医学核酸与分子标志物
临床分子生物学检验
第1～6章1、现代分子生物学的开端：1953年，Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构，标志着现代分子生物学的兴起，为揭开人类生命现象的本质奠定了基础。
2、临床分子生物学检验：是分子生物学技术在临床检验诊断应用中发展起来的，以疾病为中心、以生物分子标志物为靶标的新一代临床检验诊断技术，是临床分子生物学的重要组成部分。
3、应用到临床的分子标志物包括基因组DNA、各种RNA、蛋白质和各种代谢物。
4、分子标志物：是指可以反映机体生理、病理状态的核酸、蛋白质（多肽）、代谢产物等生物分子，是生物标志物的一种类型。
5、核酸分子标志物包括：基因突变，DNA多态性，基因组DNA片段，RNA和循环核酸等多种形式。
6、DNA一级结构（直径，两个碱基之间的距离，一个螺距，一个螺旋有多少个核苷酸）：DNA一级结构就是指各核苷酸单体沿多核苷酸链排列的顺序。
7、DNA二级结构（右手螺旋—B型最常见，左手螺旋—Z型）：DNA的二级结构是双螺旋结构，主要特征是①主干链反向平行：DNA分子是一个由两条平行的脱氧多核苷酸链围绕同一个中心轴盘曲形成的右手螺旋结构，两条链行走方向相反，一条链为5’→3’走向，另一条链为3’→5’走向。
磷酸基和脱氧核糖基构成链的骨架，位于双螺旋的外侧；碱基位于双螺旋的内侧。
碱基平面与中轴垂直。
②侧链碱基互补配对：两条脱氧多核苷酸链通过碱基之间的氢键连接在一起。
DNA双螺旋的直径为2nm，一圈螺旋含10个碱基对（一个螺旋有20个核苷酸），每一碱基平面的轴向距离为0.34nm，故每一螺距为3.4nm，每个碱基的旋转角度为36°。
8、DNA三级结构（真核生物DNA三级结构是染色质或染色体）：DNA双螺旋进一步盘曲形成更加复杂的结构，称为三级结构。
超螺旋是DNA三级结构的最常见的形式。
9、真核生物的DNA形成染色质的包装过程（4步）：①形成核小体：构成染色质的基本单位是核小体。
核小体由核小体核心和连接区组成。
第三章 核酸分子生物标志物
第三章核酸分子生物标志物
一、学习目标
掌握分子生物标志物、核酸分子生物标志物的概念及分类；基因突变的类型；基因多态性的类型。
熟悉转录产物分子生物标志物；线粒体DNA分子生物标志物；循环核酸分子生物标志物。
了解核酸分子生物标志物的临床应用。
二、重点和难点内容
（一）分子生物标志物
是生物标志物的一种类型，是指可以反映机体生理、病理状态的核酸、蛋白质（多肽）、代谢产物等生物分子。
（二）DNA分子标志物
1. 基于基因突变的分子标志物包括点突变（错义突变、无义突变和RNA加工突变）、插入/缺失突变（包括移码突变）和动态突变等。
点突变也称为碱基置换，是指单个碱基的改变，在引起人类遗传性疾病的点突变中包括错义突变、无义突变、RNA加工突变以及发生在调控区的突变等。
插入/缺失突变分为小片段和大片段插入/缺失，小片段突变指的是在1～60个碱基范围内的改变，而大片段的插入/缺失甚至可以在染色体水平上检测到。
动态突变是指三核苷酸的重复次数可随着世代交替的传递而呈现逐代递增的累加突变效应的突变形式。
2. 基于基因多态性的分子标志物包括限制性片段长度多态性、小卫星和卫星多态性、单核苷酸多态性和拷贝数多态性。
限制性片段长度多态性是第一代DNA分子标记；小卫星和微卫星多态性是属于第二代的DNA分子标记；单核苷酸多态性，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
它是人类可遗传的变异中最简单、最常见的一种。
拷贝数变异指的是基因组中较大的DNA片段发生了拷贝数的变化，可以涉及一个基因，也可以是连续的几个基因，相当于染色体的某个区域发生了复制或缺失的改变。
分子生物学——精选推荐
分子标志物：指可以反映机体生理、病理状态的核酸、蛋白质（多肽）、代谢产物等生物分子。
DNA结构：DNA的二级结构是双螺旋结构：DNA分子由两条相互平行但走向相反的脱氧多核苷酸链组成，两链以-脱氧核糖-磷酸-为骨架，以右手螺旋方式绕同一公共轴盘。
螺旋直径为2nm，形成大沟(major groove) 及小沟(minor groove)相间。
碱基垂直螺旋轴居双螺旋内側，与对側碱基形成氢键配对（互补配对形式：A=T;G=C）。
相邻碱基平面距离0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10对碱基。
DNA的三级结构是超螺旋结构：DNA双螺旋链再盘绕即形成超螺旋结构。
正超螺旋(positive super coil)盘绕方向与DNA双螺旋方同相同负超螺旋(negative super coil)盘绕方向与DNA双螺旋方向相反。
原核生物DNA的是环状超螺旋结构核小体(nucleosome)是染色质的基本组成单位，由DNA和蛋白质构成。
组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4 RNA结构：一级结构：核苷酸连接方式同DNA。
RNA的一级结构即指核苷酸的连接方式、数量和排列方式。
主要结构特征：①含有稀有碱基（修饰碱基）；②不遵守Char gaff原则；③多数为单链分子，形成链内双链二级结构（发夹结构）；④碱基配对：A-U，G-C。
t RNA二级结构：DHU环反密码环额外环 TΨC环氨基酸臂t RNA的三级结构是倒L型t RNA的功能：活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。
m RNA的结构与功能:1）基本特点：含量低（约占总RNA的1%～5%）；种类多（上万种）；分子大小差异大（几百～约2万个核苷酸）；半衰期短。
2）结构特点：编码区——决定蛋白质的一级结构，包括起始密码子、终止密码子、外显子。
非编码区——与蛋白质生物合成的调控有关，包括5′非编码区（帽结构、核蛋白体识别结合位点等）、3′非编码区（多聚腺苷酸尾）、间隔序列（内含子）。
疾病生物标志物的筛选与鉴定
疾病生物标志物的筛选与鉴定近年来，随着生命科学技术的不断发展，疾病生物标志物的筛选和鉴定越来越受到关注。
生物标志物是指在生物学上可测量的物质或过程，可指示疾病状态、生理或病理过程的存在或进展。
研究表明，各种疾病都会引起体内某些生物标志物的变化，可以通过检测这些生物标志物来确定疾病的程度、类型和预后等信息。
因此，寻找和鉴定生物标志物已成为疾病诊断和治疗的重要手段。
一、生物标志物的种类生物标志物包括分子生物标志物、细胞生物标志物、基因生物标志物、影像生物标志物等。
其中，分子生物标志物是疾病生物标志物研究的主要方向。
分子生物标志物包括蛋白质、核酸、代谢产物等。
蛋白质生物标志物是目前最多应用的生物标志物之一，具有操作简单、稳定、高灵敏度等优点。
目前已发现的蛋白质生物标志物包括白蛋白、谷氨酰胺转肽酶、C-反应蛋白等，它们在癌症、心血管疾病、感染性疾病等多种疾病的诊断和治疗中发挥了重要的作用。
二、生物标志物的筛选方法生物标志物的筛选是一个复杂的系统工程，需要从分子、细胞、组织、器官、系统多个层面进行研究。
一般来说，筛选生物标志物的方法包括生物信息学分析、高通量技术、系统生物学等多种手段。
1. 生物信息学分析：生物信息学分析是一种通过对大规模生物信息数据进行分析来识别潜在生物标志物的方法。
生物信息学分析主要包括差异表达分析、通路分析和功能注释等。
差异表达分析是指比较不同样本组织或细胞中的基因、蛋白质、代谢产物等分子表达水平的差异。
通路分析是指通过对差异表达基因进行分类和注释，进而确定影响生物标志物变化的通路和生物学过程。
功能注释是指将差异表达基因注释为已知生物学功能或疾病相关性的基因。
2. 高通量技术：高通量技术是指以DNA芯片、蛋白芯片、RNA测序等高通量技术为基础进行大规模分子生物学研究的方法。
高通量技术具有操作简便、高通量的特点，可同时检测成千上万个生物分子，从而快速找到具有生物标志物特征的分子。
3. 系统生物学：系统生物学是一种综合性和系统性的生物学研究方法，主要包括建模、仿真和实验验证等多个阶段。
第四节 核酸分子标志物
（五）线粒体DNA
• 人类线粒体基因组DNA是一个长为16,569 bp的双链闭合环状分子，编码37个基因。
• mtDNA突变与多种母系遗传疾病有关，可 作为分子标志物。
• mtDNA损伤是导致氧化磷酸化（OXPHOS） 功能紊乱的主要原因之一，随着体细胞 mtDNA突变的不断积累，当OXPHOS功能 紊乱达到某一阈值时，表现出线粒体疾病。
HBB基因突变
• 正常成人的血红素是 由两条α-肽链和两条 β-肽链所构成。
• 镰形细胞贫血症患者 的α-链完全正常，但 β-链的DNA序列在起 始端的第20位核苷酸 发生点突变，由原來 的GAG-变为-GTG（A->T），则在翻译 时，β-链近N 端的第 6位氨基酸由谷氨酸>缬氨酸。
BRCA1基因突变
• BRCA1基因定位于17q21，约 100个kb，BRCA1编码蛋白的 N末端序列含有一环状结构域， 能够与BRCA1相关蛋白结合。
• 野生型BRCA1基因属于抑癌 基因， BRCA1基因突变使其 具有的抑癌功能受影响，已发 现的BRCA1/2的突变有数百种 之多，其中有BRCA1基因突 变者，患乳腺癌和卵巢癌的风 险分别是50%～85%和15%～ 45% 。
• 根据胎儿基因组分别来自母亲的 单体型和父亲的单体型的原理， 通过对母亲血浆中的游离DNA进 行测序，就可以确定胎儿的全基 因序列。
• 如果某种变异的单体型大量存在 于母体血液中，则表明胎儿与母 体都拥有这段变异的DNA。
分子标志物的特点
• 基于诊断的分子标志物
疾病的诊断或鉴别出危险患者 • 相关病毒DNA /RNA • microRNA • 疾病基因及其产物
• 因此CYP2D6基因多态性成为评价乳腺癌 患者接受TAM治疗疗效的独立预测因素。 有助于早期确定那些无功能的或存在严 重功能损害的CYP2D6变异体,避免无效用 药。
核酸与分子标志物
1、核苷酸的连接方式： 3, 5磷酸二酯键 2、核酸的基本结构形式：多核苷酸链
末端： 5 端、 3端 多核苷酸链的方向： 5ˊ端→3ˊ端(由左至右)
3、表示方法：结构式、线条式、文字缩写
核苷酸的连接方式
2- 5’
2. 大多数真核mRNA的3´末端有一个多聚腺苷酸 (polyA)结构，称为多聚A尾。
帽子结构和多聚A尾的功能
OCH3
➢mRNA核内向胞质的转位 ➢mRNA的稳定性维系 ➢翻译起始的调控
mRNA的功能
把DNA所携带的遗传信息，按碱基互补配对
原则，抄录并传送至核糖体，用以决定其合成蛋
白质的氨基酸排列顺序。
DNA分析技术：包括传统的DNA提取、 分离和纯化，PCR扩增、限制性内切酶 和杂交分析，以及发展迅速的基因芯片 和DNA测序技术。
二 、RNA的结构与功能
Structure and Function of RNA
三联体密码
（一）RNA的组成与分类 （二） RNA的结构和功能
糖
h
* tRNA的一级结构特点 ➢ 含 10-20% 稀有碱基， 如 DHU ➢ 3´末端为 - CCA-OH ➢ 5´末端大多数为G ➢ 具有 TC
tRNA的功能：活化、搬运氨基酸到核糖体， 参与蛋白质的翻译。
2、信使RNA的结构与功能
*mRNA的成熟过程
内含子 (intron)
外显子 (exon)
hnRNA
mRNA
真核生物mRNA的结构特点
1. 大多数真核mRNA的5´末端均在转录后加上 一个7-甲基鸟苷二磷酸基，同时第一个核苷 酸 的 C´2 也 是 甲 基 化 ， 形 成 帽 子 结 构 ： m7GpppNm-。
血清生物学标志物
血清生物学标志物血清生物学标志物是指在血液中检测到的生物分子，可以用于诊断、预测和监测疾病。
这些标志物可以分为多个类别，包括蛋白质、核酸、代谢产物等。
下面将按照类别分别介绍。
蛋白质标志物蛋白质是血液中最常见的生物分子之一，因此也是最常用的标志物之一。
例如，C反应蛋白（CRP）是一种急性炎症标志物，可以用于诊断感染、炎症和心血管疾病。
另外，肝功能指标如谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）也是常用的标志物，可以用于检测肝脏疾病。
核酸标志物核酸是DNA和RNA的总称，它们在血液中的检测可以用于诊断某些疾病。
例如，人类乳头瘤病毒（HPV）的DNA可以用于筛查宫颈癌。
另外，某些癌症细胞会释放出DNA片段，这些片段可以在血液中检测到，被称为循环肿瘤DNA（ctDNA），可以用于监测癌症的进展和治疗效果。
代谢产物标志物代谢产物是指人体代谢过程中产生的化学物质，它们在血液中的浓度可以反映人体的代谢状态。
例如，血糖是一种常用的代谢产物标志物，可以用于诊断糖尿病。
另外，血清尿酸水平可以用于诊断痛风。
综合标志物有些标志物不属于以上任何一类，但它们在血液中的浓度可以反映某些疾病的状态。
例如，前列腺特异性抗原（PSA）是一种前列腺癌标志物，可以用于筛查和监测前列腺癌。
另外，D-二聚体是一种血栓标志物，可以用于诊断和监测血栓疾病。
总结血清生物学标志物是一种重要的诊断工具，可以用于诊断、预测和监测疾病。
这些标志物可以分为多个类别，包括蛋白质、核酸、代谢产物等。
在临床实践中，医生需要根据患者的具体情况选择合适的标志物进行检测，以达到最佳的诊断效果。
核酸与分子标志物
DNA sequencing
第一代：双脱氧核苷酸末端终止法
DNA sequencing
第二代：焦磷酸测序（Pyrosequencing）
DNA sequencing
第三代：单分子实时测序（Single Molecule Real Time Sequencing , SMRT)
单甲基化 +
+
双甲基化
–
三甲基化 +
–
乙酰化
+
+
注：“+”代表激活，“–”代表抑制
组蛋白
H3K27
H3K79
+
+
–
+
–
+/–
H4K20 +
H2BK5 +
–
DNA甲基化（DNA methylation）是指生物体在DNA甲 基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化 下 ， 以 S- 腺 苷 甲 硫 氨 酸 （ S-adenosyl methionine ， SAM）为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程
② 16S rRNA基因是存在于原核 生 物 基 因 组 上 编 码 rRNA 相 对 应的DNA序列；
③ 16S rRNA基因长度是1.5kb， 具有高度保守性区域和高度特 异性区域，特异性区域成为物 种特异的标志序列。
Tumor-derived miRNAs are detectable in plasma.
小卫星DNA（minisatellite DNA） 微卫星DNA（microsatellite DNA）
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四、循环游离核酸
1、循环游离核酸与肿瘤 2、循环游离核酸与产前诊断 3、循环microRNA与肿瘤诊断
第三节 临床分子生物学检验发展与应用
一、临床分子生物学检验与感染性疾病诊断 与治疗
二、遗传性疾病的临床分子生物学检验 三、肿瘤的临床分子生物学检验 四、临床分子生物学检验与个体化医学
人类基因组计划 （human genome project, HGP）
• 结果，仅用半年时间，于2000年4月底超额完成了3000万bp的 “工作框架图“。
• 2.确定病毒感染和病毒载量：明确感染源， 判断病情，检测疗效
• 3.病毒分析：基因型变异产生不同临床症状 • 4.细菌耐药监测和分子流行病学调查 ：随
机扩增多态性DNA；指导选择治疗方案， 控制病原菌的感染传播
二、基因变异
• 1.致病基因的分子缺陷 • 2.线粒体基因突变 • 3.肿瘤相关基因
• 1999年9月1日，在国际基因组计划第5次战略会议（伦敦）上， 争取到第3号染色体短臂上3000万bp的测序任务。首要条件之 一：中国要遵守“百慕大原则”，即HGP的精神，所有合格的 数据都应在24小时内上网。至此占世界人口20%的中国负责测 定HG中的1%序列，成为第6个参加HGP实质性工作的国家。 在30亿bp的测序上，美国承担54%。英国33%，日本7%，法 国2.8%，德国2.2%。中国要在仅有的8个月内完成相当于德国 的一半，法国的三分之一的工作量。设立的HGP中国实验室对 外称呼：“华大基因研究中心”。
• 人类基因组计划是由美国能源部和NIH(national institutes of
heath)联合做出的，1990年10开始，争取在15年内完成的目 标：鉴定人体DNA估计约8万个基因，测序构成人DNA的30 亿个碱基，贮存这些信息于databases(数据库)并发展data analysis的工具.实际包括两部分工作:一是 mapping，一是 sequencing。
不足以解释多基因病的发病机制。
病种：精神神经疾病，高血压病，糖尿病， 某些先天畸形等
发病原因：多基因，多因素共同作用
多基因表型：身高
先天性巨结肠
2.线粒体基因突变
• 线粒体DNA突变使线粒体功能发生障碍，直接影 响人体组织和细胞的各种生物学功能，导致线粒 体 遗传病。
• 它具有母系遗传、基因突变具有阈值效应以及多 系统受累等遗传学特征。
第二节 临床分子生物学检验靶标及 其应用
• 广义：分子标志物包括:基因组DNA、各种 RNA、蛋白质和各种代谢物
• 临床分子生物学检验靶标主要以核酸 （DNA和RNA）为主
• 基因组DNA是临床分子生物学检验中最常 用的分子靶标
一、病原生物基因
• 1.菌种鉴定：PCR测序和PCR-DNA探针杂 交;缩短检测时间
部分或整个珠蛋白α基因缺失 ：地中海贫血
Hale Waihona Puke 血友病及其基因变异临床表现：出血 发病原因：血友病甲、乙的基因缺失分别在凝血因子Ⅷ， Ⅸ基因中
杜氏营养不良
临床表现：横纹肌萎缩，腓肠肌假性肥大 发病原因：抗肌萎缩蛋白基因内部发生缺失，重复或点突 变
多基因病
• 参与多基因病发生的基因被称为疾病相关基因。 • 多基因病的发生涉及诸多因素，某一因素的变异
3.肿瘤相关基因
• 肿瘤的发生是由多种致癌因素综合作用的结果。 • 与肿瘤发生相关的基因称为肿瘤相关基因，包括癌基因
和抑癌基因。 包括病毒癌基因和细胞癌基因,它们具有潜在诱
癌基因 导细胞恶性转化的特征。
抑癌基因 是存在于正常细胞内的一 类可以抑制细胞生长的基 因，具有潜在抑癌作用。
三、基因多态性
1.基因定位和疾病相关性分析 ：将致病基因定位于 染色体相应位点，分析遗传标志与疾病的关联程 度
2.疾病诊断和遗传咨询：胎儿产前诊断；遗传疾病 风险评估
3.多基因病的研究：检测基因多态性，了解疾病发 生机制，疾病分类等
4.器官移植配型和个体识别：器官移植前HLA配型 等
DNA指纹用于罪犯识别
DNA指纹用于亲子鉴定
• 研究目的：阐明各种生命现象的本质 • 研究技术：克隆、扩增、测序、
杂交、电泳等
分子生物学的诞生与发展 是整个自然科学的大事
分子生物学理论与技术的结合，使人们对疾 病从现象的描述深入到了从分子水平的认识。
临床分子生物学：是利用分子生物学理论与技术从基因组、
转录组、蛋白质组、代谢组等水平研究疾病的发生发展机制、疾 病的预测与风险评价、疾病的临床诊断与治疗，以及疾病的预防 与控制。
• 中国：重点是研究我们特有的致病基因的图谱和定序 。
人类基因组计划的启动
• 美国于1990年10月启动“人类基因组计划” • 欧洲、日本、韩国、俄罗斯、澳大利亚和中国相继加入人
类基因组计划的研究行列
• 中国于1994年启动中国人类基因组计划 • 最初的经费来源:
国家自然科学基金委员会 “863”高科技计划 • 最初的研究项目: 中华民族基因组中若干位点基因结构的研究 重大疾病相关基因定位、克隆、结构与功能研究
1.致病基因的分子缺陷
单基因病
1.致病基因结构发生了改变，影响了编码产物量和质 的改变，如血红蛋白病、血友病、Duchenne肌营 养不良等。
2.致病基因中核苷酸三联体重复序列发生高度扩展， 如脆性X综合征、亨廷顿病、强直性肌营养不良等。
血红蛋白疾病及其基因变异
临床表现：贫血 发病原因：单一氨基酸变异：镰刀型红细胞贫血
临床分子生物学检验：是分子生物学技术在临床检验诊断应用中 发展起来的，以疾病为中心，以生物分子标志物为靶标的新一代 临床检验诊断技术，是临床分子生物学的重要组成部分。
四个阶段：
• 一、以导致遗传病的基因突变位点为靶标，以 DNA分子杂交为核心
• 二、以PCR技术为核心 • 三、以生物芯片为核心 • 四、以DNA测序技术为核心
第一章 核酸与分子标志物
临床分子生物学检验
专业培养目标
培养学生具有扎实的 分子生物学理论基础
（1）掌握本学科的基础理论和基本技能
（2）了解本学科的前沿领域和发展趋势
考试 考试－多途径考核
实
考
验
试
成
成
绩
绩
40%
60%
第一节 临床分子生物学检验的定义 及其发展
• 研究对象：生物大分子(核酸、蛋白质)的结 构、功能和生物合成等