细菌总数的测定法
细菌总数的测定
细菌总数的测定一、准备工作1.准备好培养基（一般为普通营养琼脂培养基），称取28克培养基粉末，放入1000ml锥形瓶中，量取800ml蒸馏水倒入，放入搅拌子在搅拌器上，将溶液搅拌均匀后，再取出搅拌子（用铁棒吸出），然后用报纸包扎锥形瓶口，待灭菌。
2.取洗净干燥的培养皿，根据水样准备培养皿数，一般原水样稀释三个倍数，处理后水样稀释两个倍数，每个做两个平行样。
每十个培养皿一组，用报纸包扎好待灭菌。
3.移液枪头的灭菌：洗干净后放入盒中排列整齐，盖上盒盖，在盒子外面包一层报纸，再用橡皮筋扎紧，待灭菌。
4.小试管：每次用完都要将小试管刷洗干净，洗净后倒放在试管架上备用，如当天需要做细菌实验则将所需数量的每根试管内各加入9ml蒸馏水，赛上橡皮塞，7支一捆用报纸将试管口扎好，待灭菌。
5.250ml采样瓶及锥形瓶（加有适量玻璃珠）需提前灭菌，方便采样人员随时取用，灭菌好的采样瓶可保存一周，灭菌时每个瓶口都要用报纸包扎好。
6.标签纸准备：事先将所需的数量准备好，写上编号，以备操作时取用。
二、灭菌1.高压蒸汽锅的使用：灭菌前应先检查国锅内水位，应保持在水位标示处，过多过少都不好，放入准备步骤中待灭菌的物品，盖上小盖，然后再盖外盖，对正后对角旋好各个旋钮，使其受力均匀不至于在灭菌的过程中跑气（压力上不去即为跑气），然后关上安全阀打开放气阀，打开高压蒸汽锅开关，调好灭菌时间（一般灭菌30min），待放气阀放气声很大后关上放气阀，蒸气锅即开始依据设计的时间灭菌，此时压力表指针在1.5左右，灭菌完毕后，关上开关，待压力表指针在0处，打开安全阀放气后，才能开盖。
蒸气锅底部水若变脏则需清洗并换水。
2.细菌实验所需玻璃器皿一般需要灭菌30min。
3.净化工作台的使用：先用75%酒精灯擦拭台面，紫外灯和照明灯隔一段时间擦拭一下，并用软布擦拭干净，然后关上门，打开紫外灯按钮，照明消毒30min后再打开送风按钮，一直到实验前才关闭紫外灯，打开照明灯。
细菌总数的测定方法
细菌总数的测定方法
细菌总数的测定方法可真是太重要啦！它能让我们清楚地了解环境或样本中细菌的数量情况。
那具体是怎么操作的呢？首先要准备好培养基，比如常用的营养琼脂培养基。
然后就是采样啦，这可不能马虎，一定要保证采样的代表性和准确性。
接下来把样品进行适当稀释，这一步要细心哦，不然可就不准确啦！再把稀释后的样品接种到培养基上，要均匀分布哟！最后就是培养啦，在适宜的温度下培养一段时间。
这里要注意的是，操作过程一定要严格无菌，避免污染，不然结果就不准确咯！而且稀释度的选择也很关键呢，要根据实际情况合理选择。
在这个过程中，安全性那是相当重要的呀！毕竟是和细菌打交道嘛。
所有的操作都要在无菌环境下进行，保证操作人员不会受到细菌的侵害。
稳定性也不容忽视呢，只有保证每次操作的一致性，才能得到可靠的结果呀。
那细菌总数的测定方法都有哪些应用场景和优势呢？哇塞，那可多了去啦！在食品行业，可以检测食品的卫生状况，保障我们的食品安全，这难道不是超级重要的吗？在医疗卫生领域，可以监测环境的细菌污染情况，为疾病防控提供依据呢。
它的优势就在于简单易行、成本较低，而且能快速得到结果呀。
就拿食品生产企业来说吧，通过定期检测生产环境中的细菌总数，可以及时发现问题，采取措施改进生产工艺和卫生条件，从而避免食品安全问题的发生。
这不是实实在在的效果吗？
细菌总数的测定方法真的是非常实用且重要的呀！它能帮助我们更好地了解和控制细菌的存在，保障我们的生活和健康呢！。
实验十细菌菌落总数(CFU)的测定(精)
操作步骤图示
1ml
振荡 10min 1ml 1ml 1ml
水样
9ml 10-1 1ml 20ml
9ml 10-2 1ml 20ml
9ml 10-3 1ml 20ml
倒培养基
2×
五、菌落计数及报告方法
（一）平板菌落数的选择 1、进行平皿菌落计数时，记下同一浓度的3个平板（或 2个）的菌落总数，计算平均值，再乘以稀释倍数即为 1ml水样中的细菌总数。 2、 计数时应选择菌落数在30~300/皿之间的稀释倍数 进行计数，若同—个稀释度中一个平皿有较大片状菌落 生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿计 数该稀释度的平均菌落数。若片状菌落少于平皿的一半 时，而另—半中菌落分布又均匀，则可将其菌落数的2 倍作为全皿的数目。在记下各平皿菌落数后，应算出同 一稀释度的平均菌数，供下—步计算时用。
实验十 细菌菌落总数 （CFU）的测定
一、实验目的和要求
1、学会细菌菌落总数的测定。 2、了解水质与细菌菌落数之间的相关 性。
二、实验原理
细菌种类很多，有各自的生理特性，必须用 适合它们生长的培养基才能将它们培养出来。 然而，在实际工作中不易做到，所以通常用 一种适合大多数细菌生长的培养基培养腐生 性细菌，以它的菌落总数表明有机物污染程 度。水中细菌总数与水体受有机污染的程度 成下相关，因此细菌总数常作为评价水体污 染程度的一个重要指标。细菌总数越大，说 明水体被污染得越严重。
4、若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应 按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之 5、如果全部稀释度的平均菌落数均不在30～300 之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀 释倍数报告之。 6、菌落计数的报告，菌落在100以内时按实有数 报告；大于100时，采用二位有效数字；在二位 有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为 了缩短数字后面的零数,也可用10的指数来表示， 在所需报告的菌落数多至无法计算时，应注明水 样的稀释倍数。
细菌总数的测定
相连，南部及西南部与老挝、越南和缅甸唇齿相依；
• 多民族省区；云南有25个少数民族、贵州有17个、广西有 11个，民族文化绚丽多姿“三里不同风，五里不同谷，大
节三六九，小节天天有” 。
二、西南区的旅游环境特征
岩溶旅游资源/民俗文化旅游资源得天独厚； 地形复杂多样，地文景观丰富多彩； 热带、亚热带季风气候孕育了繁茂的森林景
观；
二、西南区的旅游环境特征
现代文明与传统文化交相辉映的城市风光； 南北兼容、中西合璧的文化； 旅游配套服务完善，旅游资源以自然与人造景观最富特色。
三、岩溶旅游资源
岩溶旅游资源的概念
旅游需求市场较大； 旅游资源分布不平均，云南多民族、广西具有滨海资
源、贵州多瀑布；
三、岩溶旅游资源
• 岩溶旅游资源的价值
– 美学观赏价值 – 科学考察价值 – 生态环境价值 – 文化传承价值
四、民俗文化文化旅游资源
– 民俗文化文化概念：是指民间民众的风俗生活 文化的统称。也泛指一个主题、民族、地区中 集居的民众所创造、共享、传承的风俗生活习 惯。它具有普遍性和传承性和变异性。
1mL
9mL稀释液 1：100
1mL
9mL稀释液 1：1000
1mL
每个稀释度
做两个平皿
1mL
1mL
1mL
1mL
倾注平皿
将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿 约15ml，并转动平皿，混合均匀。
6、培养及计数
培养条件：倒置于36±1℃温箱内培养48±2h
计数时间：到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放 置于0－4℃，但不得超过24h。
细菌总数的检验方法
细菌总数的检验方法1 试验器材: 样品、无菌水、制备好的营养琼脂培养基200 ml 装于三角瓶、装有三、四十粒玻璃珠的三角瓶一个、平板数套、1 ml 吸管、计数器、试管。
2. 试验步骤:2.1 在无菌条件下取样品10ml。
2.2 用1 ml灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml ，置于9 ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀成1:100稀释液。
2.3 另取1 ml灭菌吸管吸，按上述操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1ml 灭菌吸管。
2.4 根据对样品的污染程度选择2到3个适宜的稀释度分别在作10倍递增稀释液的同时,即以吸取该稀释度的吸管,吸取1ml 稀释液，置于灭菌平板内，每个稀释度作2个平板。
2.5 稀释液移入平板后，立即将冷却至45°C的营养琼脂基约15 ml倾入平板中,并转动平板使混合均匀。
2.6待琼脂凝固后翻转平板,置于37°C 恒温培养箱内培养24小时或48小时，计算平板内菌落数目，将细菌菌落乘以稀释倍数，即得每毫升样品中所含菌落总数。
3 菌落计数方法:3.1 平板内菌落计数时，可用肉眼观察,必要时用放大镜。
3.2 在记下各菌落数后，求出同稀释度的各平板的平均数。
4 菌落计数的报告4.1平板菌落数的选择:选取菌落数在30到300之间的平板作为菌落数测定标准。
一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板内的菌落平均数。
其中一个平板有较大片状菌落生长时。
不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数。
若片状菌落不到平板的一半，而其余部分又很均匀,则可计算半个平板后乘以2以代表全平板的菌落数。
4.2 稀释度的选择4.2.1 应选择平均菌落数在30到300之间的稀释度，乘以稀释倍数来报告它。
4.2.2 若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30到300之间，应视二者之比如何来决定，若其比值小于2，应报告其平均数。
若大于2，则报告其中较小的数字。
介绍几种新的水中细菌总数检测方法
介绍几种新的水中细菌总数检测方法
1.流式细胞术：利用流式细胞仪将水样中的细菌进行分析和计数。
这种方法可以快速、高效地获取大量细菌数据，并且还可以进行不同种类细菌的分类和分析。
2. 基于荧光的检测方法：这种方法利用细菌表面的荧光素来进
行检测。
通过添加特定的荧光素探针，可以在短时间内快速、准确地测量水中细菌总数。
3. 基于DNA技术的检测方法：这种方法通过提取水样中的DNA，利用聚合酶链式反应(PCR)等技术来进行检测。
这种方法可以检测到
非常微小的细菌数量，而且还可以进行不同种类细菌的分子生物学鉴定。
4. 浸润法：这种方法是将一定量的水样浸润在适宜生长条件下
的培养基上，然后通过培养基上产生的菌落来计算水中细菌总数。
这种方法具有简单、易操作等特点，但是需要较长时间的培养过程。
5. QPCR技术：这种方法是一种快速、灵敏的检测细菌数量的方法，它利用荧光探针来放大和检测DNA序列。
这种方法可以在数小时内完成检测，而且可以检测不同种类的细菌。
- 1 -。
细菌总数测定纸片法实验报告
细菌总数测定纸片法实验报告
标题：细菌总数测定纸片法实验报告
摘要：
本实验采用纸片法测定细菌的总数。
首先，将培养基均匀涂布在琼脂培养皿上，然后将待测液体滴于培养皿上，再将纸片轻轻覆盖在液体上。
经过一段时间后，纸片上的细菌会在培养基上生长形成菌落，通过计数菌落的数量可以确定细菌的总数。
实验过程：
1. 准备琼脂培养皿，并在上面均匀涂布培养基。
2. 将待测液体滴于培养皿上，确保液体均匀分布。
3. 将纸片轻轻覆盖在液体上，避免与培养基直接接触。
4. 将培养皿倒置放置于恒温箱中，设置适宜的温度和时间进行培养。
5. 取出培养皿后，观察纸片上的菌落，使用显微镜对菌落进行放大观察。
6. 通过计数菌落的数量，利用统计方法可以估算出细菌的总数。
结果：
根据实验观察，纸片上出现多个菌落，通过放大观察可以看到菌落的形态、颜色和大小。
通过计数菌落的数量，并结合统计方法，可以估算出细菌的总数。
讨论：
纸片法测定细菌总数的优点在于方法简单、成本低廉，并且可以适用于各种类型的细菌。
然而，该方法也存在一定的局限性，
如同一种细菌可能在培养基上形成不同形态的菌落，而且纸片法只能估算出细菌的总数，无法区分不同菌落所对应的细菌种类。
结论：
通过纸片法测定细菌总数，我们可以获得关于细菌数量的大致信息。
然而，在实际应用中，我们仍需结合其他检测方法来获取更全面的细菌信息，并确保实验的准确性和可靠性。
细菌总数测定实验报告
细菌总数测定实验报告细菌总数测定实验报告引言：细菌是一类微小的生物体，广泛存在于自然界的各个角落。
细菌的数量对于环境卫生和食品安全至关重要。
本实验旨在通过测定细菌总数的方法，了解样品中细菌的数量，并探讨不同环境条件对细菌总数的影响。
实验方法：1. 样品采集：我们选择了不同环境中的样品，包括自来水、空气、餐具表面和人体皮肤表面。
通过无菌棉签或无菌采样器，分别采集样品，并放入无菌试管中。
2. 稀释液的制备：我们准备了一种稀释液，以免细菌过多导致结果不准确。
稀释液的配方为：1克氯化钠和1克蛋白胨溶解在100毫升蒸馏水中。
3. 稀释样品：将采集到的样品取出一定量，加入稀释液中，进行逐级稀释。
我们选择了1:10、1:100和1:1000三个不同的稀释倍数。
4. 培养：将稀释后的样品分别接种在琼脂平板上，利用无菌棉签均匀涂抹样品。
然后将琼脂平板倒置放置于恒温培养箱中，温度设定为37摄氏度。
培养时间为24小时。
5. 细菌总数计算：在培养箱中，我们观察到琼脂平板上的菌落。
根据菌落的数量和稀释倍数，可以计算出原始样品中的细菌总数。
实验结果：我们进行了多次实验，得到了不同样品中的细菌总数。
结果显示，自来水中的细菌总数最低，空气中次之，餐具表面和人体皮肤表面的细菌总数较多。
此外，我们还发现，稀释倍数越高，细菌总数越低。
讨论：细菌总数的测定对于环境卫生和食品安全具有重要意义。
通过本实验，我们了解到不同环境中细菌总数的差异，为进一步研究提供了基础数据。
自来水中的细菌总数较低，这可能是由于自来水经过了严格的处理和消毒。
空气中的细菌总数稍高，这是因为空气中存在着大量的微生物，例如细菌和真菌。
餐具表面和人体皮肤表面的细菌总数较多，这与人们日常接触物体和环境有关。
稀释倍数的选择对于测定细菌总数至关重要。
过高的稀释倍数会导致菌落过少，难以准确计数；而过低的稀释倍数则会导致菌落过多，影响结果的准确性。
因此，在实际应用中，我们需要根据实际情况选择适当的稀释倍数。
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细菌总数的测定法
一、细菌数测定的基本概念
药品细菌数测定是微生物的定量检查，是用来判断药品被细菌污染程度和卫生质量评价的重要指标，也是检测药品质量的重要指标之一。
细菌计数是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH 位、培养温度和时间等）每1g、lml、l0cm2供试品液经培养后所生长的菌落数。
所谓一定条件是按我国药典规定，在需氧条件下，30～35℃，一般培养48h,在营养琼脂培养基平板上生长的细菌菌落数。
细菌数的测定方法有多种：平板法、薄膜过滤法、涂抹法。
药品细菌数测定是活菌计数，最常用的平板法是以平板菌落计数为依据，即每个菌落代表个菌细胞，但有的菌落也可能是多个菌细胞形成，如双球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等，很可能是多个菌细胞在一起。
故准确地说，细菌数测定值实际上是菌落形成单位数( CFU)。
平板法菌落计数法，是受一定条件的限制：如供试液是否均质，供试液中的细菌是否充分分散；培养基的质量、培养温度及培养时间的影响；有繁殖能力的菌细胞才能形成菌落，死菌及某此受损伤的细菌或营养要求苛刻的细菌在规定的培养基上不能生长，因而不被计数。
在试验操作中应考虑到这此问题。
二、设施、设备、仪器及器皿
1、设施
细菌数测定全过程应严格遵守无菌操作，在环境洁净净度l0000级和局部洁净度100 级单向流空气区域内进行，以防止再污染。
2、设备、仪器
恒温培养箱（30～35℃）、微波炉、匀浆仪（4000～10000r / min ）、康氏振荡器、恒温水浴、电热干燥箱（250～300℃）、电冰箱、空调、高压蒸汽灭菌器（使用时要进行灭菌效果验证并应定期请有关部门检定）
菌落计数器、显微镜（1500X）、电子天平（感量0.1g）、pH 值系列比色计、全封闭可拆卸或开放式的薄膜过滤器。
3、器皿
锥形瓶（250～300ml ）、培养皿（∮9cm）、量筒（100ml）、试管（18×18mm）、刻度吸管（l ml , 10ml）、载玻片、玻璃或搪瓷、不锈钢消毒缸（带盖）。
玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。
吸管上端距0 .5 cm 处塞入约2 cm 左右的适当疏松棉花，装入吸管筒内或牛皮纸口袋中。
锥形瓶、量筒、试管塞（硅氟塑料塞），再用牛皮纸包扎。
使用的器皿应采用经验证合格的方法进行灭菌。
4、用具
大、小橡皮乳头（置干净带盖的容器中并应定期用5%来苏尔溶液浸泡），无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后用布袋或牛皮纸包严）灭菌，备用。
也可使用一次性无菌衣、帽、口罩。
接种环(白依金或镍铬合金）、乙醇（酒精）灯、乙醇棉球或碘伏锦球、灭菌剪刀、镊子或灭菌的手术刀、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔等。
二、培养基、稀释剂
除另有规定外一般使用营养肉汤琼脂培养基, 可按处方配制亦可采用干燥脱水培养基。
主要稀释剂有0. 9％无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液（供试品稀释用），0.9%无菌氯化钠溶液（对照菌稀释用）。
三、检验方法
1、试验前的准备
1）、将试验用灭菌的器皿、稀释剂及供试品外包装去掉，内包装消毒后移至无菌室内。
每
次试验所用物品必须事先计划周密，准备足够用量，避免操作中出入操作间。
2）、开启无菌室紫外线杀菌灯和空气过滤装置并使其工作30min 。
3）、操作人员用肥皂洗手，进入缓冲问，换上工作鞋。
再消毒液洗手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。
4）、用碘伏棉球或乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后，用灭菌的手术剪刀将供试品启封。
2、检查方法
1）、供试液的制备：2）、供试液的稀释（l0 倍递增稀释法）：根据微生物限度要求或对供试品污染的程度估计，选择适宜的、连续2～3个稀释级的供试液。
用1 ml 灭菌吸管吸取1 ：10供试液lml，沿管壁徐徐注入装有9ml稀释液的试管中，（注意吸管尖不要触及管内稀释液），摇匀．制备成l : l 00的供试液，另取l 支吸管同法操作制备1 : 1000 的供试液.
3）、注皿：分别用灭菌吸管吸取不同稀释级供试液各lml ，注入平皿中，每个稀释级2～3个平皿，注入溶化冷却约45℃的营养琼脂培养基15～17ml，快速转动平皿，使供试液与培养基混匀，放置，待凝，倒置培养。
除另有规定外，一般在30～35 ℃培养48h 。
若污染细菌生长缓慢可延长培养时间。
4）、阴性对照试验：
为确定试验全过程的无菌性（包括稀释剂、玻璃器皿等）应做阴性对照试验。
试验方法：取试验用的稀释剂1 ml ，置无菌平皿中，每次试验做2 个平皿，按上述细菌计数方法进行操作阴性对照平板不得有菌生长。
5）、菌落计数：从平板的背面直接以肉眼用标记笔点计，以透视光衬以暗色背景，仔细观察，计数。
必要时借助于放大镜观察。
点计菌落数后，计算稀释级的平均菌落数，若相同释级的两个平板的菌落数平均数不小于15 ，则两平板菌落数不能相差l 倍或以上。
细菌菌落形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、淡黄色、红色（如培养基中加人0 . 1%TTC试剂），菌落边缘整齐或不整齐，有放射状、树枝状、锯齿状、卷发状菌落表而有光滑、粗糙、皱折、突起或扁平，菌落大小差别很大，同一平板上可出现针尖大小至大于10mm 菌落，外观多样，小而突起或大而扁平，或石雾状，不规则。
一般营养琼脂培养基用于细菌计数；虎红培养基用于霉菌及酵母菌计数。
3、菌落报告规则
宜选取细菌平均菌落数在30～300之间的稀释级，作为菌数报告的依据。
1）、当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数报告菌数（见表9.1.1 例l )
2 )、当同时有2 个稀释级的菌落数符合上述规定时，计算二稀释级的菌落数比值（高稀释级除以低稀释级的比值），若二者比值不大于2 ，以两稀释级的菌落平均数乘以稀释倍数报告菌数；若大于2 ，但不超过5时，以低稀释级的菌落平均数乘以稀释倍数的值报告菌数（见表9.1.1例2 、例
3 )
3) 、当二者比值大于5 ，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证（见表9.1.1 例4 )
4）、当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数（见表9.1.1 例5 )
5）、如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于l 时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数（见表9.1.1 例6 )
表9.1.1细菌数报告规则举例
4、结果判断
1）、在进行菌落汁数时，应仔细观察。
勿漏计细小的、琼脂内和平皿边缘生长的菌落，同时应注意细菌菌落与供试品中颗粒、沉淀物、气泡等的鉴别。
必要时用放大镜或低倍显微镜直接观察或挑取可疑物涂片镜检。
如仍难区别，可延长培养时间5～7天，细菌菌落常会生长增大而加以鉴别。
2）、如同一稀释度二个平板菌落数超出一倍以上，不应计数，菌落蔓延成片也不应计数。
3）、若供试品测定。
其菌数结果超过标准限度规定时，应从同一批样品中随机取样，独立复试两次，以3 次测定结果的平均值结果。
根据点计结果和前数报告规则报告菌数，若供试品的细菌数超过规定的限值时，应从同一批样品中随机取样、独立复试两次，以3 次测定结果的平均数报告。
5、注意事项
l）、在培养中一些生长鞭毛的细菌具有动力，可因培养基湿度过高给动力菌造成泳动的条件，促使一些菌落蔓延生长，干扰细菌计数。
可在培养基中加入0.001%TTC抑制菌落蔓延生长或将已凝固的琼脂平板开盖，倒置100级层流下1～2h或置换经干热灭菌的陶瓦盖替代原平皿盖，可降低培养皿内水分，减少菌落蔓延生长。
2）、供试液中常会有不溶性颗粒或沉淀物存在，有时很难与菌落区分，必要时可使用放大镜或显微镜进行观察，如仍难区分，可延长培养时间或在未加TTC的营养琼脂培养基平板上加入0.001%TTC5～10ml，30min后菌落即染成深红色可与其他有形物进行鉴别。
3）、供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。
4）、在做10倍递增稀释时，每一稀释级应换l 支吸管，吸管插入稀释液内不低于2 . 5cm ,反复冲洗数次，吸液高于吸管上部刻度少许，然后提起吸管贴于容器内壁吸取1cm。
靠近液面管壁（但勿接触液面），缓慢地吹出全部供试液至第二个容器中（第一级稀释液所用吸管勿接触第二级稀释液）。
将吸管放入消毒筒内。
5）、注皿时培养基应在45℃以下，用水浴保温效果较好。
6）、从供试液制备至倾注培养基，全部操作应在1小时内完成。
避免由于时间过长造成人为的污染，细菌繁殖或死亡。
稀释液加至培养皿后，长时间末倾注培养基，稀释液边缘干涸，倾注的培养基不能与稀释液混均匀，影响菌落计数。