水中细菌总数的测定
微生物综合性实验__水中细菌总数的测定
微生物综合实验水中细菌总数的测定一、实验目的1．学习水样的采集和水样中细菌总数的测定方法。
2．了解和掌握平板菌落计数的原则。
3．复习、巩固微生物实验的各单元操作。
二、实验原理水中细菌总数的测定是进行水质检验的必要项目之一，主要作为判定饮用水、水源水、地表水等被污染程度的标志。
本试验采用平板菌落计数技术来测定水中的细菌总数。
该法是根据在固体培养基上所形成的菌落来进行计数。
菌落总数是指在一定条件下，1 mL水样所生长出来的细菌菌落的总数。
由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其它生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基和在一种条件下，使水中的所有细菌均能生长繁殖，因此，这种方法所得到的结果只是一种近似值。
目前一般采用营养琼脂培养基，在需氧条件下，37℃培养36-48 h，所得到的细菌绝大部分是腐生性的嗜中温性需氧菌和兼性厌氧菌。
三、实验材料1．检样：矿泉水等饮用水、河水、湖水、井水等。
2．培养基：营养琼脂培养基（附录Ⅱ-1.3）3．仪器与其它用具：三角烧瓶，广口瓶，吸管，培养皿，试管，培养箱等。
四、实验步骤1. 水样的采集与处理⑴饮用水：采样前，先用酒精棉球擦拭瓶口灭菌，以灭菌移液管或移液枪取水样。
⑵河水、湖水、池水：应取距水面10 cm~15 cm的深层水样。
先将已灭菌的带玻璃塞的广口瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来使瓶口向上，拔去瓶塞，待水盛满后，将瓶塞盖好，再将瓶子从水中取出。
在一定深度采水样时，需要用特制的采水器（图14-14）。
采水器是一金属框，内装玻璃瓶，其底部装有重沉坠，可按需要坠入一定深度。
瓶盖上系有一绳索，拉吊绳索即可打开瓶盖，待水样瓶中水盛满后，放松绳索，即自行盖上瓶盖。
水样采集后，将水样瓶取出，并立即用无菌棉塞或灭菌胶塞塞好瓶口，以备检验。
水样采集后应立即检验，如需要保存或运送，应采取冰镇措施，但一般要求不得超过4 h。
图14-14 采水器1-开瓶绳索2-铁框3-瓶盖4-水样瓶5-沉坠2. 细菌总数的测定⑴饮用水：①用灭菌吸管吸取0.2 mL水样，涂布于事先准备好平板中，共做2个平皿。
水中细菌总数的测定
水中细菌总数的测定在正确制备培养基的基础上，能正确运用平板接种法正确举行细菌总数的测定；把握饮用水、水源水的细菌总数测定办法、步骤和要点。
一、养分琼脂培养基(供细菌总数的测定) 称取：蛋白陈2.5g，牛肉膏0.75g, NaCl1.25g于500ml烧杯中，加150ml蒸馏水溶解，另称取琼脂5g加100ml蒸馏水溶解，待所有溶解后，混匀，加10％ NaOH，调pH =7.4～7.6，熟化1h，除垢，用棉花过滤，分装，在121℃条件下，灭菌20min，备用。
二、仪器 1．高压蒸汽灭菌器。
2．干热灭菌(烘箱)。
3．水浴隔热培养箱。
4．冰箱。
5.培养皿(直径9ml)。
6．吸管(10.0ml、1.0m1)。
三、菌落计数原则 1．一个平皿有较大片菌落生长时，不宜采纳； 2．无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的平均菌落数； 3．成片状菌落不到平皿的一半，其余一半的菌落数分布匀称，则将半皿计数×2报告之。
四、注重事项 1．检验中所用玻璃器皿应洗净后采纳干热灭菌法(160℃，2h)举行灭菌； 2．培养基的pH值调整要正确； 3．培养基配制和储存是以2周为限； 4．培养基不宜反复多次灭菌，防止pH值下降； 5．灭菌间隔时光普通不超过4h; 6．培养基如发觉产气、混浊、有菌膜、变色、有菌落、沉淀等应废弃； 7．平皿菌落计数时，肉眼观看，须要时可用放大镜，以防遗漏，计下各平皿的菌落。
[任务实施] 一、生活饮用水 1．取三个培养皿，分离是一个空白、另两个加1.0ml水样； 2．浇养分琼脂培养基(冷却至45℃～50℃，无菌操作)2～3 mm，冷却至室温、凝固后倒置； 3．在37℃，培养24小时后，观看结果并记录。
二、水源水 1．用无菌水稀释水样分离为0.1、0.01、0.001 ml的稀释比； 2．取四个培养皿，分离是空白、0.1、0.01、0.001ml的稀释比的水样加1.0ml水样； 3．浇养分琼脂培养基(冷却至45～50℃，无菌操作)2～3mm，冷却至室温、凝固后倒置； 4．在37℃，培养24h后，观看结果并记录。
实验水中细菌总数的测定
实验水中细菌总数的测定前言水是我们生活的重要组成部分，无论是生命的起源，还是人类生活和生产都与水密不可分。
但是随着工业化进程的加快，水质越来越受到污染，水中细菌总数也成为常见的水质指标之一。
本文将介绍如何进行水中细菌总数的测定实验。
实验目的1.掌握测定水中细菌总数的方法；2.熟悉细菌结构及其生长条件；3.加深对水质检测的认识。
实验原理水中的细菌一般通过卫生污染途径进入自来水、地下水、河流等水体，污染水源后就会对人们的生活、工作和生产带来很大的危害。
痢疾、霍乱、伤寒、腹泻等疾病多是由于口腔、消化系统中的有害菌群外移至消化道。
测定方法主要是基于发酵方法，通过统计水中微生物的数量，其基本依据在于微生物在适宜的温度和环境下，利用某些碳水化合物发酵而产生可测定的气体。
常用的指标为断氧时间（DT），根据氧的量来判断细菌数量的多少，一定程度上可以反映出水的卫生状况。
实验步骤1.取水样：从自来水水源处取出应检样品，需注意的是要使用无菌容器，最好是预先消毒过的。
在取水样前，最好流动5分钟以上方可取样，避免得到不实际的结果；2.加入营养元素：滤上滤膜后，再将约5ml的最少粉末培养基、4-5滴的氯化甲烷胺（1%）和约200ml无菌水混合均匀，将混合溶液倒入水样中；3.发酵过程：将水样发酵瓶通过逆时针旋紧，摇晃均匀；4.测定结果：记录下发酵瓶开始发酵的时间，水样中的气体不断地逸出，瓶内逐渐产生负压下降，直到完全断氧的时间。
断氧时间愈短，水质愈差，水中微生物愈多，反之亦然。
实验要点1.无菌取样，避免二次污染，结果更加准确；2.取样量及试剂加入的量要准确，否则会影响实验结果；3.发酵瓶要紧闭，防止气体泄漏；4.营养元素中含有的碳源、氮源等应与微生物的生长有适当的关系。
通过测定水中细菌总数，可以更加准确地判断水的卫生状况。
通过本实验的学习和操作，可以更加深入地了解微生物结构、生长条件以及水质检测的方法，具有较高的理论和实际应用价值。
介绍几种新的水中细菌总数检测方法
介绍几种新的水中细菌总数检测方法
1.流式细胞术：利用流式细胞仪将水样中的细菌进行分析和计数。
这种方法可以快速、高效地获取大量细菌数据，并且还可以进行不同种类细菌的分类和分析。
2. 基于荧光的检测方法：这种方法利用细菌表面的荧光素来进
行检测。
通过添加特定的荧光素探针，可以在短时间内快速、准确地测量水中细菌总数。
3. 基于DNA技术的检测方法：这种方法通过提取水样中的DNA，利用聚合酶链式反应(PCR)等技术来进行检测。
这种方法可以检测到
非常微小的细菌数量，而且还可以进行不同种类细菌的分子生物学鉴定。
4. 浸润法：这种方法是将一定量的水样浸润在适宜生长条件下
的培养基上，然后通过培养基上产生的菌落来计算水中细菌总数。
这种方法具有简单、易操作等特点，但是需要较长时间的培养过程。
5. QPCR技术：这种方法是一种快速、灵敏的检测细菌数量的方法，它利用荧光探针来放大和检测DNA序列。
这种方法可以在数小时内完成检测，而且可以检测不同种类的细菌。
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介绍几种新的水中细菌总数检测方法
介绍几种新的水中细菌总数检测方法近年来，随着水污染问题的加剧，水资源的保护和管理变得越来越重要，其中水中细菌总数检测是水质监测的重要指标之一。
本文将介绍几种新的水中细菌总数检测方法，以期为水质监测提供更加可靠和高效的手段。
1.高通量细菌量检测技术高通量细菌量检测技术可以同时检测多种细菌，检测速度快，可靠性高、检测方法简便。
它基于基因分析技术，将PCR技术与微孔板自动化操作技术相结合，通过多重PCR检测技术，可以在很短的时间内迅速检测出水样中的多种细菌，可以检测多达100种以上的微生物群体；与传统的培养基技术比较，减少了很多操作时间，而且可以避免细菌在营养基中生长的误差，大大提高了检测的准确性和精度。
2.荧光定量PCR技术荧光定量PCR技术是一种基于PCR技术的定量检测方法，通过特异载体或FAM（荧光素丙酸酯）依赖基因和所需定量基因并列进行扩增，可以快速、准确地测定样品中细菌的数量。
它将实时检测平台与计量分析相结合，具有检测速度快、精确、灵敏度高、标准化程度高等优点，被广泛应用于水质监测领域，是一种更为先进的具有优势的技术手段。
3.自动化细胞计数法自动化细胞计数法是一种新型的自动计数方法，基于图像处理技术和机器学习算法，同时识别并统计生长在液体中的微生物的数量和大小，具有操作简便、检测速度快、精度高、可靠性好等优点。
此方法不受培养基、肌红蛋白等耗时耗费的因素的影响，而且能够快速而准确地检测出微生物数量，对于微生物的定量和质量检测具有很高的应用价值和推广前景，已成为最具有前景的水中细菌检测技术之一。
虽然上述三种水中细菌总数检测方法在水质监测中得到了广泛应用，但仍存在一些局限性。
因此，在推广过程中需要结合实际情况，选择合适的检测方法，并根据需要进行优化，以实现更加科学、现代、高效、准确的水质监测。
微生物实验@实验10 水中细菌总数的测定
五、实验结果
记录各稀释平板上的菌落数，并计算出样品 中的细菌含量。
四、操作步骤
编号：取无菌培养皿9套，每3套为一组，在每组皿底分别 写上10-1、10-2、10-3。另取3支无菌空试管排列于试管架 上，依次标明10-1、10-2、10-3，并向试管中各加入9ml无 菌生理盐水。 稀释：用1ml无菌吸管精确地吸取1ml已充分混匀的菌悬液， 注入10-1试管中（注意吸管不要碰到水面）。然后另取1支 无菌吸管，于10-1试管中来回吹吸三次，使之混匀，即成 10-1稀释液。再从10-1试管中吸1ml注入10-2试管中，重复 上述操作，直至制成10-3稀释液。 取样：用三支1ml无菌吸管分别吸取10-1、10-2和10-3稀释 液各1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中。 倾注平板：尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入 融化后冷却至45℃左右的营养琼脂培养基，每皿约15ml， 置水平位置迅速旋转平皿，使培养基与菌液混合均匀，而 又不使培养基荡出或溅到皿盖上。 培养：待培养基凝固后，倒置于37℃恒温培养箱中培养 24h。
实验十 水中细菌 总数的测定
一、目的要求
学习水样的采取方法，检测水中细菌总数的 方法； 学习掌握平板菌落计数的原理和方法。
二、实验材料
水样 培养基：营养琼脂培养基，无菌生理盐水 1ml、10ml无菌移液管，无菌培养皿等
饮用水是否合乎标准，通常通过水中细菌总
数和大肠菌群数来确定。细菌总数是指1毫升 水样在普通琼脂培养基中，37℃24小时培养后 所生长的菌落数。一般规定，1毫升自来水的 总菌数不得超过100个。
菌落计数方法
（1）计算相同稀释度的平均菌落数 有较大片菌苔生长时，弃用；以无片菌苔生长的平皿计数。 若片菌苔大小不到培养皿的一半，其余一半分布均匀，将此 一半计数×2 （2）选择平均菌落数在30～300之间的平板 只有一个符合此范围时，以该平均菌落数乘稀释倍数。 有两个在30～300间时，按两者菌落总数比值决定：比值小 于2，取平均；比值大于2，取较小的菌落总数。 （3）所有菌落数均大于300，取稀释度最高的平均菌落数乘 稀释倍数。 （4） 所有菌落数均小于30，取稀释度最低的平均菌落数乘 稀释倍数。 （5） 所有菌落数均不在30～300之间，以最接近30或300的 平均菌落数乘稀释倍数。
生活饮用水中细菌总数的测定法平皿计数法-V1
生活饮用水中细菌总数的测定法平皿计数法-
V1
生活饮用水中细菌总数的测定法平皿计数法
测定生活饮用水中细菌总数的一种方法是平皿计数法，本文将对这种方法进行详细介绍。
一、实验原理
平皿计数法是利用细菌在液体培养基表面生长成菌落的原理，通过计算菌落个数来确定水中的细菌总数。
二、实验步骤
1. 准备培养基，将培养基倒入无菌平皿中；
2. 取样，将水样取自自来水管道或自然水源中；
3. 稀释，将取样液进行10倍、100倍、1000倍稀释，分别将每份稀释液分别均匀分散在培养基表面，避免液滴残留；
4. 写标签，标注菌落计数的相关信息，例如样品名称、稀释倍数、菌落计数的日期等；
5. 培养，将培养皿放置在恒温培养箱中，设定温度为37℃，并在3-5天内进行观察和计数。
三、实验注意事项
1. 取样应避免超过24小时，以免菌群失去代表性；
2. 取用的平皿应事先灭菌处理，以避免外来细菌的污染；
3. 实验室应有专门的抽风设备、消毒液等清洁工具，以维持实验室的高度卫生。
通过以上三个步骤，我们就可以精确地测定出生活饮用水中细菌总数。
同时，这种方法也可以应用在其他领域，例如食品安全、环境监测等
方面。
但需要注意的是，实验过程中必须遵守实验室操作规程，以保
证实验结果的可靠性。
实验10 水中细菌总数的测定
一、目的要求
❖ 学习水样的采取方法，检测水中细菌总数的 方法；
❖ 学习掌握平板菌落计数的原理和方法。
二、实验材料
❖ 水样 ❖ 培养基：营养琼脂培养基，无菌生理盐水 ❖ 1ml、10ml无菌移液管，无菌培养皿等
饮用水是否合乎标准，通常通过水中细菌总 数和大肠菌群数来确定。细菌总数是指1毫升 水样在普通琼脂培养基中，37℃24小时培养后 所生长的菌落数。一般规定，1毫升自来水的 总菌数不得超过100个。
三、基本原理
❖ 平板菌落计数法是根据在固体培养基上形成的一 个菌落是由一个单细胞繁殖而成的肉眼可见的子 细胞群体这一微生物的培养特征而设计的一种计 数方法。
❖ 将样品进行不同稀释，使微生物分散并以单细胞 存在。再用一定量的稀释液涂布于平板上，培养 后，每一个活细胞即能形成一个菌落。统计菌落 的数目，根据稀释的倍数及取样接种量即可换算 出样品中的含菌数。
❖ 倾注平板：尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入 融化后冷却至45℃左右的营养琼脂培养基，每皿约15ml， 置水平位置迅速旋转平皿，使培养基与菌液混合均匀，而 又不使培养基荡出或溅到皿盖上。
❖ 培养：待培养基凝固后，倒置于37℃恒温培养箱中培养 24h。
❖ 菌落计数方法
（1）计算相同稀释度的平均菌落数 有较大片菌苔生长时，弃用；以无片菌苔生长的平皿计数。
若片菌苔大小不到培养皿的一半，其余一半分布均匀，将此 一半计数×2 （2）选择平均菌落数在30～300之间的平板 只有一个符合此范围时，以该平均菌落数乘稀释倍数。 有两个在30～300间时，按两者菌落总数比值决定：比值小 于2，取平均；比值大于2，取较小的菌落总数。 （3）所有菌落数均大于300，取稀释度最高的平均菌落数乘 稀释倍数。 （4） 所有菌落数均小于30，取稀释度最低的平均菌落数乘 稀释倍数。 （5） 所有菌落数均不在30～300之间，以最接近30或300的 平均菌落数乘稀释倍数。
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水中细菌总数的测定
一、目的要求
l．学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。
2．了解水源水的平板菌落计数的原则。
二、基本原理
本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。
由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。
三、器材
l．培养基肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌水。
2.仪器或其他用具灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
四、操作步骤
l．水样的采取
(1)自来水先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流
5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。
(2)池水、河水或湖水应取距水面l0～15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。
2．细菌总数测定
(1)自来水
①用灭菌吸管吸取lml水样，注入灭菌培养皿中。
共做两个平皿。
②分别倾注约15mL己溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。
③另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL作空自对照。
④培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养24h，进行菌落计数。
⑤两个平板的平均菌落数即为lml水样的细菌总数。
(2)池水、xx或xx等
①稀释水样取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。
取lml水样注入第一管9ml灭菌水内、摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-
1、10-2与10-3。
稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30～300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。
一般中等污秽水样，取10-
1、10-
2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-
2、10-
3、10-4三个连续稀释度。
②自最后三个稀释度的试管中各取lmL稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。
③各倾注15ml已溶化并冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。
④凝固后倒置于37℃培养箱中培养24h。
3．菌落计数方法
(1)先计算相同稀释度的平均菌落数。
若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。
若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。
(2)首先选择平均菌落数在30~300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数(见表26-1，例1)。
(3)若有两个稀释度的平均菌落数均在30～300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。
若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数(见表26-l，例2及例3)。
(4)若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数(见表26-l，例4)。
(5)若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数(见表26-l，例5)。
(6)若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数(见表26-1，例6)。
五、实验报告
1．结果
（1）自来水
（2）池水、xx或xx等
2．思考题
（1）从自来水的细菌总数结果来看，是否合乎饮用水的标准？
（2）你所测的水源水的污秽程度如何？
（3）国家对自来水的细菌总数有一标准，那么各地能否自行设计其测定条件（诸如培养温度，培养时间等）来测定水样总数呢？为什么。