交联温度对京尼平交联胶原壳聚糖组织工程支架的影响

交联温度对京尼平交联胶原/壳聚糖组织工程支架的影响来源：中国论文下载中心 [ 10-05-04 09:57:00 ] 编辑：studa20作者：曹峥，胡蕴玉，潘纬敏，白雪东，毕龙，李丹，杨小彬，刘民【摘要】[目的]通过研究材料的孔径、交联度、溶胀率、降解率、细胞毒性及组织相容性的变化，探讨交联温度对京尼平交联胶原/壳聚糖支架的影响。

[方法] 采用冷冻干燥法制备胶原/壳聚糖复合多孔支架，分别于4℃、20℃、36℃条件下，在0.5%京尼平水溶液中交联24 h。

以未交联的胶原/壳聚糖复合多孔支架作为对照，评价所得支架的孔径、交联度、溶胀率、降解率、细胞毒性及组织相容性特点。

[结果]随交联温度升高，支架的交联度明显增大，溶胀率和降解率逐渐减小。

4℃组支架交联度47.88%±6.4%，溶胀率为721%±46%，4周后降解3.95%±6.4%;20℃组支架交联度67.69%±3.6%，溶胀率为662%±72%，4周降解0.91%±5.9%;36℃组支架交联度70.32%±5.7%，溶胀率为635%±27%，4周降解0.66%±7.3%，三组上述观察指标均优于未交联组(P/0.01)。

[结论]京尼平交联可以显著降低胶原/壳聚糖支架的降解率和溶胀率，且对支架结构和生物相容性无明显影响。

交联温度增加可以提高支架的交联度和抗降解能力，较快获得具有良好生物相容性和降解率的组织工程支架。

【关键词】交联温度; 壳聚糖; 胶原; 京尼平; 组织工程Abstract: [Objective]To investigate the changes of pore sizes,crosslinking index,swelling ration,degradation rate,cytotoxicity and biocompatibility of genipin crosslinked collagen/chitosan scaffolds affected by the different crosslinking temperature points.[Method]The freeze-dried collgaen/chitosan scaffolds crosslinked with 0.5% genipin within 24 h were divided into 3 groups by crosslinking temperature:4℃group,20℃group and 36℃group.The characteristics of pore sizes,crosslinking index,swelling ratio,degradation rate,cytotoxicity and biocompatibility were evaluated.Collagen/chitosan scaffolds without crosslinking were chosen as controlgroup.[Result]With the increase of temperature,crosslinking index was increased,but swelling ratio and degradation rate were decreased.In 4℃group,the crosslinking index was47.88%±6.4%,the swelling ratio was 721%±46%,and the degradation rate was decreased by3.95%±6.4% at 4 weeks.In 20℃group,the crosslinking index was 67.69%±3.6%,the swelling ration was 662%±72%,and the degradation rate was 0.91%±5.9% in 4 weeks.In 36℃group,the crosslinking index was 70.32%±5.7%,the swelling ration was 635%±27%,and the degradation rate was 0.66%±7.3% at 4 weeks.The above indexes of the three groups were much better than thoseof control group(P<0.01).[Conclusion]It was indicated that the swelling ratio and degradation rate of the collagen/chitosan scaffolds are significantly decreased by genipin without any obvious change of pore sizes and toxicity.The biocompatibility and degradation rate of this tissur engineering scaffold can be well obtained with genipin by increasing crosslinking temperature within 24 h.Key words：crosslink temperature; chitosan; collagen; genipin; tissue engineering胶原因其良好的组织相容性和可降解性被广泛用于组织工程研发领域。

但由于其机械强度不足，在体内水解过程中不能保持空间构型，且吸收过快，因此，在应用时常加入壳聚糖等成分，以提高支架的弹性模量、临界形变和强度[1]。

交联可进一步提高支架的机械强度和抗蛋白酶降解的能力。

但物理交联法交联度较低且不均一，而化学交联法采用戊二醛、甲醛等传统的交联剂，易引起中毒或不良反应。

京尼平是一种提取自栀子果实的天然交联剂，其毒性远远低于传统的化学交联剂。

细胞实验表明其毒性低于戊二醛104倍，而细胞增殖能力高于戊二醛组5×103倍[2]。

但是既往对于京尼平的研究多集中于单一材料，且多关注交联时间及交联剂浓度对于材料交联的影响，而观察交联温度对京尼平交联复合支架影响的研究未见报道。

本实验拟通过观察支架孔径、交联度、降解率、溶胀率、细胞毒性及组织相容性的变化，探讨交联温度对京尼平交联胶原/壳聚糖复合支架的影响。

1 材料与方法1.1 材料与仪器壳聚糖(WOLSEN)，鼠尾胶原，京尼平(和光纯药工业株式会社)，甘氨酸(solarbio)，冰醋酸、异丙醇、乙二醇甲醚、茚三酮均购自国药集团化学试剂有限公司。

DMEM培养基(gibco)，胎牛血清(hyclone)，胰蛋白酶(sigma)，冷冻干燥机(CHRIST)，倒置相差显微镜(nikon)，分光光度计(HITACHl)，扫描电镜(HITACHl)。

1.2 多孔支架的制备及交联配制0.2 mol/L的醋酸溶液，分别称取一定质量的壳聚糖和胶原粉末，将其完全溶解于稀醋酸溶液中，静置脱除溶液中的气泡。

将两种溶液按一定比例混合，充分搅拌混合均匀。

将胶原、壳聚糖混合液注入模具中，置于冷冻柜中-20℃冷冻成型，样品完全冻结后冷冻干燥12 h，制得胶原/壳聚糖复合支架。

将上述支架于风箱中挥发残留醋酸后，置于0.5%的京尼平水溶液中，分别于4℃、20℃、36℃交联24 h后，蒸馏水冲洗后置于饱和甘氨酸溶液中浸泡，换液至溶液不再变色后用蒸馏水反复冲洗，重新冷冻干燥。

1.3 扫描电镜观察将样品裁剪成直径4 mm高2 mm大小的小片，真空喷金后，扫描电镜观察表面结构和孔径变化，选择合适的放大倍数拍摄扫描照片。

1.4 交联度测定参照Mi的方法采用茚三酮法测定交联度[3]。

具体为：①1.05 g的柠檬酸和10 ml(1.0 mol/L)的NaOH和0.04 g的氯化亚锡(SnCl2·2H2O)混合，加去离子水调至25 ml，另将1 g的茚三酮加入25 ml乙二醇甲醚中，再将上述两液体混合搅拌45 min，制成茚三酮溶液，避光保存。

②称取样品，加入4 ml茚三酮溶液，100℃水浴20 min，冷却至室温，加20 ml 50%异丙醇溶液，用分光光度计在570 nm下测量吸光度。

用甘氨酸溶液做标准曲线，并通过此标准曲线查找各样本中自由氨基酸的摩尔数。

所有反应均在暗室进行。

以Mo表示未加京尼平的相应支架中含自由氨基酸摩尔数，Mt表示各组交联样品中氨基酸摩尔数，按以下公式计算各组材料的交联度：交联度=(Mo-Mt)/Mo×100%。

1.5 降解率测定各组受试材料分别称重(Wo)，将材料放回离心管中封装好，环氧乙烷消毒，然后加25 ml PBS溶液，3 d换液1次，1，2，4周取出，蒸馏水反复冲洗后再次冻干后称重(Wt)。

降解率=(Wo-Wt)/Wo×100%。

1.6 溶胀率测定称取支架在干态时的质量为Wo，然后将支架在PBS中浸泡24 h后小心取出，用滤纸吸干表面的水分，称重为Wt，则支架溶胀率=(Wt-Wo)/Wo×100%。

1.7 细胞毒性实验将京尼平交联的胶原/壳聚糖切成直径4 mm高2 mm大小，Co60照射消毒。

参照胡声锁等的方法制备兔成体脂肪干细胞[4]，消化状态较好处于对数生长期的兔脂肪干细胞调整浓度至1×106/ml，负压接种于支架上，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下孵育4 h后将细胞支架复合体置入96孔板，每孔加入培养液200 μl，设为实验组。

将细胞以密度为1×104/ml 直接接种于96孔板，每孔200 μl，设为对照组。

另将单纯材料加入96孔板，每孔加入培养液200 μl，设为实验调零组，空白孔加入培养液200 μl，设为对照调零组。

在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下孵育，培养液继续培养，隔天换液。

培养1、3、5、7、14 d MTT法检测细胞活力，实验组、对照组分别以对应的调零组调零，以计算其相对增殖率，评价细胞毒性。

1.8 组织相容性实验新西兰兔6只(体重1.5～2 kg)，速眠新Ⅱ肌注麻醉后，无菌条件下切开双侧股部皮肤，分离肌肉组织，每侧分别植入支架材料，不可吸收缝线缝合，观察动物术后一般情况和伤口情况，于手术后2周、4周后处死动物，取材料连同周围组织，10%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色光镜观察。