实验工具酶比较容易失活，必须在冰上进行分装。
二、常见抗生素及IPTG的配置以氨苄青霉素为例：1．准备足够量的1.5 ml的EP管、两个100 ml的离心管、0.22 μm水系滤器、注射器、蒸馏水，以上用品均要进行高压灭菌。
2. 洁净工作台紫外灭菌，然后进行以下操作。
3．称取2 g的氨苄青霉素粉末于离心管中，加入灭菌水至总体积为20 ml，轻摇离心管，至氨苄青霉素粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。
4．用注射器吸取配制好的溶液，然后把滤器安在注射器上，缓缓推动注射器活塞，把溶液经滤膜推至100 ml的离心管中。
注意：动作要缓和，使滤出液出口正对着离心管，还要防止染菌。
5．把100 ml离心管中已除菌的氨苄青霉素溶液分装到1.5 ml的EP管中，每管0.5 ml。
在EP管上做好标记，包括名称、浓度、日期等。
6．把做好标记的盛有氨苄青霉素的EP管于-20℃保存。
注意：当你发现你使用的是最后一管抗生素时，请马上告知有关人员及时配制，以免耽误使用。
表1.常见抗生素的储存浓度及工作浓度名称储存浓度工作浓度氨苄青霉素（ampicillin）100 mg/ml 50 μg/ml～100 μg/ml卡那霉素（kanamycin）10 mg/ml 10 μg/ml～50 μg/ml氯霉素（chloramphenicol）25 mg/ml 12.5 μg/ml～25 μg/ml链霉素（streptomycin）50 mg/ml 10 μg/ml～50 μg/ml四环素（tetracyyline）10 mg/ml10 μg/ml～50 μg/mlIPTG 1 M 0.05-0.6 mM三、分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制参见《分子克隆》。
大学生物教案：分子生物学实验的操作指南
大学生物教案：分子生物学实验的操作指南1. 引言本指南旨在提供大学生物专业的教师和学生们关于分子生物学实验的具体操作步骤与技巧。
分子生物学是现代生命科学研究中至关重要的一部分，通过实验操作可以加深对分子级别生命现象的理解。
在这个指南中，我们将介绍几个常见的分子生物学实验，并提供详细步骤以及相关注意事项。
2. 实验1：DNA提取2.1 实验原理在本节中，我们将介绍DNA提取实验的基本原理和背景知识。
这包括了DNA 提取方法、材料准备和实验目标等内容。
2.2 实验步骤•样品准备：选择适当来源（如水果、血液等）并根据实验要求进行预处理。
•细胞破碎：使用细胞裂解缓冲液和搅拌器将样品细胞破碎。
•DNA沉淀：添加盐和酒精使DNA沉淀出来，并用无菌水洗涤。
•DNA溶解：使用缓冲液溶解沉淀的DNA。
2.3 注意事项•材料应严格按照实验要求选用，确保实验结果的可重复性。
•使用无菌操作技巧以避免外源性DNA污染。
•注意个人安全，佩戴实验室所需的防护装备。
3. 实验2：PCR扩增反应3.1 实验原理在本节中，我们将介绍PCR（聚合酶链式反应）扩增反应的原理和背景知识。
这包括了PCR技术的基本原理、引物设计和酶选择等内容。
3.2 实验步骤•反应体系准备：根据实验目标计算并配置PCR反应所需的试剂和底物。
•DNA模板制备：提取样品中的DNA，并以适当浓度加入到PCR反应中。
•PCR反应设置：配置好PCR反应管，包括引物、酶和缓冲液等。
•PCR条件设定：根据要扩增的序列特点合理设定温度和时间参数。
3.3 注意事项•注意使用不同样本DNA之间相互污染的可能性，避免交叉污染。
•检查引物设计是否正确并符合预期扩增目标。
4. 实验3：凝胶电泳分析4.1 实验原理在本节中，我们将介绍凝胶电泳分析的原理和背景知识。
这包括了DNA迁移速度、凝胶类型选择和标记物设计等内容。
4.2 实验步骤•凝胶制备：根据实验需要配置适当浓度的琼脂糖凝胶。
分子生物学实验室安全操作规范
分子生物学实验室安全操作规范分子生物学实验室是进行生物大分子制备和分析常用技术、蛋白质与核酸的提取与分离、PCR技术、分子杂交与印迹技术、分子克隆技术、外源基因转移技术、蛋白质表达技术、分子标记技术、分子改造技术、测序及人工合成技术、基因组学技术、蛋白质组学技术、生物芯片技术、生物信息学技术、RNA研究技术和电泳检测等的场所，所有进入实验室的工作人员均应遵守必要的操作规范，现在就让未名雷蒙特带您来了解一下:1. 配制有毒挥发性溶液必须在通风橱内进行。
2. 使用实验室仪器设备要严格遵守操作规程，认真填写仪器设备使用记录。
使用精密贵重仪器设备，必须预约，并由专门负责的工作人员上机操作。
3. 实验室产生的工作废液及有毒有害物质，应在安全负责人的指导下妥善处理。
4. 在进行凝胶成像时，必须用保鲜膜把胶包好或用保鲜膜将胶和透照台隔开，确保不污染成像系统。
5. 实验过程中必须穿着工作服。
进行有毒、有害、有刺激性物质或有腐蚀性物质操作时，应戴好防护手套。
6. 由于实验过程中使用溴化乙锭(EB)、丙烯酰胺等有害物质，所有与此有关的操作必须带手套，在特定区域内完成，严禁将接触过此类物质的手套或其他杂物带出工作区。
7. 实验人员未经许可，不得随意动用专用实验的物品。
不得私自配制实验室各房门、抽屉、柜子钥匙，不得私自在实验室内安装其它设备。
8. 爱护仪器设备，节约实验材料，仪器设备如有损坏，要及时报告登记。
如发生意外事故，应立即采取必要措施，并及时报告实验室负责人、值班人员和报警。
9. 实验完毕后做好整理工作，关闭电源、水源、气源和门窗。
10. 工作结束后，清理使用过的台面及区域, 保持整洁。
实验室要保持安静、卫生，严禁在室内吸烟、饮食，严禁随地吐痰、大声喧哗。
分子生物学整体服务安全操作及保养规程
分子生物学整体服务安全操作及保养规程一、前言分子生物学已经成为生命科学的重要组成部分，它可以从分子水平研究生命现象。
随着生命科学技术的不断进步，分子生物学实验已经成为生物科学研究的重要工具。
为保障实验室成员的健康、安全，减少实验操作的风险，本文介绍分子生物学整体服务的操作规程及保养规程，以期营造安全、健康的实验环境。
二、操作规程2.1 实验前准备在进行分子生物学实验之前，应先对实验室进行设备、环境的检查和保养，并确保每位实验人员均已经过培训并掌握相关操作技能。
2.2 实验操作在进行实验操作时，应注意以下几点：1.实验人员应掌握操作技能，严格按照实验操作手册进行操作。
2.操作过程中应佩戴适当的个人防护装备，如手套、防护眼镜等。
3.实验液体应密闭保存，并放于防止温度波动、震动和碰撞的设备内。
4.实验完成后及时清洗设备、工具，并将废液、废料正确处理。
2.3 废弃物处理废弃物应按照实验室废弃物管理规定进行处理，确保其不会对环境和人员造成伤害。
2.4 突发事件处理发生突发事件时，应立刻采取应急措施，并及时上报实验室主管或安全负责人，以确保实验室人员的人身安全和实验室设备的完好。
三、保养规程3.1 器材维护为确保分子生物学实验的结果准确可靠，必须保证分子生物学实验室的器材处于良好状态，操作正确、精度稳定。
器材应定期检查和维护，加强日常保养。
3.2 实验环境维护分子生物学实验室的环境对实验结果有很大的影响。
因此，实验环境应定期维护，包括对温度、湿度、洁净度等方面的检查，以确保实验室环境符合要求。
3.3 实验室消毒在实验室中，消毒工作也非常重要。
实验室中的工作区域、器具和仪器每次使用后都应进行消毒处理，包括实验台面、温度恒定仪、离心机等设备。
四、总结分子生物学实验是现代生命科学研究的重要手段，但也是一项高风险实验。
为了保障实验室人员的人身安全和保护实验室设备的完好，每位实验室人员应掌握相关操作技能、严格遵守实验规程，并加强实验室的保养与管理。
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实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项一、酶与载体的分装酶类与载体：T载体(50 ng/μl)用灭菌水稀释4倍（12.5 ng/μl）后分装成10 μl或20 μl；连接酶（solutionΙ）按5 μl分装；dNTP（10 mM）分装成50 μl；无菌水分装成1 ml；注意：（1）所有分装都必须用已灭菌的管。
（2）所有工具酶和载体的使用过程均在冰浴中进行。
（3）工具酶、载体以及试剂盒等实验室共用物品，用完后必须及时放回原处，以免耽误他人使用。
（4）当你发现你使用的是最后一管（盒）公用物品时，请马上告知负责人购买，以免耽误使用。
（5）感受态，氨苄青霉素和IPTG由研究生轮流负责制备。
每人负责六个月。
其他试剂则由第一位使用新包装的同学分装。
由于分子实验工具酶比较容易失活，必须在冰上进行分装。
二、常见抗生素及IPTG的配置以氨苄青霉素为例：1．准备足够量的1.5 ml的EP管、两个100 ml的离心管、0.22 μm水系滤器、注射器、蒸馏水，以上用品均要进行高压灭菌。
2. 洁净工作台紫外灭菌，然后进行以下操作。
3．称取2 g的氨苄青霉素粉末于离心管中，加入灭菌水至总体积为20 ml，轻摇离心管，至氨苄青霉素粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。
4．用注射器吸取配制好的溶液，然后把滤器安在注射器上，缓缓推动注射器活塞，把溶液经滤膜推至100 ml的离心管中。
注意：动作要缓和，使滤出液出口正对着离心管，还要防止染菌。
5．把100 ml离心管中已除菌的氨苄青霉素溶液分装到1.5 ml的EP管中，每管0.5 ml。
在EP管上做好标记，包括名称、浓度、日期等。
6．把做好标记的盛有氨苄青霉素的EP管于-20℃保存。
注意：当你发现你使用的是最后一管抗生素时，请马上告知有关人员及时配制，以免耽误使用。
表1.常见抗生素的储存浓度及工作浓度名称储存浓度工作浓度氨苄青霉素（ampicillin）100 mg/ml 50 μg/ml～100 μg/ml卡那霉素（kanamycin）10 mg/ml 10 μg/ml～50 μg/ml氯霉素（chloramphenicol）25 mg/ml 12.5 μg/ml～25 μg/ml链霉素（streptomycin）50 mg/ml 10 μg/ml～50 μg/ml四环素（tetracyyline）10 mg/ml10 μg/ml～50 μg/mlIPTG 1 M 0.05-0.6 mM三、分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制参见《分子克隆》。
四、总DNA的提取具体步骤参考试剂盒说明书。
注意：革兰氏阳性菌DNA提取时需要加溶菌酶。
五、基因扩增1．引物与合成：设计引物序列，发至生工公司进行合成（jinan@）。
2．引物配制：合成后的引物先离心至管底，然后按说明书用无菌水稀释至10-50μM，分装至无菌EP管中，做好标记（一定要标记浓度！）后，于-20度保存备用。
3． PCR反应体系配制：将所需各组分在冰浴中化开后，进行PCR反应体系配制。
反应体系及反应参数按不同聚合酶的说明书进行，以transgen 的easyTaq酶扩增1kb基因序列为例，100 μl反应体系为：10×buffer 10 µl，dNTP (10 mM) 2 µl,引物各2 µl （10-50μM），模板1 µl（根据浓度O 82 µl（注意：加入顺序为：水，buffer，加减体积），Taq酶1 µl，ddH2dNTP，引物，模板，酶）。
涡旋混匀，分装至四-五管，瞬时离心。
注意：若反应时间较长在反应混合液的上层加10-20 µl 的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发。
4．将管放入PCR仪中，在PCR仪上设置好PCR反应参数，例如：94 ℃ 5 min，94 ℃ 40 sec，Tm 55℃ 1 min， 72 ℃ 2 min，72 ℃ 10 min，16 ℃ 1 h,一般设30个循环。
待温度降至16 ℃后停止PCR仪，尽快取出样品，不允许过夜。
六、琼脂糖核酸电泳1. 电泳缓冲液的配制：电泳缓冲液一般为TAE（或TBE）,其配制方法参见表2，先配制50×母液放于4度冰箱中，电泳时稀释100倍使用。
2. 将制胶模具和梳子冲洗干净，架好梳子；3. 根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶（表3）：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液；4．放入到微波炉内加热至胶粒全部熔化(一般沸三次即好),冷却片刻，倒入制胶模具中，待其凝固；a)室温下30-45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；b)向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1 mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；c)在DNA样品中加入1/5-1/10体积的上样缓冲液（1% SDS, 50%甘油,0.05%溴酚蓝），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；5．接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)。
根据胶的长度设定电压，一般5-8 V/cm，电泳20-40 min, 溴酚蓝跑完胶板的3/4左右即可；6．电泳完毕，关上电源，戴上手套，将胶放入0.5 μg/ml的溴化乙锭(EB)溶液中，室温下染色5-10 min。
7．蒸馏水中漂洗一下，置于紫外灯下或凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。
如果要切胶回收，最好在观察台上铺上塑料片观察，防止污染以及紫外灯引起DNA突变。
注意：溴化乙锭（EB）有剧毒，操作时应注意安全，戴手套操作。
但是要避免污染染色池和切胶板以外的区域。
操作完后手套和胶分别放入垃圾桶和回收桶。
表2. 电泳缓冲液TAE配方电泳缓冲液配方表3.琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围琼脂糖凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围（bp）0.5% 1,000～30,0000.7% 800～12,0001.0% 500～10,0001.2% 400～7,0001.5% 200～3,0002.0% 50～2,000七、回收与连接1.将切下的目的条带按照回收试剂盒说明书进行产物回收；2.连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。
稀释好的T 载体浓度为12.5 ng/μl，不用再确定浓度，每次用量为1 μl。
3.连接反应体系的配制（1）用Solution I连接时，取一只分装的Solution I离心管（含5 μl Solution I），加入待连接的两个DNA样品：载体与片段（载体与片段的mol比为1：3-5），加水补足10 μl。
（2）用T4连接酶5 μl连接时，取一只灭菌PCR管，加入10×连接buffer 1 μl，待连接的两个DNA样品：载体与片段（载体与片段的mol比为1：3-5），T4连接酶1 μl，加水补足10 μl。
（3）连接至T载体时反应体系一般为：回收的PCR产物 4 μl, solution I5 μl， 4倍稀释的pMD-18T克隆载体(12.5 ng/μl）1 μl。
注意：加入顺序为：水，buffer，DNA样品，酶4.混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。
5.将离心管置于16 ℃孵育4 h以上或过夜。
八、E. coli DH5α和Bl21感受态细胞的制备采用 CaCl制备法制备E. coli DH5α感受态细胞，步骤如下：21．准备实验：（1）准备LB固体培养基和分装于试管（2-5 ml）和三角瓶（100。
ml）的液体培养基。
（2）分别配制含15%甘油的和不含甘油的0.1 M CaCl2（3）准备干净培养皿、非常干净的100 ml离心管2只，1.5 ml EP管50只，1ml和200μl枪尖各一盒。
（4）将以上培养基和物品高压灭菌。
2．在LB平板上活化E.col i DH5α。
将活化的E.col i DH5α单菌落接种于成含LB培养基的试管中，37 ℃摇床过夜培养。
3．第二天按1%接种量接种到含100 ml LB培养基的三角瓶中，37 ℃摇床培养至OD=0.4-0.6 （约2 h）。
6004．冰浴10 min，倒入灭过菌的100 ml离心管中离心，4000 rpm，10 min，4 ℃。
5．去掉上清，加20 ml配制好的已灭菌的0.1 M CaCl2，将菌体打散后静置20 min，4000 rpm离心10 min，去掉上清。
6．加1-2 ml 灭菌的0.1 M CaCl2 (含15%甘油)制成感受态细胞。
将制好的感受态细胞分装成50 μl 小份保存于-80 ℃冰箱。
7．E. coli Bl21和BL21(DE3)的制备方法同上。
注意：（1）所有操作均在冰上进行；（2）整个制备过程必须保证无菌操作；（3）E.coli Bl21，BL21(DE3)，DH5α菌种每学期更换一次。
九、转化1.取50 μl感受态细胞于冰浴上融化。
2.加入10 μl连接产物或3-5 μl纯质粒，轻轻吹打混匀，冰浴20 min。
3.放入42 ℃水浴中热激90秒，立即放入冰浴中2-10 min。
4.加入0.5 ml不含抗生素的LB 液体培养基，于37 ℃培养1 h。
5.将培养物4000 rpm离心3 min，保留约200 μl上清于管中，将菌体用无菌枪尖轻轻打散，均匀涂布于含100 μg/ml Amp+的平板表面，平板于37 ℃先正置1-2 h，后倒置培养12-16 h至菌落出现。
十、重组子的筛选和鉴定从转化平板上挑取白色菌落，转接至含抗生素Amp+（100 μg/ml）的LB液体培养基，37 ℃振荡培养过夜。
菌液可以用以下三种方法验证是否是阳性转化子。
注意：同时培养阴性菌落作为对照！（一）酚抽验证取1 ml菌液12,000 rpm 离心1 min收集菌体，尽量倒干净上清后加入50 μl Tris 饱和酚和50 μl 水，漩涡震荡5 min充分混匀。
12,000 rpm离心10 min后迅速取上清进行琼脂糖凝胶电泳。
（二）质粒酶切验证1.按照质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取，用未插入片段的质粒作为阴性对照，进行琼脂糖凝胶电泳。
电泳后可根据质粒的大小初步判断质粒中是否有插入片段，并推测质粒的浓度。
2.利用引物中设计的酶切位点或质粒上的酶切位点，对质粒进行酶切。
根据待切质粒的浓度确定要加的体积, 选择合适的限制性内切酶和配套Buffer。
3.在离心管中加入如下成分：10×Buffer 2 μl待切样品 x μl（一般为5μl左右）酶 1 μl10U/u l加灭菌水补足20 μl酶的多少并不是一成不变的，关键要看待切DNA的浓度，如果浓度较低，可以适当少加酶。