氯化钙法制备感受态
wb800n感受态制备方法
制备感受态细胞的方法制备感受态细胞是分子生物学实验中常见的一项技术，用于将外源 DNA 导入细胞中，并在细胞内表达。
制备感受态细胞的方法有很多种，其中最常用的是氯化钙法和电转化法。
1. 氯化钙法氯化钙法是制备感受态细胞的常用方法之一。
该方法的原理是利用氯化钙处理细胞，使细胞膜通透性增加，从而使外源 DNA 能够进入细胞内。
操作步骤如下：1) 将细胞菌落挑取到含有氯化钙的缓冲液中，并在室温下处理10-20 分钟。
2) 将处理后的细胞放入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。
3) 将培养后的细胞收集到离心管中，并离心沉淀。
4) 去除上清液，将沉淀物加入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。
5) 重复步骤 3 和 4，直至细胞达到适当的浓度。
2. 电转化法电转化法是另一种制备感受态细胞的方法，该方法的原理是利用电场将外源 DNA 导入细胞内。
操作步骤如下：1) 将细胞菌落挑取到含有适当抗生素的培养基中，并在37°C下培养 1-2 小时。
2) 将处理后的细胞放入电转化仪中，并施加适当的电场。
3) 将细胞暴露在外源 DNA 中，并在室温下处理 10-20 分钟。
4) 将处理后的细胞放入含有适当抗生素的培养基中，并在37°C 下培养 1-2 小时。
5) 重复步骤 3 和 4，直至细胞达到适当的浓度。
在制备感受态细胞的过程中，需要注意以下几点：1) 氯化钙法和电转化法的操作步骤较为复杂，需要严格遵守操作规程。
2) 制备感受态细胞时，需要选择适当的抗生素，以避免细胞污染。
3) 在进行电转化时，需要选择适当的电场强度和处理时间，以避免细胞损伤。
4) 制备完成后，需要对感受态细胞进行鉴定，以确保其能够表达外源 DNA。
氯化钙制备大肠杆菌感受态细胞
氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞实验原理转化是将外源基因引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性改变，成为允许外源DNA分子进入的状态，这种细胞称为感受态细胞。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（即带有异源DNA分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl 法。
制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油，并于-70℃保存。
本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温，实现转化。
由于pUC18质粒带有氨苄青霉素抗性基因（Amp）,可通过Amp抗性来筛选转化子。
如受体细胞没有转入pUC18，则在含Amp的培养基上不能生长。
能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了pUC18。
转化子扩增后，可将转化的质粒提出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。
实验方法一、材料DH5a菌种（生工），3ml不含抗生素的LB液体培养基，100ml不含抗生素的LB液体培养基，盐酸，三羟甲基氨基甲烷（Tris碱），CaCl2，2块氨苄抗性LB固体培养基，2块卡纳抗性LB固体培养基，2块无抗性LB固体培养基,甘油。
二、设备移液枪(20μl,200μl,1000μl)，50ml离心管4支，对应离心管转子，0.45um针头滤器，30ml注射器，烧杯，量筒，容量瓶，锥形瓶，冰浴。
三、试剂准备1. LB培养基300ml：胰化蛋白胨3g，酵母提取物1.5g，NaCl3g，290ml去离子水，加入10mol/L NaOH，每次5μl，比对PH试纸至PH7.0左右。
1) 分装出100ml LB液体培养基（不含抗生素）。
氯化钙法制备感受态细胞原理
氯化钙法制备感受态细胞原理1. 了解感受态细胞1.1 什么是感受态细胞？好啦，首先咱们得搞清楚什么叫“感受态细胞”。
简单来说，这种细胞就像是打了鸡血的年轻人，随时准备接受外界的挑战。
它们能吸收外来的DNA，就像海绵吸水一样，真是个“好学生”啊！这在基因工程和克隆技术中可是个大角色。
1.2 为啥要制备感受态细胞？那么，咱们为什么要制造这些细胞呢？想想吧，想把外来的基因塞到细胞里，就得让这些细胞有能力“接受”这些信息。
而氯化钙法就是个好帮手，让细胞变得更“友好”。
一旦细胞“接受”了外来的DNA，后面就能大展拳脚，生产咱们需要的各种蛋白质，真是太棒了！2. 氯化钙法的原理2.1 氯化钙的角色接下来，咱们来聊聊氯化钙的神奇之处。
它就像个“催化剂”，帮助细胞的膜变得更加通透。
要知道，细胞膜可不是随便就能让东西进来的，这可得讲究技巧。
氯化钙通过改变细胞膜的电位，让细胞“开门迎客”，让外来的DNA能顺利进来。
2.2 制备过程制备感受态细胞的过程其实也蛮有趣的，像是做一顿大餐，得准备好所有的食材。
首先，咱们需要培养一些细胞，让它们长得壮壮的。
接着，拿氯化钙溶液把这些细胞“泡”一下，时间可不能太长，否则细胞就变得“过于紧张”，容易出事。
然后，把细胞和DNA混在一起，稍微摇一摇，让它们互相“认识”。
最后，再给它们一个“热身”，放到37度的环境中，让它们慢慢适应，这样就能提高DNA的吸收率了。
3. 注意事项3.1 细胞的选择不过，制造感受态细胞并不是一帆风顺的，选择合适的细胞可是个技术活。
不同的细胞对氯化钙的反应可不一样，有些可能会对你说“谢谢，不用了”，而有些则会欢呼雀跃，接受外来的DNA。
所以，选择细胞时可得好好研究，别瞎撞。
3.2 实验环境此外，实验环境也很重要。
实验室就像是一个小宇宙，必须保持整洁和稳定。
温度、湿度、气体成分，这些都得像对待女朋友一样小心翼翼，稍有不慎，细胞就可能“罢工”。
所以，千万别小看这些细节，搞不好就得重头再来，真是得不偿失。
制备感受态细胞(CaCl2法)(Jin Lab)
Preparation of competent E.coli cells for transformation(CaCl2 Method)[Jin Quan-Wen Lab at XMU, Adapted from “Molecular Cloning 3”]1.取感受态细胞于无抗生素的LB培养基上划线以获得单菌落，于37℃培养;2.次日，挑取单菌落，接种于5 ml液体LB中，37℃，摇~24 hr;3.将以上preculture接种于三个盛有200 ml SOB培养液的1 L锥形瓶中，分别按1：50、1：100、1：200的比例稀释，于18-22℃摇床过夜。
次日，测定三瓶培养物的OD600，达到0.5-0.55即可;4.将该瓶培养物置于冰上10 min，后于4℃以3900 rpm离心10 min收集菌体;5.弃去上清，离心管倒扣于吸水纸上以吸干剩余液体;6.加80 ml预冷的Inoue转化缓冲液重悬菌体（注：切勿使用振荡器或吹吸混匀，以Inoue缓冲液轻轻冲刷管壁，缓慢摇动即可）;7.4℃3900rpm 10min 收菌;8.弃去上清，离心管倒扣于吸水纸上以吸干剩余液体;9.以体积为20 ml预冷的Inoue缓冲液重悬所有菌体;10.加入1.5 ml DMSO，混匀，冰浴10 min;11.按40、80及120μl体积分装; 在液氮中快速冷冻后，于-70 C冰箱中保存。
12.以已知浓度的质粒转化细胞，涂板并计算菌落数，以检测转化效率。
可转化0.1 ng、1 ng及5 ng三个梯度，最后的转化克隆数应该是线性的。
计算公式：转化效率[cfu/μg DNA] = 产生菌落的总数/ 铺板的DNA的总量转化效率1×106 cfu/μg DNA: 可用于普通的亚克隆实验;转化效率1×107 cfu/μg DNA: 可用于更复杂的亚克隆，有限量DNA的转化，T-克隆实验;转化效率>1×108 cfu/μg DNA: 可用于构建文库和突变要求用的转化。
感受态细胞的制备(氯化钙法)
感受态细胞的制备（氯化钙法）
（1）将-80℃保存的甘油管E. coli DH5α进行活化，在LB固体培养基平板上划线，平板倒放于37℃恒温培养箱中，过夜培养12-16 h；
（2）从平板上挑取单菌落接种于5 ml液体LB试管培养基中，37℃振荡培养过夜；
（3）按1%-5%的比例将种子菌液接种于100 ml新鲜的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.6-0.9（一般按照2%的接种量培养3 h即可）后放置于冰上使其冷却以终止其快速生长；
（4）将菌液转入50 ml离心管中，在冰上放置10 min，于4℃低温离心机以6000 rpm/min 的速度离心10 min，收集菌体；
（5）弃上清，加入1/10体积（10 ml）预冷的感受态制备液buffer 1，用移液枪轻轻吹打使菌体重新悬浮，谨记吹打过程中切忌用力过大以免破坏菌体细胞，冰浴10 min；
（6）冰浴后再次于4℃低温离心机中以6000 rpm/min离心10 min，弃上清后在冰上加入2 ml 预冷的感受态制备液buffer 2重悬菌体，最后将细胞按100 ul/cell分装，取100 μl制备进行转化实验，检测其转化效率，剩余的放置于-80℃低温冰箱保存，半年之内可用，超过后转化效率会有所下降。
感受态细胞制备及各种感受态的特点
感受态细胞制备制备感受态常用的方法是电击法和CaCl2制备法，以下介绍CaCl2制备法：1、可以从-80℃冰柜中，取出一支冻存菌株，于事先照过紫外的超净台中，用无菌的接种环轻轻蘸取菌种后，在无抗平板（由于Rocetta含有氯霉素抗性，需要涂布在氯霉素抗性的平板，后面的都是如此）上划线，并将菌种迅速放回-80℃保存，在划线板上做好相应标记，于37℃培养过夜。
2、从37℃培养过夜的新鲜平板上挑取一个单克隆，接种于2mlEP管中，37℃，220rpm震荡培养约6个小时至对数生长中后期；将该菌悬液以1:100的比例接种于50ml LB液体培养基（2瓶）中,37℃振荡培养2.5小时至OD600=0.5。
注意：接种比例不得大于1:10。
3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、预冷的离心管（50ml）中，在冰上放置5~10min；注意：划板、接种为了防止意外发生最好多划一块平板和多接一根试管，划板、接种、转接均要严格按照无菌操作。
4、4℃ 5000g离心5分钟。
用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃ 5000g离心5分钟；Note：此步主要是为了洗去培养基中的盐等5、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟，4℃5000g 离心5分钟；6、沉淀加入2ml预冷的0.05mol/L CaCl2-15%甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞悬液。
分装成50~100μl的小份，贮存于-70℃可保存半年。
含15%甘油的0.05mol/L CaCl2制备方法:称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。
感受态细胞的特征感受态：通过特殊处理使细胞处于能够吸收外源DNA的状态。
感受态细胞的特征：（1）细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点（以溶菌酶处理，可促使受体细胞的接受位点充分暴露）。
（2）细胞膜通透性增加（用钙离子处理，可使膜通透性增加，使DNA直接穿过质膜进入细胞）。
用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞
用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞，方法如下：①从野生Top10平板上挑取单菌落，接种于3ml LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；②以1%的接种量转接于20-40ml的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD值为0.3-0.4时，将菌液置于冰浴中至少30分钟（目的：抑制大肠杆菌生长）③于4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀重悬于20ml预冷的0.1mol/L中，冰浴放置40分钟；CaCl2④4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl（含210%甘油）重悬细胞，以每管100-200µl分装备用。
不及时使用的各管于-80℃保存。
注：细胞重悬时动作要尽量轻柔，切忌用枪吹打。
新鲜感受态不立即使用-80度冻几小时后再用效果可能会更好（2）热激转化感受态取感受态细胞，加入外源连接产物，轻轻混匀，冰浴30分钟混合物放入42C循环水浴中，90秒-2分钟立刻转到冰浴，冷却2分钟加入900UL培养基，37温育45-60分钟10000rmp离心半分钟，弃上清，留100-200ul混匀后均匀涂在含相应抗生素的琼脂平板上，倒置平皿，37培养过夜，菌落长出。
注：转质粒加入质粒1-2ul即可，且无须加800ul培养基孵育,热击冷却后直接涂板。
原理：其原理是：细菌处于0℃氯化钙低渗溶液中，细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面；经42℃短时间热休克处理，促进细胞吸收DNA复合物。
在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
被转化的细菌中，重组的基因得到表达，在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化因子。
感受态制备
氯化钙法制备JM109感受态细胞（屡试不爽，研究生亲身经历）
从超低温冰箱取甘油种，平板划线活化过夜
1. 从平板上挑取单菌落洗入3ml 的LB培养基，37度摇菌过夜
2. 按1%的量接种50ml 的LB培养基，摇菌到对数中期，2.5-3 h，此时培养基中的细菌呈云雾状，状态是最好的，或者OD值0.4-0.6
3. 将细菌分别转移到两个已灭菌的，已预冷的50 ml的圆底离心管中，冰浴10min，使菌液冷却至0℃
4. 收菌，4℃，10000rpm，10min，弃掉上清液，将离心管倒置于干净的滤纸上1min，使最后的痕量培养基流尽
5. 每50ml的初始培养物用30ml的预冷的0.1M的CaCl2溶液重悬，4℃，10000rpm，10min，弃掉上清液，将离心管倒置于干净的滤纸上1min，使最后的痕量培养基流尽
6. 每50ml的初始培养物用2ml的预冷的0.1M的CaCl2溶液重悬，记住用枪吹打的时候，动作一定要轻，因为感受态细胞是很脆弱，操作基本上都要在冰上
7. 加入等体积的预冷的30%的灭菌甘油水溶液，混匀后按100 μL/管（已预冷1.5ml的EP 管）在冰上分装，-80度保存备用。
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一、我制氯化钙法感受态的步骤：
1) 取大肠杆菌单菌落接种于2 ml LB液体培养基中，37 ℃200 rpm过夜培养；
2) 取0.5 ml菌液接种于50 ml LB液体培养基中，37 ℃200 rpm培养2.5 h （OD600nm
介于0.4-0.5）；
3) 菌液倒入冰浴预冷的50 ml离心管中，冰浴20 min，随后利用台式冷冻离心机在4 ℃
以4100 rpm转速离心10 min，弃上清，在超净台中预先紫外照射灭菌的卫生纸上倒置
1 min；
4) 50 ml离心管中加入30 ml冰浴预冷的0.1 M CaCl2，涡旋振荡重悬浮细菌，冰浴30 min，
4 ℃以4100 rpm转速离心10 min，弃上清，在超净台中预先紫外照射灭菌的卫生纸上
倒置片刻；
5) 离心管中加入2 ml冰浴预冷的0.1 M CaCl2，涡旋振荡重悬浮细菌，以滴管分装，
滴加2滴（约100 μl）于每个1.5 ml EP管中，冰浴放置，以备马上使用，余下加入甘油，使甘油终浓度约15%，同上分装于1.5 ml EP管中，-20 ℃冻存（-80冰箱存更好，但咱舍不得总去开它），冻存感受态可在一周内使用（转化效率将随保存时间延长而有所下降）。
需要注意的是：氯化钙经常是水合物，你得看清楚你用的氯化钙水合物的分子量，然后再换算。
氯化钙溶液是过滤除菌的，使用液用前需要预冷。
另外，要是总弄不好也可以买商业化的感受态，不贵。
热激法转化大肠杆菌
1) 将质粒5 μl （这个不固定，根据你质粒浓度调整即可）加入到新制的感受态中，轻
柔旋转EP管以混合，置冰浴30 min；
2) 随后静置于42 ℃水浴90 s，之后迅速置于冰中2 min；
3) 加入895 μl（凑个1ml的总体积，其实多点少点没啥的）LB液体培养基，37 ℃水
浴45 min（摇床也行，但是转速要在50rpm内，太快了容易让质粒丢失）；
4) 将水浴后的转化菌液取200 μl滴加于含抗生素的LB琼脂板，并用涂布棒涂布均匀；
6) 余下菌液以4100 rpm离心2 min，倾倒上清，以残留的培养基（~200 μl）混悬细菌，
滴加于上述琼脂板，并用涂布棒涂布均匀；
7) 待菌液被完全吸收后，倒置培养皿，并放于37 ℃温箱过夜培养至菌落长到合适大
小。
二、制电击感受态的步骤（摘自cDNA文库组标准流程，大肠杆菌我很少用电转，主
要是连接产物懒得纯化）：
1. 用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。
（同时做
培养基和枪头的空白对照）
2. 37℃，220rpm，培养14-16个小时。
3. 第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，
振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。
4. 将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm
离心10分钟。
5. 弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm
离心10分钟。
6. 弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。
7. 弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃,
4000rpm, 离心10min。
8. 弃上清，每个离心杯中加入5ml10％的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装
于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。
同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。
9. 次日观察转化子生长情况，并记录。
感受态成功的关键在于：
1，试剂要冷，一直在冰上操作
2，吹细胞动作要轻柔
3，菌活力要足，一定要选对数期的菌进行
4，每次转化完成后用质粒验证
BL21是表达菌，直接转入质粒，灵敏度应该很高的。