碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对热变性大豆分离蛋白的酶解研究

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S9碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白优化条件研究_张鸿雁

研究报告
中国酿造
2010 年第 7 期
总第 220 期 ·51·
将经过预处理的大豆蛋白调节温度至反应温度，搅拌15min，调节pH值至反应pH值，加入一定比例S9碱性蛋白酶，在反应温度进行恒温酶解，酶解过程中要不断搅拌，同时滴加 0.5mol/L 的 NaOH 溶液以保持反应体系 pH 值恒定。达到反应预定时间后，记录NaOH溶液的滴加量，计算水解度（DH）。 1.5 水解条件的初步确定（单因素试验）
本研究是利用从盐碱土中筛选嗜碱细菌所产生的碱性蛋白酶[3-4]，通过单因素试验和正交试验设计得到酶水解
的最优条件及优化的水解工艺，利用此工艺于实验室小批量试验，期待能解决一些实际问题。 1 材料与方法 1.1 试验材料
大豆分离蛋白：天圜（新加坡）营养集团有限公司大庆日月星有限公司生产，测得蛋白质含量为90.01%，水分含量 5.20% ，灰分含量 5.1% ；碱性蛋白酶：黑龙江八一农垦大学生命学院微生物实验室，酶活力 17600U；其他试剂均为AR级。 1.2 测定方法
℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃℃
Biomed Eng, 1986, 33(11): 993-999. [9] GRUNDLER W, KEILMANN F. Nonthermal effects of millimeter mi-
图3 酶用量对水解效果的影响 Figure 3. Effect of enzyme concentration on hydrolysis with S9
alcalase

双酶复合法提取大豆蛋白的工艺研究

西安科技大学硕士学位论文双酶复合法提取大豆蛋白的工艺研究姓名：***申请学位级别：硕士专业：应用化学指导教师：***2011论文题目：双酶复合法提取大豆蛋白的工艺研究专业：应用化学硕士生：陈敏(签名) 指导教师：蔡会武(签名)摘要本文以低温脱脂豆粕粉为初始原料，通过选酶实验，筛选出两种使豆粕水解度大的酶进行复合水解，通过单因素试验和正交试验，确定酶解的最佳工艺条件，后选出样品进行分析，确定酶解以后分子量的变化趋势以及官能团特征，并分析了酶解后产品的氨基酸种类及含量，得出以下结论：1. 以蛋白含量和水解度作为酶解实验的评价指标，选择高效蛋白酶和胰蛋白酶进行复合水解。

通过内切酶和外切酶的复合作用，既提高了产物的蛋白含量和水解度，又减轻了产品的苦味，有利于产品在食品工业中的应用。

2. 通过单因素和正交试验，确定大豆豆粕酶解的最佳工艺条件为：加水量600mL，pH7.5，酶解时间8h，加酶间隔时间3h。

反应温度48℃。

3. 通过红外光谱检测酶解以后产品，在产品的IR图谱中，波数在3648cm-1处，是羟基伸缩振动，波数在2931cm-1处，是-NH2中的N-H伸缩振动，1658 cm-1处，是酰胺基团中的C=O伸缩振动所引起，是肽键存在的典型特征。

4. 通过SDS（十二烷基硫酸钠）-PAGE（聚丙烯酰胺）电泳实验分析，得到动态的大豆蛋白的酶水解趋势，将豆粕粉和酶解后的产物进行电泳实验，得出结论：豆粕粉在大分子量处谱带较多，大分子量的蛋白含量较高，而酶解以后，除在29.2KDa处有一条谱带以外，在10000Da的以下的蛋白占绝大份额，说明酶解以后的蛋白分子量很小，大多数是以多肽以及氨基酸的形式存在。

5．通过氨基酸分析，得出各种氨基酸含量，和大豆分离蛋白的氨基酸组成进行比较，得出结论：酶解后产品和大豆分离蛋白的氨基酸组成基本相同，含量略高，氨基酸的组成更加合理，而且具有大豆蛋白所不具有的特性，易于吸收，更适合添加到各种营养食品中。

大豆蛋白改性酶解制备大豆肽的研究

了大豆蛋白质的利用。近年来，通过酶法水解大豆蛋白得到大豆肽已经得到了科学界的重视。大豆肽分子量小、溶解度高、黏度低、在体内消化吸收快、抗原性低，而且具有抗疲劳、抗氧化、降血压、降低胆固醇、提高免疫力、抗肿瘤以及控制肥胖等多种生理功能，使其应用范围大大扩大，提高了大豆产品的附加值。
水解条件：底物浓度 20g ／ L，酶和底物比 8 000U ／ g，温度 50℃， pH 值 7．5。以水解度为指标研究 2、 3、 4、 5、 6h 的水解时间对水解的影响，结果如图 3 所示。
图 4 pH 值对水解度的影响所示。
由图 4 可知：在 pH 值小于 7．5 时，水解度随 pH 值的升高显著提高；在 pH 值大于 7．5 时，水解度随 pH 值增加逐渐降低；在 pH 值为 7．5 时，水解度达到最大。这是因为大豆分离蛋白的等电点为酸性，在中性偏酸性条件下，溶解度会进一步降低，水解度受到酶催化活性和底物溶解性的双重影响而变化较大；在偏碱性条件下，水解度只受到酶催化活性的影响。因此，本试验条件下，大豆蛋白改性酶水解大豆分离蛋白的最适 pH 值为 7．5。 2．1．5 水解温度对水解的影响
大豆分离蛋白→调浆→酶解→灭酶→酸沉离心分离→ 上清液冷冻干燥
准确称量大豆分离蛋白加蒸馏水搅拌均匀，加入一定量的大豆蛋白改性酶，在一定的温度和 pH 值条件下水解，到达时间后， 90℃灭酶 10min，冷却至室温后加入 1mol ／ L HCl 调 pH 值 4．2 沉淀未水解蛋白， 8 000r ／
1 材料与方法
1．1 材料与试剂大豆分离蛋白，吉林省通榆蛋白质厂；大豆蛋白

木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白研究

维普资讯
第２１卷第３期
２０拄０２
大
豆科
学
Ｖｏ．ＺＮｏ．１１３Ａｕ．ｇ２２００
８月
ＳＯＹＢＥＡＮＳＣＩＥＮＣＥ
木瓜蛋白酶水解大豆分离蛋白研究。
吴建中赵谋明宁正祥姚玉静
讨了半胱胺酸、硫酸钠、Ｖｃ钠等添加剂对木瓜亚异
经凯氏定氮法测定，品蛋白质含量为８．。样７９
２２酶活测定．
依据Ｑ／ＨＮＯ —９１４标准，定酶活为５测Ｏ万单
位／。克２３不同加酶量条件下反应时间与水解度（．ＤＨ）
１２２大豆分离蛋白中蛋白质含量测定：氏定氮．．凯
法
１２３ＤＨ值测定方法：Ｈ— ｓａ法．．ｐｔｔ
ＤＨ－ × ｌｏ０
水解的进行，作用底物减少。（）解过程中酶受可２水
热失活。（）瓜蛋白酶的自水解作用。（）３木４木瓜蛋
豆
科
学
３期
白酶受重金属离子影响失活或被氧化失活。然而作
豆蛋白浓度为４５～８、胱氨酸浓度０２。．半．５
关键词大豆分离蛋白；瓜蛋白酶；解木水
中图分类号
￥６．５５１
文献标识码
Ａ

碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白及其抗氧化活性的研究

碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白及其抗氧化活性的研究王鑫1，江连洲1，2，吴瑕1，田瑞红1收稿日期：2010－11－10作者简介：王鑫（1983—），男，硕士研究生，研究方向为粮油及植物蛋白质，E-mail ：wangxin830315@ 通讯作者：江连洲基金项目：国家高技术研究发展计划863项目（2006AA10Z322）原文出处：《东北农业大学学报》，2011Vol.42No.11（1.东北农业大学食品学院，哈尔滨150030； 2.国家大豆工程技术研究中心，哈尔滨150050）摘要：将Plackett －Burman 因素水平设计应用于碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白，以研究大豆分离蛋白酶水解物的抗氧化活性。

通过测定水解产物的亚铁还原能力来确定其抗氧化活性的强弱，以此确定最佳水解工艺条件为：反应温度72ħ，底物浓度9%，酶用量（E /S ）1%，pH 7.0，水解时间5h 。

采用最适水解工艺条件得到水解度为19.78%，制备的水解物亚铁还原能力为：987.13μmol /L 。

同时测定水解物抑制脂质过氧化的能力（TBAＲS 法）以及对DPPH （二苯代苦味肼基）自由基的清除能力。

研究表明，水解物具有较高的抗氧化活性，可以有效抑制脂质过氧化以及较好的清除DPPH 自由基，其抗氧化活性虽然低于化学合成抗氧化剂，但明显高于未水解的蛋白质。

关键词：大豆分离蛋白；碱性蛋白酶；抗氧化活性；酶水解物中图分类号：S565.1文献标志码：A文章编号：1005－9369（2011）11－0024－08Study on alkaline protease hydrolysis of soy protein isolate and its antioxidant activityWang Xin 1，Jiang Lianzhou 1，2，Wu Xia 1，Tian Ｒuihong 1（1.Food Science College of Northeast Agricultural University ，Harbin 150030，China ；2.The National Ｒesearch Center of Soybean Engineering and Technology ，Harbin 150030，China ）Abstract ：The factorial level design of Plackett-Burman was used to study soybean peptides obtained throughhydrolyzing soybean isolated proteins by Alcalase ，and then the antioxidant activities of soy isolate protein hydrolyzate was studied．The antioxidant activity of hydrolysate was detected by measuring its ferrous iron ＇s reducing capacity ，and the optimal hydrolysis conditions were as followings ：reaction temperature of 72ħ，substrate concentration of 9%，enzyme concentration of （E /S ）1%，pH 7.0，hydrolysis time 5h．The hydrolysis degree obtained under the optimum hydrolysis conditions was 19.78%，and the reducing capacity of ferrous iron in prepared hydrolysate was 987.13μmol /L．The study also detected the activity of hydrolyzate in terms of inhibiting overoxidation of lipid peroxidation （TBAＲS ），and eliminated the DPPH free radical．The study showed that hydrolysate had a higher antioxidant activity which could inhibit overoxidation of lipid peroxidation and eliminate the DPPH free radical．Although the antioxidant capacity of hydrolysate was lower than that of chemical synthesized antioxidant ，apparently higher than that of unhydrolyzed proteins．Key words ：soy protein isolate ；alkaline protease ；antioxidant activity ；hydrolysate product 脂质过氧化是诱发衰老的主要原因之一。

大豆分离蛋白酶解产物功能特性的研究

明：豆分离蛋白酶解产物比大豆分离蛋白的溶解性、乳大
资源丰富、成本低而倍受青睐，更为重要的是大豆蛋白还具有与食品的嗜好性、加工性等相关的
各种功能特性，包括乳化性、起泡性、保水性、凝胶性等多种功能特性。因此大豆蛋白被广泛应
加工技柬 ■
中图分类号：５６．Ｑ５￣９文献标志码：Ｂ
文章编号：６４３４（００ — ０２０１７ — ５７２１）３０２ — ７１
产大豆分离蛋白酶解物功能特性的研究水
陈靓，朱秀清，窦巍巍，夏明敬，王玲
决的问题。
ｄｏｙｉｍｅＴｅｒｓｌｈｗｅａｅｓｌｂｌｙｅｌｉｉｇｒｌｓｓｔ．ｈｅｕｔｓｏｄｔｔｈｏｕｉｔ，ｍｕｓｆｎ，ｉｓｈｔｉｙ
ｆａｎｇａｏｌｂｓｒｉｎａａｉｙｏｏｂａｐｏｅｎｓｌｔｏｍｉｎｄｉａｏｐｔｏｃｐｃｔｆｓｙｅｎｒｔｉｉｏａｅ
ｏｏｂａｒｔｉｓｌｔｙｒｌｓｔｓｂａａｎｗｒｅｔｒｆｓｙｅｎｐｏｅｎｉｏａｅｈｄｏｙａｅｙＰｐｉｅｅｂｔｅｔａｏｂａｒｔｉｏａｅｈｄｏｙａｅｙＡｌａａｅｈｎｓｙｅｎｐｏｅｎｉｌｔｙｒｌｓｔｓｂｅｌｓ．ｓＫｅｗｏｄ：Ｓｙｅｎｉｏａｅｒｔｉ；Ｅｚｍａｉｙｒｌｓｓｙｒｓｏｂａｓｌｔｄｐｏｅｎｎｙｔｈｄｏｙｉ；ｃ

木瓜蛋白酶与中性蛋白酶水解大豆分离蛋白的研究

木瓜蛋白酶与中性蛋白酶水解大豆分离蛋白的研究钟振声，陈钰，文锡莲（华南理工大学化学与化工学院，广东广州 510640）摘要：研究了大豆分离蛋白经过加热预处理后用木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解的可行性。

以水解度(DH)为指标，考察了单因素水解条件得出：木瓜蛋白酶水解反应的最佳条件为反应底物浓度3.0%，pH 7.0，反应温度55 ℃，酶用量30 μg/g；中性蛋白酶水解反应的最佳条件为反应底物浓度5.0%，pH 7.0，反应温度55 ℃, 酶用量40 μg/g。

在此条件下，大豆分离蛋白水解度分别为3.69%和9.80%。

在一定条件下复合酶分步水解优于单一酶水解。

关键词：木瓜蛋白酶；中性蛋白酶；大豆分离蛋白；水解反应；水解度中图分类号：Q814；文献标识码：A；文章篇号:1673-9078(2009)09-1039-05Hydrolysis of Soybean Protein Isolate by Papain and NeutralProteaseZHONG Zhen-sheng, CHEN Yu, WEN Xi-lian(School of Chemistry and Chemi cal Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China) Abstract: The feasibility of hydrolysis of heat-treated soybean protein isolate (SPI) by papain and neutral protease was studied. Single factor experiment showed that the optimum conditions for papain catalyzed hydrolysis of SPI were as follows: papain dosage 30 μg/g, mass concentration of substrate 3.0%, hydrolysis temperature 55 ℃ and pH 7.0. For neutral protease catalyzed hydrolysis of SPI, the best conditions were neutral protease dosage 40μg/g, mass concentration of substrate 5.0%, hydrolysis temperature 55 ℃, and pH 7.0. Under the above-mentioned two kinds of conditions the hydrolysis degree of protein reached 3.69% and 9.80%, respectively. It was also found that hydrolysis by mixed enzymes was more efficient than that by single enzyme.Key words: papain; neutral protease; soybean protein isolate; hydrolysis reaction; hydrolysis degree大豆分离蛋白的蛋白质含量高达85%-90%，含有丰富的赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸和色氨酸等八种人体必需的氨基酸[1]，应用前景十分广阔。

大豆多肽

大豆肽的①定义、②结构、③特性、④功能、⑤应用、⑥现状、⑦前景、⑧生产工艺技术、⑧代表厂家及产品1引言大豆多肽(soy peptide),即“肽基大豆蛋白水解物”（即peptide-based soy protein hydrolysate的简称）,较之相同组成氨基酸和母体蛋白（parent protein），肽具有无蛋白质变性、无豆腥味、无残渣、易溶于水，在酸性条件下不沉淀、溶液黏度小、受热不凝固等独特的理化性能与生物活性。

近年来，国际科学界研究发现，蛋白质经消化道酶促水解后主要是以小肽类的形式被吸收，且比完全游离氨基酸更易、更快被机体吸收、利用，某些小肽不仅能提供人体生长、发育所需要的营养物质，而且具有独特的生物学功能：可防治血栓、高血压和高血脂，延缓衰老、抵抗疲劳、提高机体免疫力。

有些小肽具有原食品蛋白质或其组成氨基酸所没有的重要的生理功能，这正是生物活性肽引起当今科学界、医学界、营养学界、食品学界广泛重视的主要原因。

生物活性肽具有极强的活性和多样性，随着研究的不断深入，这一领域在世界范围内日益受到关注。

生物活性肽已成为高科技领域及产业的新热点。

由于人体吸收蛋白质主要是以肽的形式吸收的，不是以氨基酸的形式吸收的，同时肽在人体合成蛋白质率较氨基酸高26%，氨基酸只有20种，功能固定，屈指可数，而以氨基酸为基料合成的多肽，则有上百种上千种，其功能具有多样性。

现代生活，人们从食物中吸收的蛋白质、氨基酸已不缺乏，但人体中的肽却很缺少。

因现代文明而给人带来的“负面影响”是人体缺肽的主要原因。

因为肽的缺乏，使现代人出现了“现代病”、“富贵病”、“亚健康”。

人体必需从体外合成的肽中获取肽，以保证人体的健康。

由于组成每种蛋白质的氨基酸数量和连接顺序不同，形成了自然界数十万种不同的蛋白质。

大豆蛋白分子一般都很大，由数万个甚至数十万个氨基酸连接而成。

这么大的分子人体是不能直接吸收的。

因此，普通的豆制品只是给人体提供营养元素和能量，并不直接参与和调节人体的生理活动。

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碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对热变性大豆分离蛋白的酶解研究李婷;赵沙沙;阮奇珺;孔祥珍;华欲飞【摘要】The heat-denaturized soy protein isolate was hydrolyzed by Alcalase and Papain respectively, and the effects of enzymolysis temperatures of two kinds of proteases on the enzymolysis result of soy pro-tein isolate were investigated. The results showed that the enzymolysis of soy protein isolate with Alcalase at 60℃ was deeper than that at 70℃, more low relative molecular weight peptides were obtained and the degree of hydrolysis of soy protein isolate was 14.73%;while temperature had little effect on the hydroly-sis of soy protein isolate with Papain;more small peptides could be obtained by the hydrolysis of soy pro-tein isolate with Alcalase than that with Papain.%采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对热变性大豆分离蛋白进行酶解，研究两种蛋白酶酶解温度对大豆分离蛋白酶解效果的影响。

结果表明：碱性蛋白酶在60℃时比在70℃时对大豆分离蛋白的酶解更彻底，得到的相对分子质量小的肽段更多，大豆分离蛋白的水解度较高(14.73%)；酶解温度对木瓜蛋白酶酶解大豆分离蛋白的效果影响不明显；与木瓜蛋白酶相比，碱性蛋白酶酶解大豆分离蛋白可以得到更多的小分子肽段。

【期刊名称】《中国油脂》【年(卷),期】2014(000)004【总页数】4页(P35-37,38)【关键词】大豆分离蛋白;木瓜蛋白酶;碱性蛋白酶;酶解【作者】李婷;赵沙沙;阮奇珺;孔祥珍;华欲飞【作者单位】江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122;江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122;江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122;江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122;江南大学食品学院，食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122【正文语种】中文【中图分类】TQ936.2;Q51大豆蛋白分子结构复杂，相对分子质量较大，不利于生物体的消化和吸收。

而蛋白质的酶解是改善蛋白质特性的一种有效方法，大豆蛋白经酶解后利于消化和吸收，营养价值提高，且酶解生成的多肽具有多种生物功能[1-3]。

天然大豆蛋白分子结构紧密，大量酶切位点埋藏于蛋白质分子内部，很难被蛋白酶酶解，必须对大豆蛋白进行变性处理，才能使酶切位点大大增加。

常用的变性方法是热处理，其特点是经济方便、变性彻底、不易回复[4]。

课题组前期研究发现，通过控制酶解条件，特定的蛋白酶能选择性地酶解某些蛋白，如胃蛋白酶能选择性地酶解大豆11S蛋白。

在前期研究基础上，本研究进一步考察了碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、酶解温度对大豆分离蛋白酶解物的影响。

研究结果可为碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解过程条件的控制和不同酶解物的获取提供一定的理论依据。

1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 原料与试剂全脂豆粕:山东万德福有限公司；木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶:诺维信生物技术有限公司；Marker标准蛋白：上海生工生物工程有限公司；三硝基苯磺酸(TNBS)、二硫代二硝基苯甲酸(DTNB):Sigma公司；乙腈:色谱纯；其他试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备LGJ-10冷冻干燥机，高速冷冻离心机， ECP3000三恒电泳仪，Waters600高效液相色谱仪，FA1004型分析天平，85-2型恒温磁力搅拌器，868型pH计。

1.2 实验方法1.2.1 大豆分离蛋白(SPI)的制备先用95%乙醇浸洗全脂豆粕，以去除多糖、异黄酮等杂质，得醇洗豆粕。

在醇洗豆粕中按1∶15的料液比加入去离子水充分溶解，用2 mol/L的NaOH溶液调节pH至7.0，室温下低速搅拌1 h，以10 000 r/min 在4℃离心30 min，弃去沉淀。

上清液用2 mol/L的HCl溶液调节pH至 4.5，以10 000 r/min 在4℃离心30 min，弃去上清液，得到的蛋白质凝乳经水洗后，加入去离子水并用2 mol/L 的NaOH溶液调节pH至7.0，经搅拌充分溶解后，在4℃以10 000 r/min离心30 min，弃去少量不溶物质，上清液经透析(采用截留相对分子质量为8 000 Da 的透析袋)24 h除盐后冷冻干燥，得到大豆分离蛋白，在4℃条件下保存备用。

1.2.2 蛋白酶酶解大豆分离蛋白取6 g大豆分离蛋白分散于120 g水中，沸水浴加热10 min，冷却，调节pH(碱性蛋白酶pH 8.0，木瓜蛋白酶pH 7.0)，在一定的酶解温度下搅拌预热10 min，加入1%蛋白酶，酶解30 min，酶解过程中保持pH恒定。

控制酶解温度分别为60、70℃。

酶解完成后，碱性蛋白酶采用PMSF灭酶活，木瓜蛋白酶采用加热灭酶活，然后调节pH为中性。

取部分酶解液样品冻干，剩下的酶解液样品调节pH 至4.8终止反应，以10 000 r/min 在4℃离心10 min，分别调节上清液与沉淀pH至7.0，收集上清液和沉淀，冷冻干燥分别获得酸可溶酶解物和酸不溶酶解物，分别在4℃条件下保存备用。

1.2.3 水解度的测定水解度的测定采用pH-stat法[5-6]。

1.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)大豆分离蛋白及其酶解物的电泳采用SDS-PAGE，根据Laemmli[7]的方法在DYCZ-24B型垂直电泳槽制胶。

分离胶、浓缩胶的浓度分别为12.5%和4%。

1.2.5 酶解物相对分子质量分布的测定采用分子排阻色谱法(SE-HPLC)测定大豆分离蛋白酶解物的相对分子质量分布。

色谱条件：TSKgel 2000SWXL(300 mm×7.8 mm)色谱柱，流动相为乙腈-水-三氟乙酸溶液(体积比45∶55∶0.1)，紫外检测波长220 nm，流速0.5 mL/min，柱温30℃。

相对分子质量校正曲线所用标准品：细胞色素C(12 500 Da)、抑菌肽(6 500 Da)、杆菌肽(1 450 Da)、Gly-Gly-Arg-Tyr(451 Da)、Gly-Gly-Gly(189 Da)。

2 结果与讨论2.1 碱性蛋白酶酶解大豆分离蛋白采用碱性蛋白酶分别在60℃和70℃条件下对经加热煮沸变性处理的大豆分离蛋白酶解30 min，所得大豆分离蛋白的水解度测定结果见表1，大豆分离蛋白及碱性蛋白酶酶解物的SDS-PAGE图谱见图1，碱性蛋白酶酶解物的相对分子质量分布测定结果见表2。

表1 大豆分离蛋白的水解度酶解温度/℃水解度/% 6014.73 70 9.79由表1可知，相同酶解时间下60℃的大豆分离蛋白水解度比70℃时的大，这可能是由于60℃是碱性蛋白酶的最适酶解温度。

与庞美蓉[8]研究得到的酶解未加热变性的大豆分离蛋白的水解度(60℃时为9.012%，70℃时为4.901%)相比，本研究所得大豆分离蛋白水解度明显增大。

这可能是因为加热煮沸处理使得大豆分离蛋白的空间结构遭到破坏，发生去折叠，从而暴露了更多的酶切位点，使得水解度增大。

注：1.Marker；2.SPI；3.60℃总酶解物；4.60℃酸可溶酶解物；5.60℃酸不溶酶解物；6.70℃总酶解物；7.70℃酸可溶酶解物；8.70℃酸不溶酶解物。

下同。

图1 大豆分离蛋白及碱性蛋白酶酶解物的SDS-PAGE图谱由图1可知，碱性蛋白酶在60、70℃下进行酶解时，大豆分离蛋白的7S亚基(α，α′，β)以及11S亚基(A肽链及B肽链)均被酶解完全。

酶解温度为60℃时大豆分离蛋白酶解物的相对分子质量主要分布在30 kDa以下。

而酶解温度为70℃时大豆分离蛋白酶解物的相对分子质量主要分布在40 kDa以下。

同时，酶解过程中产生了大量相对分子质量小于40 kDa的肽段。

表2 碱性蛋白酶酶解物的相对分子质量分布 %样品>10 000 Da5 000～10 000 Da1 000～5 000 Da500～1 000 Da<500 Da60℃酸可溶酶解物0.192.0125.2731.0438.9660℃酸不溶酶解物3.4616.6343.1216.5620.2460℃总酶解物2.5410.0826.0827.2334.0870℃酸可溶酶解物1.1916.2232.6228.9325.0470℃酸不溶酶解物11.16 19.2735.8815.6218.0670℃总酶解物5.1810.8339.1623.0521.78由表2可知，碱性蛋白酶在60、70℃下酶解30 min 后，大豆分离蛋白酶解物中的肽段主要分布在5 000 Da以下，70℃时所得酶解物中肽段的相对分子质量高于60℃时的，这与SDS-PAGE结果符合。

但值得注意的是，由于酶解物中肽段的相对分子质量较小，致使SE-HPLC与SDS-PAGE结果不尽相同(相对分子质量较小的肽段跑出SDS-PAGE图谱边界，而SE-HPLC对大分子和小分子肽段均有保留)。

原因可能主要是由于相对分子质量较小(5 000 Da以下)的肽段未能在SDS-PAGE图谱上很好地固定显色，而这部分肽段在酶解物中的比例很大，为80%～90%。

2.2 木瓜蛋白酶酶解大豆分离蛋白采用木瓜蛋白酶分别在60℃和70℃条件下对经加热煮沸变性处理的大豆分离蛋白酶解30 min，所得大豆分离蛋白的水解度测定结果见表3，大豆分离蛋白及木瓜蛋白酶酶解物的SDS-PAGE图谱见图2，木瓜蛋白酶酶解物的相对分子质量分布测定结果见表4。

表3 大豆分离蛋白的水解度酶解温度/℃水解度/% 6010.12 70 9.63图2 大豆分离蛋白及木瓜蛋白酶酶解物的SDS-PAGE图谱表4 木瓜蛋白酶酶解物的相对分子质量分布 %样品>10 000 Da5 000～10 000 Da1 000～5 000 Da500～1 000 Da<500 Da60℃酸可溶酶解物3.786.1737.7628.5823.7060℃酸不溶酶解物10.3126.2941.6411.879.8960℃总酶解物10.4920.7937.9217.9412.8670℃酸可溶酶解物3.306.5138.8829.3321.9970℃酸不溶酶解物9.6124.8144.5612.418.6170℃总酶解物10.8621.3738.7815.0014.93由表3可知，相同酶解时间下60℃的大豆分离蛋白水解度与70℃的相差不大。