木瓜蛋白酶的固定化
木瓜蛋白酶
木瓜蛋白酶的固定方法摘要：木瓜蛋白酶[ EC 3. 4. 22. 2 ]是一种重要的生化产品，在食品、医药工业中有广泛的用途, 还用于饲料、纺织及制革等领域[ 1 ]。
由于木瓜蛋白酶价格昂贵并且无法重复利用,促使人们研究和制备固定化木瓜蛋白酶。
此研究始于20世纪60年代初, 至今已有许多文献报道[ 2 ] 。
酶的固定化方法主要有：包埋法、吸附法、共价键结合法、交联法等,这些方法各有利弊[ 3 ]。
木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。
是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。
它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。
溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。
最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
一、木瓜蛋白酶的固定方法1包埋法固定包埋法:将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中,使酶固定化的方法称为包埋法。
凝胶包埋法是将酶包埋在各种凝胶内部的微孔中,制成一定形状的固定化酶的方法。
最常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、海藻酸钙、卡拉胶、聚丙烯酰胺等。
微胶囊包埋法是将酶包埋在高分子半透膜中,制成微胶囊固定化酶的方法。
1. 1 海藻酸钠- 壳聚糖固定化木瓜蛋白酶( Immobilized papain on sodium alginate - chitosan,IPSAC)海藻酸是从褐藻提取的,是甘露糖醛酸以β-1, 4键相连接的多糖类物质,它是包埋酶较为理想的载体,其固定化方法较为简单,条件温和,操作可在室温下进行,酶很少失活。
木瓜蛋白酶的固定化及其性质研究_何平
热带亚热带植物学报 2008,16(4):334～338Journal of Tr op ical and Subtr op ical Botany收稿日期:2007-05-23 接受日期:2008-04-09基金项目:国家自然科学基金项目(10074016);广东省自然科学基金项目(7006655)资助3通讯作者Corres ponding author木瓜蛋白酶的固定化及其性质研究何平1,黄卓烈13,黎春怡2,巫光宏1,初志战1,詹福建1(1.华南农业大学生命科学学院,广州510642; 2.茂名职业技术学院,广东茂名525000)摘要:在海藻酸钠2壳聚糖固定化木瓜蛋白酶(i m mobilized papain on s odiu m alginate 2chit osan,I PS AC )的实验中,当给酶量为1mg g 21载体时,酶活性为39.2U,酶活力回收为21.1%。
在尼龙布固定化木瓜蛋白酶(i m mobilizedpapain on nyl on,I P N )的实验中,当每块尼龙布(3c m ×3c m )给酶量为1mg 时,酶活性为35.6U,酶活力回收为19.2%。
木瓜蛋白酶(papain,P A )、I PS AC 、I P N 的最适pH 分别为7.2、7.2和6.8。
P A 及I PS AC 在70℃以下活性稳定;I P N 在50℃以下活性稳定。
I PS AC 与I P N 半衰期分别为59d 和66d 。
关键词:木瓜蛋白酶;固定化酶;海藻酸钠;尼龙布中图分类号:Q946.563文献标识码:A文章编号:1005-3395(2008)04-0334-05Studi es on Immobili zati on of Papa i n and the Properti es ofImmobili zed Enzy meHE Ping 1,HUANG Zhuo 2lie 13,L I Chun 2yi 2,WU Guang 2hong 1,CHU Zhi 2zhan 1,ZHAN Fu 2jian1(1.College of L ife Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;2.Maom ing Vocati onal and Technol ogical College,Maom ing 525000,China )Abstract:Papain was i m mobilized on s odium alginate 2hit osan and nyl on,res pectively .The i m mobiliati onconditi ons and characterizati on of the i m mobilizde enzy me were studied .W hen 1mg g 21carrier papain (P A )wasl oaded on s odiu m alginate 2chit osan (I PS AC ),the I PS AC activity was 39.2U,and the recovery of activity was 21.1%.A s P A was l oaded 1mg on one bl ock nyl on (3c m ×3c m ),the I P N activity was 35.6U ,and the recovery of activity was 19.2%.The op ti m um pH of P A,I PS AC and I P N were 7.2,7.2and 6.8,res pectively .P A and I PS AC were stable when the te mperature was l ower than 70℃,while I P N was stable bel ow 50℃.The half 2life of I PS AC and I P N were 59d and 66d,res pectively .Key words:Papain;I m mobilized enzy me;A lginate;Nyl on木瓜蛋白酶(papain,P A )大量存在于番木瓜(Carica papaya )的未成熟果实的乳汁中,是一种含巯基(2SH )的肽链内切酶。
木瓜蛋白酶在纳米材料上的固定化
木瓜蛋白酶在纳米材料上的固定化木瓜蛋白酶固定化的方法有很多种，利用纳米材料作为载体具有更好的特点，如大比表面积、优异的稳定性、较高的再生性、可控的孔隙结构等。
一些研究表明，利用纳米材料作为载体，可以提高木瓜蛋白酶的活性和稳定性，延长其生物催化寿命。
本文将着重介绍木瓜蛋白酶在纳米材料上的固定化方法及其在催化反应中的应用。
纳米材料固定化木瓜蛋白酶的方法主要包括物理吸附法、化学偶联法、共价键结合法等。
物理吸附法是将木瓜蛋白酶溶液和纳米材料混合后，通过静置或离心等方法使其吸附在纳米材料表面，这种方法简单易行，但固定效果不稳定，易受溶液条件的影响。
化学偶联法是利用纳米材料表面的官能团与木瓜蛋白酶上的氨基酸残基形成共价键结合，这种方法固定效果较好，但对木瓜蛋白酶的活性影响较大。
共价键结合法是通过交联剂将木瓜蛋白酶与纳米材料上的官能团进行交联，这种方法能使木瓜蛋白酶在纳米材料上获得较好的固定效果，并且对木瓜蛋白酶活性影响较小。
共价键结合法被认为是最适合木瓜蛋白酶在纳米材料上固定化的方法。
固定化木瓜蛋白酶在纳米材料上主要包括纳米金属、纳米炭材料、纳米多孔材料等几类。
纳米金属如纳米银、纳米金等，具有优异的导电性和高比表面积，能够提高木瓜蛋白酶的电子传递速率和反应活性。
纳米炭材料如碳纳米管、石墨烯等，具有优异的力学性能和化学稳定性，能够提高木瓜蛋白酶的稳定性和再生性。
纳米多孔材料如金属有机骨架材料（MOFs）、纳米孔硅等，具有可调控的孔隙结构和大比表面积，能够提高木瓜蛋白酶的催化效率和选择性。
选择合适的纳米材料作为木瓜蛋白酶的载体，对于提高其催化性能具有重要意义。
固定化木瓜蛋白酶在纳米材料上的应用主要包括生物催化反应和生物传感器等方面。
生物催化反应是指利用木瓜蛋白酶在纳米材料上的催化作用来进行化学反应，如酶促反应、酶联免疫分析等。
生物传感器是指利用木瓜蛋白酶在纳米材料上对底物的选择性和灵敏性来进行分析检测，如生物传感器、生物芯片等。
固定化木瓜蛋白酶的制备和性质研究_贺枫
＊1999-08-05收稿,2000-02-22修稿;＊＊通讯联系人固定化木瓜蛋白酶的制备和性质研究＊贺 枫 卓仁禧＊＊ 刘立建 徐勉懿(武汉大学化学系国家教育部生物医用高分子材料开放研究实验室 武汉 430072)摘 要 多孔硅球固定化木瓜蛋白酶具有热增活性.本文在前文研究的基础上,用载体交联法制备了甲壳胺固定化木瓜蛋白酶和纤维素固定化木瓜蛋白酶.考察了固定化pH 值、戊二醛浓度和给酶量对固定化木瓜蛋白酶活力的影响.研究了固定化木瓜蛋白酶的性质,特别是热稳定性和耐热性,并与溶液酶和多孔硅球固定化木瓜蛋白酶进行了比较.所制得的甲壳胺固定化木瓜蛋白酶和纤维素固定化木瓜蛋白酶的最适反应温度均达到了80℃;90℃温育1h 后固定化酶的活力保持在95%以上;70℃温育处理5h 和6h 后固定化酶的活力也仍能保持在90%以上.固定化木瓜蛋白酶的热稳定性和耐热性得到了显著提高.关键词 固定化酶,甲壳胺,纤维素,热稳定性 甲壳质是一种大量存在于甲壳动物、昆虫和细菌中的直链多糖,它不溶于稀酸、稀碱以及有机溶剂,具有坚韧、惰性、无毒等特性;经浓碱处理后,其分子的乙酰基部分逐渐水解脱除,成为部分或全部脱去乙酰基甲壳质,也称为甲壳胺.甲壳胺已被广泛用于医药、食品、印染、纺织、造纸、生物工程等领域,它在生物化学领域应用的一个重要方面就是作为固定化酶的载体[1～3].纤维素是世界上最丰富的有机化合物,广泛地存在于棉、麻、树木、野生植物等中,具有多种不同的形态,均不溶于水和有机溶剂.纤维素结构中存在着大量的羟基,可通过各种反应制成多种纤维素衍生物而带有各种活泼基团.纤维素广泛用于酶的固定化领域[4～6],用载体共价结合法制备固定化酶时,固定化方法多种多样,可适用于不同用途的需要.酶在高温下的催化反应,不仅可大幅度地提高酶催化反应速度,而且还可大大降低细菌污染的可能性以及提高反应的产率[7].前文曾首次报道了多孔硅球固定化木瓜蛋白酶的热增活性[8,9],为高温下的酶促反应提供了很大的可能.本文继续报道以甲壳胺和纤维素为载体、戊二醛为交联剂的固定化木瓜蛋白酶的制备及有关性质,特别是热稳定性和耐热性的研究.1 实验部分1.1 试剂与仪器甲壳胺(脱乙酰度为80%),广东省遂溪县南星甲壳素有限公司;纤维素为杭州新华造纸厂生产的大张滤纸;25%(W /V )戊二醛水溶液,Merck 产品,进口分装;木瓜蛋白酶,Fluka 产品;酪蛋白和半胱氨酸为生化试剂,其它试剂均为分析纯试剂.岛津UV -240紫外可见分光光度计.1.2 实验方法1.2.1 多孔硅球的活化及烷基化 氨丙基多孔硅球按文献方法[10]制备.1.2.2 甲壳胺的纯化 称取10g 甲壳胺粗产品,溶于200m L 的2%乙酸水溶液中,滤去不溶物,搅拌下向滤液中滴加10%的氢氧化钠溶液,将产生的沉淀过滤,滤出物在蒸馏水中浸泡24h ,然后用2mol /L 的盐酸调节溶液的pH 值至中性,过滤后用蒸馏水充分洗涤,再把滤出物于丙酮溶液中浸泡48h ,50℃下真空干燥至恒重.1.2.3 胺化纤维素的制备[11] 滤纸纤维素用3mol /L 氢氧化钠溶液浸泡24h ,得到的纸浆用蒸馏水充分洗涤,得到较均匀的纤维素.将50g 纤维素悬浮于150mL 的1mol /L 氢氧化钠溶液中,加入30m L 的环氧氯丙烷,于60℃温育反应30min ,过滤,水洗后,再加入10g 对苯二胺水溶液,于45℃下反应30min ,用蒸馏水充分洗涤,真空干燥至恒重.1.2.4 固定化酶的制备 分别以氨丙基多孔硅球、甲壳胺(脱乙酰度为80%)和胺化纤维素为载体,利用戊二醛载体交联法,制备固定化木瓜蛋白酶.具体方法如下:在锥瓶中加入0.5g 载体,一定第5期2000年10月高 分 子 学 报ACTA POLYMERICA S INICANo .5O ct .,2000637pH 值的0.1mol /L 磷酸缓冲溶液(内含0.005mol /L 半胱氨酸和0.001mol /L EDTA ),以及一定量木瓜蛋白酶和25%戊二醛溶液,室温下搅拌12h ,抽滤,所制备的固定化酶用0.1mol /L 磷酸缓冲溶液充分洗涤,室温下真空干燥至恒重.1.2.5 酶活力的测定[12] (1)固定化酶活力的测定方法为,在试管中加入1m L 的0.1mol /L 磷酸缓冲溶液(pH =7.0,内含0.005mol /L 半胱氨酸和0.001mol /L EDTA ),4mL 2%酪蛋白溶液(pH =7.0),37℃水浴中预热5min ,然后加入一定量的固定化酶,于37℃反应30min 后加入5mL 10%三氯乙酸溶液,振荡后于37℃放置10min ,过滤,测滤液在280nm 处的吸光度.(2)溶液酶活力的测定方法为,将酶溶于0.1mol /L 磷酸缓冲溶液(pH =7.0,内含0.005mol /L 半胱氨酸和0.001mol /L EDTA )中,配成0.2mg /m L 的原酶液,照上述方法测定酶的活力.固定化酶或溶液酶的相对活力是指在同组实验中以活力最高的为100,与其余的固定化酶或溶液酶的活力之比,通常以百分常数表示.固定化酶或溶液酶的剩余活力是指在同组实验中以未处理前的固定化酶或溶液酶的活力为100,与处理以后(包括热、酸、碱、试剂、固定化、冷藏等)所显示的活力之比,以百分常数表示.2 结果与讨论2.1 固定化酶的制备2.1.1 固定化反应pH 值对固定化酶活力的影响 在不同pH 值的0.1mol /L 磷酸缓冲溶液(内含0.005mol /L 半胱氨酸和0.001mol /L EDTA )中进行了木瓜蛋白酶的固定化反应,分别制备了多孔硅球、甲壳胺、纤维素固定化木瓜蛋白酶,当pH 值分别为8.0、7.5、7.5时,固定化酶的活力达到最大值.2.1.2 固定化反应戊二醛浓度对固定化酶活力的影响 戊二醛既是固定化反应的交联剂,同时又是酶的变性剂.制备多孔硅球固定化木瓜蛋白酶时,戊二醛使用浓度最高值达到2.5%(W /V );制备甲壳胺固定化木瓜蛋白酶的最适戊二醛浓度为0.50%(W /V );而制备纤维素固定化木瓜蛋白酶的最适戊二醛浓度为0.38%(W /V ).2.1.3 固定化反应给酶量对固定化酶活力的影响 固定化酶活力并不随固定化反应给酶量的增加而提高.随着载体负载酶量的增大,酶分子相互拥挤造成的空间位阻增大.制备多孔硅球固定化木瓜蛋白酶时,最佳给酶量为8.0mg /g 载体;制备甲壳胺固定化木瓜蛋白酶的最适给酶量为16.0mg /g 载体;而制备纤维素固定化木瓜蛋白酶的最适给酶量为10.0mg /g 载体.2.2 固定化酶的性质2.2.1 固定化酶的最适反应pH 值 如图1所示,在不同pH 值的0.1mol /L 磷酸缓冲溶液(内含0.005mol /L 半胱氨酸和0.001mol /L EDTA )中测定了固定化酶和溶液酶对底物酪蛋白的水解活力.多孔硅球固定化木瓜蛋白酶的最适反应pH 值为7.0,甲壳胺、纤维素固定化木瓜蛋白酶的最适反应pH 值均为8.0,这三种固定化木瓜蛋白酶的最适反应pH 值分别较溶液酶向碱性范围内移动了0.5和1.5个单位.Fig .1 Effect of pH on the relative activity of papain a )Immobilized papain on porous s ilica b eads ;b )Immobilized papain on chitos an ;c )Immob ilized pap ain on cellulose ;d )Native papain◇a ;□b ;○c ;★d2.2.2 固定化酶的最适反应温度(T m ) 如图2所示,在不同温度下的0.1mol /L 磷酸缓冲溶液(pH =7.0)中,测定了固定化酶和溶液酶对底物酪蛋白的水解活力.溶液酶的最适反应温度为60℃;多孔硅球固定化木瓜蛋白酶的最适反应温度达到90℃;甲壳胺固定化木瓜蛋白酶和纤维素固定化木瓜蛋白酶的最适反应温度均为80℃.这说明固定化提高了木瓜蛋白酶的热稳定性.2.2.3 温育温度对固定化酶活力的影响 在不加底物的情况下,将溶液酶和固定化酶在不同温度下于0.1mol /L 磷酸缓冲溶液中(pH =7.0)温育1h 后,冷至4℃,再于37℃测定其活力,如图3所示,随着温育温度的升高,多孔硅球固定化木瓜蛋白酶的活力始终比未经温育处理的固定化酶的活力高,最适温育温度达到90℃,剩余活力达到638高 分 子 学 报2000年Fig .2 Effect of temperature on the relative activity of papaina )Immobilized papain on porous s ilicab eads ;b )Immobilized papain on chitos an ;c )Immob ilized papain on cellulose ;d )Native papain○a ;△b ;◇c ;★d180%以上.同时,甲壳胺固定化木瓜蛋白酶和纤维素固定化木瓜蛋白酶的活力随着温育温度的升高,缓慢下降,90℃温育处理1h 后,剩余活力保持在95%以上,而溶液酶90℃温育处理1h 后的剩余活力在20%以下.木瓜蛋白酶的热稳定性在固定化以后得到较大提高.Fig .3 Effect of temp erature of preincubation for 1h on the residu al activity of papaina )Immobilized papain on p orous silica beads ;b )Immobilized papain on chitosan ;c )Immobilized p ap ain on cellul ose ;d )Native papain◇a ;□b ;○c ;★d2.2.4 温育时间对固定化酶活力的影响 在不加底物的情况下,将溶液酶和固定化酶在70℃下于0.1mol /L 磷酸缓冲溶液(pH =7.0)中温育不同时间后,冷至4℃,再于37℃测定其活力,如图4所示,随着温育时间的延长,多孔硅球固定化木瓜蛋白酶的活力不仅没有下降,而且始终较未经温育处理的固定化酶的活力高,当温育处理10h 后,剩余活力达到250%以上.同时,随着温育时间的延长,甲壳胺固定化木瓜蛋白酶和纤维素固定化木瓜蛋白酶的活力缓慢下降,70℃温育处理5h 和6h 后,活力仍保持在90%以上,固定化酶的耐热性得到了显著提高.Fig .4 Effect of duration of heating at 70℃on the residual activity of p ap aina )Immob ilized p apain on porous s ilica beads ;b )Immob il ized papain on chitos an ;c )Immobilized papain on cell ulose ;◇a ;□b ;△c从以上实验结果可以看出,木瓜蛋白酶固定在多孔硅球、甲壳胺以及纤维素这三种载体上后,其热稳定性和耐热性得到明显的提高,但只有多孔硅球固定化木瓜蛋白酶具有显著的热增活性.这可能是因为多孔硅球为无机载体,而甲壳胺和纤维素为有机载体;多孔硅球具有很强的刚性,酶分子固定在多孔硅球上以后,其结构得到了较好的稳定,对温育处理具有更好的耐受能力,不易失活;而且经过温育处理以后,固定在多孔硅球上的木瓜蛋白酶的构型可能发生转化而更适合于催化反应的需要,因而显示出较未经温育处理的固定化酶的更高活力,即具有热增活作用,其机理研究正有待进一步进行.6395期贺 枫等:固定化木瓜蛋白酶的制备和性质研究640高 分 子 学 报2000年REFERENC ES1 Nozaw a Y,Matsushita T,Higashide F.Biotech n ol Bioeng,1982,24(3):753～7562 Lin S F,Hw ang Y L,Tsai Y C.Biob echnol Tech,1996,10:63～683 M artino A,Durante M,Pitteri P G,Spagma G,Bianchi G.Proces s Biochem,1996,31:281～2854 Grinshp an D D,Gavenas G A,Den is G I,Dobrolyubov A G,Itsygin S B.Biotekhnol ogiya,1989,5:747～7485 Vlad imír Kéry,Jan a Haplov,Karol Tihl rik.J Chem Technol Biotechnol,1990,48:201～2076 Trzmiel T,Gal as E,Fortak M.Acta Biotechnol,1994,14:205～2097 Klibanov A M.In:Advances in Ap plication Microbiol ogy.Vol.29.New York:Acad emic Press,1983.1～288 He Feng(贺枫),Liu Lij ian(刘立建),Zhuo Renxi(卓仁禧).Ion Exchange and Adsorption(离子交换与吸附),1997,13(3):290～2949 Zhuo R X,He F,Liu L J,Xu M Y.Chinese J of Polym Sci,1998,16(2):142～14610 Liu Lij ian(刘立建),Zhuo Renxi(卓仁禧).Ion Exchang and Ads orption(离子交换与吸附),1995,11(6):541～54411 Gu o Qiao(郭桥),Lu o Guimin(罗贵民),Sun Qi-an(孙启安),Huang Zhongl i(黄仲立),Ma Lin(马林).Chinese Biochem J(生物化学杂志),1994,10(3):259～26312 Weetall H H,Mars on R D.Biotechnol Bi oeng,1973,15(3):455～466STUDIES ON THE PREPARATION AND CHARAC TERIZATION OFIMMOBILIZED PAPAINHE Feng,ZH UO Renxi,LIU Lijian,XU Mianyi(Department of Ch em istry,Lab oratory of Biomed ical Polymer Materials of th e Ministry of Education,Wuhan Un ivers ity,Wuhan 430072)A bstract Papain w as immobilized on porous silica beads,chitosan and cellulose by cross linking w ith g lutaraldehyde.Thermal activation of immobilized papain o n po rous silica beads has been first found and reported by us.In this article,the factors related w ith the activity of the immobilized papain on chitosan and cellulose,such as pH of the immobilized reaction,concentration of glutaraldehyde and amount of papain w ere studied.We also studied the characters of these immobilized papain,comparing w ith native papain and immobilized papain o n po rous silica beads.Thermal stability and durability on heating w ere emphasized. Their optimum reaction temperature w ere80℃.After incubation at90℃for1h,the activity of these immobilized papain w as retained above95%.After incubation at70℃for5h or6h,the activity of immobilized papain w as also retained above90%.These results show ed that thermal stability and durability on heating of im mobilized papain on chitosan and cellulose were improved considerably.Key words Immobilized enzyme,Chitosan,Cellulose,Therm al stability。
啤酒生产中常用的木瓜蛋白酶的固定化方法
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木瓜蛋白酶在纳米材料上的固定化
木瓜蛋白酶在纳米材料上的固定化目前，常见的固定化方法包括物理吸附、交联法和共价结合法等。
纳米材料作为一种新型的载体材料，其具有较大的比表面积、良好的生物相容性和化学活性，使得其在酶的固定化过程中具有独特的优势。
首先，纳米材料的大比表面积可以提供更多的活性位点，增加酶与底物之间的接触面积，从而提高酶的催化效率。
其次，纳米材料的高生物相容性让其能够更好地与酶相结合，减少酶的失活率。
此外，纳米材料的较小孔径和高孔隙率有助于木瓜蛋白酶的固定化，提高酶的稳定性，延长酶的寿命。
固定化酶的方法中，物理吸附是一种简单、易操作的方法。
例如，利用磁性纳米颗粒可以使酶在磁场作用下固定在特定位置，从而方便酶的回收和重复使用。
另外，通过静电相互作用也可以将酶吸附在纳米材料表面。
物理吸附的优点是操作简单，但缺点是酶易于失活和脱落，固定效果差，需要进行后续的交联处理。
交联法是在物理吸附的基础上进一步加强固定效果的方法。
一种常用的方法是将纳米材料与交联剂反应，将酶固定在纳米材料表面，形成交联酶，从而提高酶的稳定性和催化效率。
例如，可以利用纳米粒子表面的羧基与酶的氨基酸残基进行缩合反应，形成共价键。
交联法的优点是酶固定效果好，稳定性高，但需要较多的步骤和条件控制。
共价结合法是一种较为复杂和繁琐的固定化方法，但可以获得较好的固定效果。
例如，可以利用纳米材料表面的氨基官能团与酶的羧基官能团进行酰胺键反应，将酶牢固地固定在纳米材料上。
此外，也可以通过改造酶的配体，使其与纳米材料表面的功能化基团发生特异性配位反应，从而实现酶的固定。
共价结合法的优点是固定效果好，稳定性高，但需要较复杂的合成和修饰步骤。
总的来说，将木瓜蛋白酶固定化在纳米材料上具有许多优点，可以提高酶的稳定性、重复使用性和催化效率。
在工业生产中，纳米材料固定化木瓜蛋白酶可以应用于食品加工中的蛋白水解、医药领域的药物合成和生物技术领域的基因工程。
然而，固定化过程中仍然存在一些挑战，如固定化效果的优化、固定化方法的选择和酶活性的保持等。
木瓜蛋白酶在纳米材料上的固定化
木瓜蛋白酶在纳米材料上的固定化
木瓜蛋白酶是一种能够在不同温度和酸碱条件下保持活性的天然酶类。
它具有高效的
催化活性，广泛应用于食品、制药和生物工程等领域。
传统的酶催化反应往往存在反应底
物难以分离和回收的问题，限制了其在工业应用中的广泛应用。
将酶固定在材料表面，成
为提高酶催化反应效率和稳定性的一种有效方法。
纳米材料是一种表面积大、可调控的材料，具有优异的质子传导性质和化学活性。
纳
米材料被广泛用于酶的固定化研究中。
木瓜蛋白酶在纳米材料上的固定化不仅可以进一步
提高酶的稳定性和催化效率，还可以实现酶的可重复使用。
纳米材料的固定化方法通常包括吸附、化学键、交联等方法。
吸附是一种简单、易操
作的固定化方法，通常可以通过调节纳米材料和酶溶液的pH、温度和离子力等因素来实现酶的吸附。
由于吸附力较弱，酶容易在固定化过程中失活和流失，因此需要进一步优化。
化学键是一种常用的固定化方法，可以通过制备功能化纳米材料来与酶进行共价结合。
可以将纳米材料表面引入含有反应活性官能团的化合物，再与酶分子上的氨基酸残基进行
化学反应。
这种固定化方法具有较高的稳定性，但操作复杂，需要选择合适的化学反应条件。
在纳米材料上固定化木瓜蛋白酶的目的是提高酶的稳定性和催化效率，从而实现酶的
可重复使用。
通过优化固定化方法和反应条件，可以有效地固定化木瓜蛋白酶在纳米材料上，进一步拓展其应用领域。
固定化木瓜蛋白酶在纳米材料上的研究还可以为其他酶的固
定化提供借鉴和参考，促进酶技术的发展和应用。
木瓜蛋白酶研究进展
生物化工基础论文题目：木瓜蛋白酶研究进展姓名：钱龙学号;2011425119摘要：木瓜蛋白酶是一类巯基蛋白酶，大量存在于木瓜乳汁中。
对其组成成分、结构、制备、固定化、在非水介质中的特性及在医药上的用途等方面的研究进展进行了综述。
关键词：木瓜蛋白酶；固定化；医药用途；进展；展望前言木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。
是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。
它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。
溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。
最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
1.木瓜蛋白酶的组分工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。
现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶[EC 3.4.22.2](papain)、木瓜凝乳蛋白酶[EC 3.4.22.6](chymopapain)、木瓜蛋白酶Ω[EC 3.4.22.30](papaya proteinaseΩ，也称papaya peptidase A、papaya proteinase Ⅲ)、木瓜凝乳蛋白酶M [EC3．4．22．25](chymopapain M、papaya proteinase Ⅳ。
其中chymopapain的含量最多，占可溶蛋白的45%。
其组分又最复杂，含十几种蛋白。
但人们还是习惯根据其从离子交换柱出来的先后顺序分为木瓜凝乳蛋白酶A和木瓜凝乳蛋白酶B。
2.木瓜蛋白酶的结构木瓜乳汁中四种已知半胱氨酸蛋白酶的一级结构具有高度同源性，其氨基酸数目和同源性比较如表1所示。
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食品酶学 研究生课件
E
E
E
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•包埋法---微胶囊型
原理：以半透性的有机高聚物薄膜包围含有酶分子的液滴，在有机溶剂 中，含酶水溶液的液滴界面处，发生界面凝集作用，形成半透性膜，使 酶被包裹于其中，阻止了酶的漏失。
微囊直径一般为m-几百m的小珠 特点：小分子底物能通过膜与酶接触，产物也可释放出来。
•载体吸附---共价结合法
常见载体为： DEAE纤维素（二乙氨基已基纤维素）、 TEAE纤维素（三 乙基氨基乙基纤维素）、DEAE葡聚糖凝胶
特点：操作简便，酶分子结构及活性中心不变
•载体吸附---物理吸附法
活性碳
E
吸附
惰性载体 硅胶
（不溶于水） 石英
E E
硅藻土 E
特点：操作简单，吸附力弱；pH 、T、 底物浓度变 化时，会导致酶从载体上部分或全部脱落。
•游离木瓜蛋白酶 活力的测定
条件优化： •不同浓度的微孔淀
•固定化木瓜蛋白 酶的制备
实验设计
粉对酶活力的影响
•不同浓度的海藻酸 钠对酶活力的影响
•固定化酶活力测
•不同浓度的GaG1溶
定
实验步骤
液对固定化木瓜蛋
白酶活力的影响
•固定化酶制备条 件的优化
实验结果
•固定化木瓜蛋白酶 制备条件的正交试
•固定化酶性质研
实验结果分析
1、载体吸附Gu2+ 的量对固定化酶的影响:
当Gu2+载体﹤1.5×10-2mol/g 时，酶 活随给Gu2+量的增加而增加，这是因为 琼脂糖IDA只有在结合了Gu2+后才能以 配位作用固定酶，随给Gu2+量的增加载 体表面固定木瓜蛋白酶的位点增多，导 致载酶量增加而引起酶活上升；当Gu2+ 载体﹥ 1.5×10-2mol/g时，载体表面 的IDA 逐渐被Gu2+饱和至过饱和，载体 的载酶量达到最大值，但被琼脂糖IDA 载体过量吸附的Gu2+在随后的酶反应过 程中溢出至溶液中抑制了木瓜蛋白酶的 活性，使得酶活随Gu2+量的增加而减少。
原理：酶蛋白上非活性必需基团（氨基酸残基）与载体通过共价键形成 不可逆的联结。 载体：纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺衍生物 优点：结合牢固，酶不易脱落，稳定性好。 缺点：载体需活化，操作复杂，反应条件剧烈
E E
E 载体 E
E E
•载体吸附---离子结合法
原理：酶蛋白的带电基团和含有离子交换基团的固体载体由于离子效应， 将酶固定在离子交换基团的非水溶性载体上。
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——木瓜蛋白酶的固定
万丽花 2011.11.4
主要内容
食品酶学 研究生课件
1
固定化酶的介绍
2
固定化酶的特点
3
酶固定化的方法
4 举例：木瓜蛋白酶的固定及性质研究
•固定化酶的介绍
食品酶学 研究生课件
原因1
酶对热、酸、碱 等有机溶剂均不 稳定，即使在酶 反应的最适环境 中，也易失活。
原因2
酶一般以溶于水的 状态作用于底物， 因此，当反应结束 时，一般难以回收 ，也难以从产物中 除尽，又由于酶仅 能使用一次，因此 ，使得产物纯度不 够，且造成很大的 浪费。
•交联法
原理：依靠双功能基团试剂，使酶蛋白分子间发生交联，凝集成网 状结构，从而成为不溶性酶。
特点：反应条件剧烈、酶活力低、颗粒较细，一般不能单独使用， 常常和包埋法、吸附法等联合使用。
常用双功能基团为：戊二醛
-CHO-(CH2)3-CHO
•举例：木瓜蛋白酶的固定
固定方法
食品酶学 研究生课件
一、微孔淀粉 ——海藻酸钠 固定化木瓜蛋 白酶
缺点
食品酶学 研究生课件
增加了生产的成本， 工厂初始投资大
与完整菌体相比不适于多酶反应
只能用于可溶性底物
•酶固定化的方法
格子型
•包埋法
微胶囊型
•交联法
共价结合法
•载体结合法
离子结合法
物理吸附法
食品酶学 研究生课件
一定方式
分离的酶
载体
固定
•包埋法---格子型
原理：将酶包埋在聚合物的凝胶格子中 常用凝胶为：聚丙烯酰胺凝胶、明胶、 角叉菜胶
•共价结合吸附固定木瓜蛋白酶
食品酶学 研究生课件
在使用金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶时， 固定化反应条件温和，对酶的高级结构 影响小，酶活回收高；固定化酶的热稳定性明显 提高；载体的载酶量大；载体的再生、酶的固定 化过程操作简单；固定化酶及载体可多次重复利 用
1.载体的制备 2.酶的固定化 3.酶活的测定 4.载 体吸附Gu2+ 的量对固定化酶的影响 5.固定化时间 的影响 6.pH 对固定化酶的影响 7.给酶量对固定 化酶的影响 8.固定化酶的性质
实验结果：
2、不同浓度的海藻酸钠对酶活力的影响：
随着海藻酸钠浓度的增加，包埋木瓜蛋白酶的量会逐渐增加，但继续 加大海藻酸钠浓度就会使表面密度不断加大，底物运动扩散更加困难， 降低酶活。木瓜蛋白酶固定化的最适海藻酸钠浓度为3％。
实验结果：
3、不同浓度的GaG12溶液对固定化木瓜蛋白酶活力的影响
当CaC12 浓度为5．5％时酶活最高。一般情况下凝胶强度与钙离子浓 度成正比，但由于有微孔淀粉的存在使钙离子对木瓜蛋白酶的抑制作 用发生变化，但总体上酶活是先升高后降低的。
固定化酶
通过物理或化学 法将酶束缚在一 定的空间，使酶 只能在此区间进 行催化反应，反 应结束后，能迅 速与底物和产物 分开，实现重复 使用。
•固定化酶的特点
易与反应液分开
食品酶学 研究生课件
可反复使用，降低成本
优点
酶的稳定性提高
较易控制终止酶反应的进程
产物纯化简便
•固定化酶的特点
酶活力有损失
胞内酶必须经过酶的分离 手续
验
究
最佳制备条件为微孔淀粉浓度4％，海藻酸钠浓度3％，
CaC12浓度5.5％。固定化木瓜蛋白酶的最适pH值为5.7，
最适温度72℃。
验结果：
1、不同浓度的微孔淀粉对酶活力的影响：
木瓜蛋白酶固定化的最适微孔淀粉浓度为4％。随着微孔淀粉浓度的 增加，吸附木瓜蛋白酶的量会逐渐增加，但继续加大微孔淀粉浓 度．就会使底物运动扩散更加困难，降低酶活。
结果总结 实验结果分析 实验步骤
利用金属螯合配体与蛋白质相 结合的原理，选用磁性琼脂糖亚氨基二乙酸（IDA）-Gu2+ 做 为金属螯合载体，定向固定木 瓜蛋白酶。
实验原理
取螯采合用载反体相，悬加浮入包木埋瓜法蛋制白备酶，室利温用下原子吸收分 振荡光4光h，度用法P测BS定洗上涤清数G次u2至+ 浓上度清，中计检算测载不体到吸 酶活附，Gu即2+得的固量定。化的木瓜蛋白酶
（包埋法固定）
二、金属螯合 载体定向固定 化木瓜蛋白酶
（载体吸附—— 共价结合）
食品酶学 研究生课件
包埋法固定木瓜蛋白酶
一种新型的变性淀粉，具有较大的比孔容和 比表面积，可以吸附很多种功能性物质
采用微孔淀粉——海藻酸钠包埋法固定
凝胶剂
木瓜蛋白酶，探讨固定化条件、固定化
木瓜蛋白酶及游离酶的酶学性质。